呂 鑫，顧志榮，張 銳，葛 斌

（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省人民醫(yī)院藥劑科，甘肅 蘭州 730000）

鎖陽是鎖陽科植物鎖陽（Cynomorium songaricum Rupr.）的干燥肉質(zhì)莖，分布地區(qū)以內(nèi)蒙古、甘肅河西走廊、青海、新疆等的沙漠和半沙漠區(qū)域?yàn)橹鳌ｆi陽味甘，性溫，以強(qiáng)壯作用而著名，主治陽痿滑精、腰膝痿軟、腸燥便秘等［1］?，F(xiàn)代研究證實(shí)，鎖陽含有黃酮類（如表兒茶素、兒茶素、異槲皮苷、柑桔素、柚皮苷、根皮苷、柚皮素、金合歡素-7-O-β-D-葡萄糖苷等）、多糖類、三萜類（如熊果酸、乙酰熊果酸、熊果酸丙二酸半酯、齊墩果酸丙二酸半酯、3β-丙二酸單酯、三萜皂苷等）、有機(jī)酸（如沒食子酸、原兒茶酸、十八碳烯酸、琥珀酸、棕櫚酸等）、鞣質(zhì)等多種化學(xué)成分［2］，具有提髙免疫力、抗氧化、改善性機(jī)能、益智、抗應(yīng)激、抗糖尿病、抗血小板聚集及神經(jīng)保護(hù)等多種藥理作用［3］。2020 年版《中國藥典》中，鎖陽僅有醇溶性浸出物一項(xiàng)質(zhì)控成分，沒有其他有效成分、指標(biāo)成分或有效部位的含量測定，因此其內(nèi)在質(zhì)量評價(jià)與質(zhì)量控制是目前存在的難題之一。

中藥材質(zhì)量是影響中醫(yī)藥現(xiàn)代化進(jìn)程的重要因素，但由于成分復(fù)雜，有效成分易受產(chǎn)地環(huán)境因素影響，加之各地栽培、采收、加工等方式不同，導(dǎo)致中藥材質(zhì)量良莠不齊，從而影響臨床療效。因此，如何科學(xué)、準(zhǔn)確、有效地評價(jià)中藥材質(zhì)量，已成為完善中藥質(zhì)量控制體系的關(guān)鍵前提［4］。而中藥質(zhì)量標(biāo)志物（Quality marker，Q-marker）的提出，一方面反映了中藥的安全性和有效性，另一方面對于建立、健全中藥全程質(zhì)量控制及質(zhì)量溯源體系具有指導(dǎo)作用［5］。中藥指紋圖譜可較為全面反映中藥中復(fù)雜成分及含量分布信息，具有整體性、系統(tǒng)性和模糊性等特點(diǎn)，可對中藥質(zhì)量進(jìn)行整體描述和綜合評價(jià)［6-7］。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)打破了以往中醫(yī)藥分子機(jī)制不明確的瓶頸，與中醫(yī)的核心思想“整體觀念、辨證論治”相契合，能對多成分、多靶點(diǎn)、多通路進(jìn)行整合，適用于藥物潛在生物活性的研究［8］。本文通過建立鎖 陽 的（High performance liquid chromatography，HPLC）指紋圖譜，建立正交偏最小二乘（Orthogonal partral least squares，OPLS）模型探討HPLC 指紋圖譜上的質(zhì)量差異性成分；再采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)篩選其廣泛的靶點(diǎn)和網(wǎng)絡(luò)通路，優(yōu)化所得質(zhì)量差異性成分，兩者相互佐證，預(yù)測鎖陽潛在的Q-marker，為鎖陽的質(zhì)量控制、藥效評價(jià)及作用機(jī)制研究提供參考。

1 儀器與材料

島津LC-16 型高效液相色譜儀（島津儀器有限公司），AL204型萬分之一電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司），DHG-9140A電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

20 批鎖陽樣品，采集（購）于甘肅、內(nèi)蒙古、新疆、青海、寧夏等5 個(gè)?。ㄗ灾螀^(qū)），經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室李碩副教授鑒定為C.songaricum Rupr. 的干燥肉質(zhì)莖。將樣品晾干，粉碎，過80 目篩。對照品沒食子酸（批號：CHB171107，含量≥98%）、原兒茶酸（批號：CHB170822，含量≥98%）、兒茶素（批號：CHB170313，含量≥98%），均購自成都克洛瑪生物科技有限公司。甲醇、甲酸為色譜純（天津市大茂化學(xué)試劑廠），其他試劑均為分析純（天津大茂化學(xué)試劑廠），水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：WondaSil C18-WR 柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），流動相：甲醇-0.1%甲酸水溶液（9∶91），體積流量：0.8 mL/min，等度洗脫，柱溫：30℃，檢測波長：258 nm，進(jìn)樣體積：10 μL。

