劉烈花，龔杰，皮靜，董鵬，況覓，李姍蓉，袁國明，丁偉

1.西南大學(xué) 植物保護學(xué)院， 重慶 400715； 2.重慶市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站， 重慶 401121；3.重慶安邦農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司， 重慶 400030

蕓薹根腫病菌(PlasmodiophorabrassicaeWoronin)是原生動物界專性寄生菌， 最早于1737年在英國地中海西岸和歐洲南部發(fā)現(xiàn)， 其引起的十字花科根腫病造成全世界十字花科作物損失慘重， 目前已迅速蔓延至我國四川、 貴州、 云南等油菜產(chǎn)區(qū)， 并對榨菜、 甘藍、 白菜、 蘿卜等十字花科作物造成傷害． 近年來， 我國十字花科根腫病的發(fā)生面積逐年擴大， 危害程度逐年加重， 嚴重制約著十字花科作物產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[1-3]． 根腫病的休眠孢子在土壤中具有極強的生命力， 存活20年仍能保持侵染活性[4]； 休眠孢子經(jīng)十字花科植物的根際分泌物刺激萌發(fā)后侵染其根毛和皮層組織， 侵染率高， 造成根部組織膨大[5]； 休眠孢子可通過流水、 昆蟲、 農(nóng)事操作等多種途徑進行傳播， 防治難度較高． 目前國內(nèi)外對根腫病的研究非常重視， 但進展緩慢， 其防治技術(shù)主要采取抗病品種篩選、 藥劑防治和農(nóng)事管理等措施， 防治效果均不夠理想， 特別是藥劑防治的弊端日漸突出[6-7]． 已有研究表明， 根腫病的休眠孢子與寄主植物根際微生物群落具有潛在的相互關(guān)系． 經(jīng)驗證土壤中存在多種有益菌， 能顯著抑制根腫病菌， 例如枯草芽孢桿菌XF-1(Bacillussubtilis)[8-9]， 木霉菌(Trichodermaspp.)[10-11]， 鏈霉菌(Streptomycesplatensis)[12-13]， 溶桿菌(Lysobacter)[14]等． 因此， 通過根際微生物群體控制土傳病害， 即構(gòu)建植物生物屏障體系來抵御病原物入侵的研究越來越受到重視[13，15]．

土壤微生物群落是影響植物健康生長的重要因素， 合理的群落結(jié)構(gòu)有助于植物對土壤中養(yǎng)分的吸收， 增強其對非生物脅迫的耐受性， 并保護宿主植物免受病原體的侵染[11，16]． 因此構(gòu)建一個合理的根際微生物群落在植物和病原物的相互作用中將發(fā)揮至關(guān)重要的作用， 同時也為生物屏障的構(gòu)建打下基礎(chǔ)[17-18]． 植物構(gòu)建生物屏障的作用機理主要包括： ①微生物互作過程中所產(chǎn)生的化合物對病原物的殺菌活性； ②與病原物在空間、 資源上的競爭作用； ③增強植物免疫反應(yīng)， 更好地抵御病原物的入侵[19-20]． 近年來構(gòu)建植物根際生物屏障防治各種土傳病害已逐漸成為研究的熱點[21]． 已有研究表明， 通過綜合農(nóng)業(yè)措施來調(diào)控植物根際土壤微生物的組成能有效抑制煙草青枯病[22-23]、 煙草黑脛病[24]、 棉花枯萎病[25]、 香蕉枯萎病[26]等土傳病害的發(fā)生； 對甘藍根腫病而言， 健康的根際土壤微生物群落組成隨時間的變化而變化， 而根腫病的入侵也改變了根際土壤中微生物的群落結(jié)構(gòu)[27]． 還有研究表明， 大白菜根腫病發(fā)病的根際土壤與健康的根際土壤在微生物群落結(jié)構(gòu)和組成上顯著不同， 并強調(diào)了根際微生態(tài)機制在防控根腫病中的重要作用[28]．

