陳 鑫，李曦冉，楊姣姣

（西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

植物內(nèi)生菌是在植物生活史的部分及全部階段，存在于植物不同組織中并和宿主植物建立互惠共生的一類微生物［1］。研究發(fā)現(xiàn)，植物內(nèi)生菌能產(chǎn)生吲哚乙酸（Indole-3-acetic acid，IAA），在植物生長發(fā)育中直接促進(jìn)植物的生長［2］。近年來，不同植物內(nèi)生菌逐漸成為農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)［3］。傅本重等［4］發(fā)現(xiàn)核桃內(nèi)生細(xì)菌可以抑制病原真菌，促進(jìn)種子的萌發(fā)。陳世萍等［5］發(fā)現(xiàn)室溫水分脅迫下內(nèi)生真菌感染可以提高黑麥草超氧化物歧化酶和過氧化物酶的活性。沙棘（H.rhamnoides）廣泛分布于我國干旱與半干旱地區(qū)，其根系發(fā)達(dá)，能夠生長在環(huán)境嚴(yán)酷、不同海拔的干燥寒冷的貧瘠地區(qū)［6］，可作為水土流失嚴(yán)重、干旱貧瘠地區(qū)的先鋒樹種，改善土壤環(huán)境［7］。目前國內(nèi)對于沙棘內(nèi)生菌的研究較少，本課題組發(fā)現(xiàn)［8］沙棘除了在根瘤中存在內(nèi)生細(xì)菌，沙棘種子中也含有豐富的內(nèi)生菌資源。

蘭州地處甘肅省中部，由于受到西北獨(dú)特氣候環(huán)境等影響，蘭州北山植被覆蓋率較低。蘭州北山植物綠化主要靠人工栽植［9］，植物種子繁殖因受到土壤等環(huán)境的限制，萌發(fā)率較低，植株幼苗的生長繁殖也受到一定限制。本實(shí)驗(yàn)選取北山具有綠化價(jià)值的喬木、闊葉類灌木和藤本、草本四類植物種子［10］，共13 種作為實(shí)驗(yàn)材料，通過沙棘種子中篩選出產(chǎn)IAA 能力強(qiáng)的內(nèi)生菌，深入研究沙棘種子內(nèi)生菌的促生能力，探究其對甘肅蘭州北山常見的植物種子萌發(fā)的影響，促進(jìn)其種子繁殖，以期為蘭州北山綠化提供一定參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌株

供試的17 株沙棘種子內(nèi)生細(xì)菌由張愛梅等采用純培養(yǎng)法分離自甘肅省榆中縣馬銜山的野生中國沙棘種子樣品中，于4℃甘油管中保存。純化后菌株編號分別為H1B01、F2B04、G2B03、D2B03、J2B04、G2B05、D2B12、D1B01、F3B01、J3B02、F2B01、A1B08、H3B05、H2B03、G3B06、J2B05、J3B10。

1.1.2 供試種子

供試植物種子共13 種，分別是角茴香（H.erectum）、細(xì)葉韭（A.tenuissimum）、寧夏枸杞（L.barbarum）、鵝絨藤（C.chinenese）、曼陀羅（D.stramonium）、灌木鐵線蓮（C.fruticosa）、波斯菊（C. bipinnata）、五葉地錦（P.quinquefolia）、牽?；ǎ≒.nil）、臭椿（A. altissima）、刺槐（R.pseudoacacia）、側(cè)柏（P.orientalis）、沙棗（E.angustifolia），以上材料均以五點(diǎn)取樣法采樣于蘭州北山西北師范大學(xué)新校區(qū)北山段。試驗(yàn)前將各植物種子置于室溫通風(fēng)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 培養(yǎng)基

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 沙棘種子內(nèi)生細(xì)菌產(chǎn)IAA菌株的篩選

采用Salkowski 比色法［11］測定沙棘種子內(nèi)生細(xì)菌IAA的產(chǎn)量。

（1）定性測定：將沙棘種子內(nèi)生細(xì)菌接種到150 mL的三角瓶中。在37℃200 r·min-1的條件下，恒溫震蕩培養(yǎng)1 d 之后以1%接種量接種到含有500 mg·L-1色氨酸的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，以無菌水為對照組，37℃180 r·min-1恒溫震蕩培養(yǎng)3 d。最后，將發(fā)酵液7000 r·min-1離心5 min，取50uL 上清液于白瓷板中，向其加入100uL 的IAA 顯色劑，兩者充分混合，置于黑暗條件下避光反應(yīng)30 min，觀察其顏色變化。如出現(xiàn)粉紅色，則說明菌株呈陽性，有IAA產(chǎn)生。