2.2 混合對照品溶液的制備

精密稱取沒食子酸、兒茶素、原兒茶酸的對照品適量，加甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度分別為0.11、0.01、0.40 mg/mL的混合對照品溶液，備用。

2.3 供試品溶液制備

取鎖陽粉末約2.0 g，加入純化水10 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取60 min（功率500 W，頻率40 kHz，溫度20℃），放冷，再次稱重，用純化水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，以4000 r/min 離心10 min，取上清液，過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4 HPLC指紋圖譜建立

2.4.1 精密度試驗(yàn)

取供試液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6針，記錄色譜圖。以12 號峰為參比峰，得到16 個(gè)共有峰相對保留時(shí)間的RSD 在0.2% ～2.0%之間，相對峰面積的RSD 在0.1% ～2.4%之間，表明儀器精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一供試品6 份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。以12 號峰為參比峰，得16 個(gè)共有峰相對保留時(shí)間的RSD 在0.1% ～2.0%之間，相對峰面積的RSD在0.1%～2.8%之間，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取樣品供試液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別在0、2、4、8、12、16、20、24 h 進(jìn)樣，記錄色譜圖。以12號峰為參比峰，得16 個(gè)共有峰相對保留時(shí)間的RSD在0 ～2.0%之間，相對峰面積的RSD 在0 ～2.8%之間，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.4 指紋圖譜建立

從LabSolutions 化學(xué)工作站中導(dǎo)出二維色譜原始數(shù)據(jù)，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)”（2012A 版）對指紋圖譜進(jìn)行分析，分別進(jìn)行多點(diǎn)校正和色譜峰匹配，生成HPLC 指紋圖譜，采用平均數(shù)法生成對照圖譜（R）。見圖1。

圖1 20批鎖陽指紋圖譜及對照圖譜（R）Fig. 1 Fingerprint and control chromatogram（R）of 20 batches of C. songaricum

2.4.5 相似度評價(jià)

以R 作為參照圖譜，采用“夾角余弦法”計(jì)算相似度（S），見表1。20 批鎖陽的相似度均在0.908 ～0.997 之間，表明20 批鎖陽藥材具有較好的質(zhì)量均一性。

表1 鎖陽指紋圖譜相似度Table 1 Similarity of fingerprint of C. songaricum

2.4.6 共有峰指認(rèn)

對照圖譜（R）中共指認(rèn)出了16 個(gè)共有峰，通過比對紫外吸收圖及混合對照品色譜圖，確定了沒食子酸（1 號峰，t= 4.193 min）、原兒茶酸（6 號峰，t=7.744 min）、兒茶素（14 號峰，t= 17.063 min）共3 個(gè)成分。共有模式上12號峰與相鄰峰的分離度好、峰面積大、且較穩(wěn)定，故作為參比峰，以此得16個(gè)共有峰相對保留時(shí)間的RSD在0.1%～2.2%之間。

圖2 混合對照品溶液（C）和鎖陽HPLC指紋圖譜的共有模式（R）色譜圖Fig. 2 HPLC chromatograms of the mixed solution of reference substances（C）and common patterns of fingerprints（R）

2.5 OPLS分析

對20 批鎖陽HPLC 指紋圖譜上16 個(gè)共有峰的峰面積進(jìn)行“歸一化”處理，以歸一化數(shù)據(jù)為變量，采用SIMCA-P 14.1 軟件進(jìn)行OPLS 分析及載荷分析。OPLS 載荷圖見圖3、VIP 分析見圖4。OPLS 模型的主成分回歸系數(shù)Q2Y= 0.7204＞0.5，R2Y=0.802 2，表明所建模型的擬合度較好，能夠解釋指紋圖譜數(shù)據(jù)80.22%的信息。載荷分析是分析變量對整體數(shù)據(jù)貢獻(xiàn)（重要性）的分析方法，載荷圖中距離原點(diǎn)越遠(yuǎn)，表示該變量的權(quán)重越大，對于整體數(shù)據(jù)的貢獻(xiàn)越大，即該色譜峰所代表的化學(xué)成分在決定樣品質(zhì)量差異中的作用越大。由圖3-4 可知，峰1、6、11、14、16 距離原點(diǎn)較遠(yuǎn)，變量重要性投影值（VIP）＞1，對于整體數(shù)據(jù)的貢獻(xiàn)較大，因此是鎖陽的質(zhì)量差異性成分，是鎖陽綜合質(zhì)量控制與評價(jià)的備選成分。

圖3 16個(gè)共有峰的載荷圖Fig. 3 Loading plots of 16 common peaks

2.6 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

2.6.1 候選化合物靶點(diǎn)預(yù)測

檢索TCMSP、PubChem Compound、TTD、Swiss Target Prediction、NCBI、CTD、BATMAN-TCM、Sym-Map 數(shù)據(jù)庫中沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素3 個(gè)候選化合物的作用靶點(diǎn)，在Uniprot數(shù)據(jù)庫中將得到的靶點(diǎn)蛋白信息進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，將篩選出的靶點(diǎn)蛋白合并、去重，最終得到與3 個(gè)化合物相關(guān)的322 個(gè)靶點(diǎn)蛋白。

2.6.2 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將篩選出的322 個(gè)靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 11.0 在線數(shù)據(jù)庫平臺進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析，選擇物種為人類，設(shè)置高可信度＞0.99，將網(wǎng)絡(luò)中無聯(lián)系的節(jié)點(diǎn)隱去，剩余參數(shù)保持不變，獲得核心靶點(diǎn)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖（圖5），結(jié)果共獲得133 個(gè)節(jié)點(diǎn)，192 條邊。將STRING 數(shù)據(jù)庫得到的結(jié)果以TSV 文本格式導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，利用工具欄中“Network Analyzer”功能對PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵傩苑治?，以“度值”（Degree）為主要條件，“介數(shù)中心性”（Betweenness centrality）和“接近中心性”（Closeness centrality）為次要條件，篩選得到13個(gè)核心靶點(diǎn)，結(jié)果見表3。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，這13個(gè)靶點(diǎn)與沒食子酸、原兒茶酸、兒茶素3個(gè)成分有關(guān)。

表2 候選化合物基本信息Table 2 Basic information about candidate compounds

表3 靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵W(xué)性質(zhì)Table 3 Topological properties of target networks

2.6.3 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

利用R 語言軟件ClusterProfiler 信息包進(jìn)行GO富集分析，選取標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05。結(jié)果表明，鎖陽的分子功能調(diào)控包括泛素蛋白連接酶結(jié)合、RNA 聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活因子活性，RNA 聚合酶Ⅱ特異性等54 個(gè)生物過程；同法進(jìn)行KEGG 通路富集分析，選取標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05，得到117個(gè)信號通路。與本研究關(guān)系較大的結(jié)果包括乙型肝炎通路、EB 病毒感染通路、人類T 細(xì)胞白血病病毒1 感染通路、麻疹通路、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染通路、病毒致癌作用通路、細(xì)胞凋亡通路等，以上篩選得到的通路主要涉抗炎、抗病毒、抗腫瘤等。進(jìn)一步對前20 條結(jié)果做可視化處理（圖5），結(jié)果顯示鎖陽可通過調(diào)節(jié)多個(gè)生物過程及通路的協(xié)調(diào)參與增強(qiáng)免疫、清除自由基、抗氧化、抗疲勞等過程。

圖5 核心靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)Fig. 5 PPI network diagram of core targets

表4 基因生物學(xué)過程及通路富集分析Table 4 Gene biological process and pathway enrichment analysis

2.6.4 “成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

以13 個(gè)核心靶點(diǎn)相關(guān)的3 個(gè)成分、11 條通路為節(jié)點(diǎn)，在Excel 中建立彼此的對應(yīng)關(guān)系及各自屬性，將表格分別導(dǎo)入到Cytoscape 3.7.2 軟件中進(jìn)行可視化展示，構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路”關(guān)系網(wǎng)絡(luò)（圖6），其中所選形狀面積越大代表通路或基因在網(wǎng)絡(luò)中作用越顯著。結(jié)果表明，鎖陽是通過多靶點(diǎn)、多途徑發(fā)揮協(xié)同作用的。在Cytoscape 3.7.2 軟件中“Tools”模塊下選擇“Network Analysis”功能對整個(gè)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析，將所得文件導(dǎo)出至Excel，以化合物、靶點(diǎn)蛋白、信號通路的連接度（degree）為參考，結(jié)果表明化合物沒食子酸（degree=11）有較高的連接度，且遠(yuǎn)高于其他2 個(gè)化合物，表明沒食子酸可能是鎖陽的重要活性成分。RELA（degree = 13）、TP53（degree =11）、AKT1（degree = 11）、CASP8（degree = 10）、CDKN1A（degree ＝10）的連接度大于等于10，高于其他靶點(diǎn)，表明這5 個(gè)靶點(diǎn)發(fā)揮的作用可能更關(guān)鍵。乙型肝炎通路（degree = 12）、EB 病毒感染通路（degree = 11）、人類T 細(xì)胞白血病病毒1 感染通路（degree= 11）、麻疹通路（degree= 9）、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染通路（degree=9）、病毒致癌作用通路（degree=9）、人類乳頭瘤病毒感染通路（degree=9）的連接度高于其他通路，表明這7 條通路可能是鎖陽潛在Q-marker的重要信號通路。