（2）定量測定：取2 mL 陽性菌株上清液于試管中，向其加入4 mL 的IAA 顯色劑，每組3 個(gè)重復(fù)，黑暗條件下避光反應(yīng)30 min，測定其在530nm 的吸光值，以無菌水為對照組。以純IAA 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線測定各菌株IAA的產(chǎn)量［12］。

（3）IAA 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制［11］：以純吲哚乙酸，分別配置0.5 、1.0 、1.5 、2.0、2.5 mg·L-1的吲哚乙酸溶液，在530 nm 處分別測定其吸光值。以IAA 標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，530nm 吸光值（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到IAA 標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=0.036 4x+0.040 1，相關(guān)系數(shù)為R2=0.999 0。

1.2.2 內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵液的制備

將菌株接種到三角瓶中，37℃200 r·min-1恒溫震蕩培養(yǎng)24 h 之后以1%接種量接種到含有色氨酸的牛肉膏蛋白液體培養(yǎng)基中，使色氨酸的濃度為500 mg·L-1，37℃180 r·min-1恒 溫 震 蕩 培 養(yǎng)36 h備用。

以開放化、平臺化的思想進(jìn)行系統(tǒng)的功能和架構(gòu)設(shè)計(jì)，通過統(tǒng)一的訪問接口，以RDF等標(biāo)準(zhǔn)的數(shù)據(jù)描述格式，將圖書館的館藏資源和信息檢索服務(wù)對外開放，方便讀者對圖書館館藏資源的深度利用。同時(shí)，平臺化的設(shè)計(jì)思想也為以資源開發(fā)和利用為主要目標(biāo)的第三代圖書館服務(wù)平臺的建設(shè)提供了更加靈活的架構(gòu)。

1.2.3 種子預(yù)處理

將曼陀羅、刺槐、沙棗、角茴香、細(xì)葉韭、五葉地錦和臭椿［13］七種種皮較厚的種子用50℃的溫水浸泡24 h，然后用自來水將13 種種子沖洗干凈備用。加入75%的乙醇浸泡1 min，無菌水沖洗3～4 次，再加入1%NaClO 浸泡5 min，無菌水沖洗3～4次，對各植物種子進(jìn)行表面消毒。最后從每類植物中分別選取大小均一、飽滿的種子，置于無菌水中浸種24 h。

1.2.4 內(nèi)生細(xì)菌對植物種子萌發(fā)的影響

所有種子于超凈臺上進(jìn)行種皮表面自然風(fēng)干后，置于墊有雙層濕潤濾紙的無菌培養(yǎng)皿中。每皿10 粒，每個(gè)處理做三次重復(fù)。該試驗(yàn)分為兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對照組，即①無菌對照組，②含菌發(fā)酵液處理組，③發(fā)酵液的上清液處理組。①②③組均用無菌水浸種24 h，萌發(fā)過程中，對照組①補(bǔ)充無菌水，試驗(yàn)組②補(bǔ)充含菌的發(fā)酵液，實(shí)驗(yàn)組③補(bǔ)充發(fā)酵液上清液。除曼陀羅種子進(jìn)行全黑暗條件處理［14］外，其他12 種植物種子每天光照12 h。臭椿、灌木鐵線蓮、沙棗種子于15℃恒溫培養(yǎng)15 d［15］，其余10 種種子25℃下恒溫培養(yǎng)15 d，每天定時(shí)記錄各組試驗(yàn)的發(fā)芽情況。萌發(fā)指標(biāo)以種子吐白為準(zhǔn)，測定其發(fā)芽率、發(fā)芽勢［16］，計(jì)算公式如下：

發(fā)芽率（%）=第15 天發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù)×100%

發(fā)芽勢（%）=第4 天種子的發(fā)芽率/供試種子總數(shù)×100%

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用SPSS21.0 對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Origin7.5進(jìn)行制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 沙棘種子內(nèi)生細(xì)菌產(chǎn)IAA內(nèi)生菌的篩選

通過Salkowski 比色法對分泌IAA 的沙棘種子內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行篩選。在定性測定中，17 株內(nèi)生細(xì)菌產(chǎn)IAA 的顯色反應(yīng)如圖1 所示，其中6 株菌呈陽性，分別是菌株H2B03、A1B08、H3B05、F2B01、F3B01、D2B12，菌株H2B03顯色反應(yīng)最為明顯。

圖1 17株供試菌的顯色反應(yīng)Fig.1 Chromogenic reaction of 17 tested strains

通過定性測定篩選出6 株陽性菌，對其進(jìn)行產(chǎn)IAA 的定量測定。結(jié)果顯示，顯色反應(yīng)最為明顯的菌株H2B03，其IAA 產(chǎn)量最高，為22.15 μg·mL-1（表1），此時(shí)的菌液濃度為1.56×109CFU·mL-1。菌株H3B05 的IAA 產(chǎn)量最低，為1.52 μg·mL-1，其余4 株菌IAA產(chǎn)量均低于4.00 μg·mL-1。因此，在后續(xù)的試驗(yàn)中，選取菌株H2B03進(jìn)行種子萌發(fā)試驗(yàn)。

表1 6株供試菌產(chǎn)IAA量Table 1 IAA yield of 6 tested strains

2.2 種子萌發(fā)試驗(yàn)

2.2.1 兩種處理下不同植物種子的萌發(fā)狀況

采用IAA 產(chǎn)量最高的菌株H2B03 分別對13 種植物種子進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn)，通過H2B03 上清液處理和發(fā)酵液處理，試驗(yàn)結(jié)果如圖2 所示。13 種植物種子具有普遍發(fā)芽率較低的情況，其中臭椿、灌木鐵線蓮、角茴香、沙棗和曼陀羅5種植物種子在萌發(fā)試驗(yàn)中不發(fā)芽；除細(xì)葉韭、五葉地錦種子外，寧夏枸杞、側(cè)柏、鵝絨藤、波斯菊、刺槐和牽?；? 種種子的萌發(fā)指標(biāo)在兩種處理下相對于無菌對照組均有降低的趨勢。可見，菌株H2B03 對寧夏枸杞、鵝絨藤、波斯菊、刺槐、牽?；? 種種子的萌發(fā)具有抑制作用，但對細(xì)葉韭、五葉地錦有一定的促進(jìn)作用。

2.2.2 兩種處理對同一種植物種子萌發(fā)的影響

用菌株H2B03 分別對13 種植物種子進(jìn)行上清液處理和發(fā)酵液處理，測定H2B03 的兩種處理對同一種子萌發(fā)的影響（表2）。不同植物種子的萌發(fā)因?qū)Σ煌奶幚砻舾行圆煌?。臭椿、灌木鐵線蓮、角茴香、沙棗和曼陀羅在各處理下均不發(fā)芽；上清液處理中：側(cè)柏的發(fā)芽率（20.5%）、發(fā)芽勢（19.6%）明顯低于對照組的發(fā)芽率（72.1%）、發(fā)芽勢（41.6%）P＜0.05，細(xì)葉韭發(fā)芽率相比于對照組提高了31.3%，五葉地錦的發(fā)芽率相比于對照組提高了9.5%；發(fā)酵液處理中：只有細(xì)葉韭種子萌發(fā)，其發(fā)芽率、發(fā)芽勢分別為21.2%、20.0%，均低于上清液處理的發(fā)芽率（31.3%）、發(fā)芽勢（30.1%）。

2.2.3 同一處理對不同植物種子萌發(fā)的影響

從表2 可以看出，通過菌株H2B03 對13 種植物種子分別進(jìn)行上清液處理和發(fā)酵液處理，同一種處理下不同種子間的萌發(fā)狀況有很大的差異（P＜0.05）。在上清液處理下，只有細(xì)葉韭、側(cè)柏、五葉地錦種子有發(fā)芽的趨勢，發(fā)芽率分別為31.3%、20.5%、9.5%；在發(fā)酵液處理下，除細(xì)葉韭外，寧夏枸杞、側(cè)柏、鵝絨藤、波斯菊、刺槐、牽?；ê臀迦~地錦種子無萌發(fā)的跡象。其中細(xì)葉韭種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢分別為21.2%、20.0%。