圖6 關(guān)鍵靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析Fig. 6 Enrichment analysis of key targets in KEGG pathway

圖7 “成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)Fig. 7 Network diagram of Component-Target-Pathway

3 討論

Q-marker 的概念是由劉昌孝院士在2016 年提出的，主要以中藥安全性及有效性的標(biāo)示性物質(zhì)進(jìn)行中藥質(zhì)量控制［9］。本研究首先建立鎖陽藥材的HPLC 指紋圖譜，然后建立OPLS 模型篩選質(zhì)量差異性成分，再聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)進(jìn)一步確定鎖陽的Q-marker，最終發(fā)現(xiàn)沒食子酸是備選的鎖陽質(zhì)量控制與評價(jià)的特異性成分。據(jù)報(bào)道，沒食子酸具有抗菌［10］、神經(jīng)保護(hù)［11］、抗氧化、基因保護(hù)及肝臟保護(hù)等作用［12］，能夠同時(shí)提高α-和降低β-分泌酶活性、抑制神經(jīng)炎癥和穩(wěn)定大腦氧化應(yīng)激、逆轉(zhuǎn)阿爾茨海默病小鼠的認(rèn)知損害并減輕病理改變［13］。亦有研究表明，沒食子酸是一種新的免疫蛋白酶體抑制劑，可能成為治療高血壓和血管功能障礙的潛在藥物［14］。

與沒食子酸相關(guān)的5個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)，RELA是一種廣泛存在的轉(zhuǎn)錄因子，被特定的抑制劑以非活性狀態(tài)保存在細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)抑制劑降解時(shí)，RELA 移向細(xì)胞核并激活特定基因的轉(zhuǎn)錄；TP53是一個(gè)最重要的抑癌基因，該基因的異常與超過半數(shù)的腫瘤相關(guān)［15］。此外，TP53 也能起到轉(zhuǎn)錄因子之外的作用，與胞質(zhì)中的Bcl2 家族蛋白發(fā)生相互作用，使得線粒體外膜通透性增高，誘發(fā)細(xì)胞凋亡；AKT1 基因編碼的是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可通過磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）依賴的機(jī)制被胞外信號激活，發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能，異?；罨腁KT 會導(dǎo)致腫瘤發(fā)生［16］。CASP8 編碼半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）家族的一個(gè)成員，連續(xù)激活在細(xì)胞凋亡的執(zhí)行階段起著中心作用，主要參與凋亡抑制通路；CDKN1A編碼一種有效的細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制劑，在DNA合成預(yù)備期或復(fù)制前期（G1 期）起調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)展的作用。因此，與沒食子酸相關(guān)的關(guān)鍵靶點(diǎn)主要參與細(xì)胞增殖、免疫相關(guān)、炎癥相關(guān)、血管生成、凋亡抑制、能量代謝等信號通路。

鎖陽是中、蒙醫(yī)等常用的藥材，也是功能保健食品的常用原料，具有較好的開發(fā)應(yīng)用前景，但目前市場上的鎖陽藥材質(zhì)量參差不齊。2020 年版《中國藥典》中，鎖陽僅有醇溶性浸出物一項(xiàng)質(zhì)控成分，沒有其他有效成分、指標(biāo)成分或有效部位的含量測定標(biāo)準(zhǔn)。因此，建立科學(xué)、高效、靈敏的鎖陽質(zhì)量控制方法，對于保證鎖陽藥材質(zhì)量，規(guī)范其交易流通，助力鎖陽相關(guān)產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展均有實(shí)際意義。本研究表明，沒食子酸可作為鎖陽潛在的Q-marker，這一結(jié)果為鎖陽的質(zhì)量控制、功效關(guān)聯(lián)物質(zhì)研究及作用機(jī)制研究提供了一定參考。但目前關(guān)于采用指紋圖譜與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)聯(lián)用預(yù)測中藥質(zhì)量控制指標(biāo)的研究仍存在著一定的不足，就指紋圖譜建立而言，由于藥材中某些化學(xué)成分含量較低以及色譜分離困難或前處理方法專屬性不強(qiáng)，導(dǎo)致最終建立的指紋圖譜只能反映部分成分；而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)本身依賴于數(shù)據(jù)庫挖掘，所以候選化合物靶點(diǎn)數(shù)量的多少將影響質(zhì)量標(biāo)志物的選取結(jié)果。因此，完善中藥質(zhì)量控制體系及推進(jìn)中醫(yī)藥現(xiàn)代化還需進(jìn)行大量的研究工作。