3 討論

本試驗(yàn)從17 株沙棘種子內(nèi)生細(xì)菌中篩選到6株產(chǎn)IAA 的菌株，各菌株IAA 的分泌量為1.52～22.15 μg·mL-1，其分泌量最高的菌株是H2B03。不同植物的內(nèi)生細(xì)菌分泌IAA 的量有一定的差異，丁森等［17］從櫻花體內(nèi)分離到一株瓦雷茲芽孢桿菌，其在第七天IAA 的生成量為9.174 μg·mL-1；而劉琳等［18］從春蘭根組織中獲得57 株分泌IAA 內(nèi)生細(xì)菌，其IAA 分泌量為0.50～129.68 μg·mL-1。采用菌株H2B03的發(fā)酵上清液處理和含菌發(fā)酵液對采摘于蘭州北山的種子進(jìn)行萌發(fā)試驗(yàn)。結(jié)果表明，臭椿、灌木鐵線蓮、角茴香、沙棗和曼陀羅種子在兩種處理下均不發(fā)芽。原因可能與四方面因素有關(guān)，第一，這幾種植物種皮較厚，透水透氣性低，且角茴香、曼陀羅種子表面存在蠟狀膠質(zhì)，不利于種子吸收水分［19］；第二，也可能是因?yàn)檫@幾種植物種子萌發(fā)周期較長，需適當(dāng)延長其萌發(fā)時(shí)間；第三，這幾種植物種子沒有經(jīng)過自然界冬季的低溫處理，其發(fā)芽率降低。研究發(fā)現(xiàn)，冬季過低的氣溫以及較大的溫度變幅（-26℃～10℃）可以使部分種子萌發(fā)率升高［20］；第四，種子休眠未被打破。Baskin 將種子休眠分為生理休眠等5種類型，針對不同類型的休眠，其打破休眠的方式各有不同［21］。本試驗(yàn)為了控制變量，針對種皮較厚的種子統(tǒng)一使用了物理方式（50℃溫水浸泡24 h）處理，這可能也是種子不萌發(fā)的原因之一。

IAA 作為一種植物生長激素，對不同植物種子的萌發(fā)及生長均有最適處理范圍，濃度過低促進(jìn)作用不明顯，濃度過高則表現(xiàn)為抑制生長［22］。本文中分離自沙棘種子的內(nèi)生菌產(chǎn)生的IAA的濃度不利于寧夏枸杞等6 種植物種子的萌發(fā)，且菌株H2B03 發(fā)酵液中，可能含有的代謝產(chǎn)物也會抑制種子的萌發(fā)。有研究發(fā)現(xiàn)，木麻黃林地特有細(xì)菌代謝產(chǎn)物對青皮、紅厚殼和楊葉肖槿種子萌發(fā)均有抑制作用［23］。此外代謝產(chǎn)物的濃度也可能是抑制種子萌發(fā)的原因之一，蔣先軍等［24］研究表明，細(xì)菌代謝產(chǎn)物對植物生長的刺激作用與濃度有關(guān)，如高濃度的硅酸鹽細(xì)菌代謝產(chǎn)物對植物生長有一定的抑制作用，且對根系生長的影響尤為明顯。

本試驗(yàn)中，H2B03 上清液處理對細(xì)葉韭和五葉地錦種子的萌發(fā)有一定的促進(jìn)作用。其中細(xì)葉韭種子的萌發(fā)率（31.3%）顯著高于對照組（P＜0.05），五葉地錦相比于對照組發(fā)芽率提高到了9.5%。有研究發(fā)現(xiàn)，剛采收的內(nèi)蒙古地區(qū)野生細(xì)葉韭植物種子的萌發(fā)率極低，存在自然休眠期，最高萌發(fā)率只有25.5%，貯藏7 個(gè)月后在適合的萌發(fā)條件下，其萌發(fā)率能達(dá)到98.0%［25］。本試驗(yàn)采集的細(xì)葉韭在室溫下只儲存了2個(gè)月，萌發(fā)率達(dá)到31.3%，可見，H2B03發(fā)酵液的上清液處理有利于打破細(xì)葉韭種子休眠。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，如采用菌液H2B03 對細(xì)葉韭和五葉地錦種子進(jìn)行處理，將會促進(jìn)細(xì)葉韭和五葉地錦兩種植物種子的萌發(fā)，促進(jìn)種子繁殖，有利于蘭州城市綠化。