為了進一步揭示榨菜根腫病發(fā)病植株(以下簡稱為病株)和健康植株(以下簡稱為健株)根際土壤微生物的群落特征， 本研究在重慶市涪陵區(qū)常年連作的榨菜種植區(qū)， 采集根腫病發(fā)生嚴重的病株和健株的根際土壤， 通過對細菌16S rDNA和真菌ITS的高通量測序， 分析病株和健株根際土壤中細菌和真菌的群落結(jié)構(gòu)組成差異和互作關(guān)系特征， 揭示根際土壤微生物群落在維護植物健康中所發(fā)揮的重要作用． 本研究結(jié)果對于深入理解根腫病發(fā)生的根際微生態(tài)機制以及研發(fā)其綜合防控技術(shù)具有重要意義．

1 材料與方法

1.1 樣品采集

采樣地位于重慶市涪陵區(qū)， 該區(qū)屬中亞熱帶濕潤季風氣候區(qū)． 采樣地塊較為平整， 榨菜種植密度： 行距120 cm， 株距55～60 cm， 每667 m2平均種4 600株； 榨菜連作10年以上， 且根腫病高發(fā)． 在涪陵區(qū)榨菜根腫病發(fā)生嚴重的5個鄉(xiāng)鎮(zhèn)(江北街道、 南沱鎮(zhèn)、 清溪鎮(zhèn)、 珍溪鎮(zhèn)、 百勝鎮(zhèn))， 共設(shè)置10個采樣基點， 每個基點選擇3塊地， 每塊地采用5點取樣法采集病株根際土壤， 混合均勻作為1個樣品， 同時采用5點取樣法采集健株根際土壤， 混合均勻作為1個樣品， 得到病株和健株根際土壤各30個樣品． 病株和健株根際土壤的采集方法： 將植物連根拔起， 稍加抖動后取附著在根部上的土壤放入自封袋中， 置于冰盒內(nèi)短暫冷藏保存后帶回研究室， 過2 mm篩后， 保存于-80 ℃超低溫冰箱中， 用作土壤微生物群落特征分析． 本研究對病株和健株的根際土壤進行Illumina測序分析， 并對土壤樣本進行理化性質(zhì)測定． 有文獻表明， 莖瘤芥根腫病根際土壤與健康根際土壤的pH無明顯變化． 土壤導(dǎo)電率、 有機質(zhì)、 堿解氮、 全氮含量在健株和病株根際土壤之間雖呈現(xiàn)出健株略高的趨勢， 但除土壤導(dǎo)電率含量在健株的根際土壤之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義外， 其余各土壤樣品之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義． 然而， 有效磷、 全鉀、 全磷含量卻表現(xiàn)出與土壤導(dǎo)電率(EC)、 有機質(zhì)、 堿解氮、 全氮含量不一致的變化趨勢， 首先均表現(xiàn)出莖瘤芥根腫病病株顯著低于健株的趨勢， 其中以有效磷和全鉀含量表現(xiàn)最為突出， 與健株之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義． 因此得出， 莖瘤芥根腫病的發(fā)生導(dǎo)致莖瘤芥根際土壤 pH下降， 還導(dǎo)致包括有效磷、 全磷、 全鉀養(yǎng)分含量的顯著降低[29]．

1.2 榨菜根際土壤微生物DNA提取

根據(jù)FastDNA SPIK Kit土壤試劑盒 (MP Biomedicals， Solon， OH， USA)說明書進行總DNA抽提． DNA濃度和純度利用NanoDrop 2000進行檢測， 利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量． 細菌擴增引物為515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和 806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)[28]； 真菌擴增引物為 ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和 ITS2R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)[30]． 根據(jù)各引物對可變區(qū)進行PCR擴增， 擴增程序： 95 ℃預(yù)變性3 min， 27個循環(huán)(95 ℃變性30 s， 55 ℃退火30 s， 72 ℃延伸30 s)， 最后72 ℃延伸10 min(PCR儀： ABI GeneAmp? 9700型)． 擴增體系為20 μL， 4 μL 5*FastPfu緩沖液， 2 μL 2.5 mmol/L dNTPs， 0.8 μL引物(5 μmol/L)， 0.4 μL FastPfu聚合酶； 10 ng DNA模板[31]． 使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產(chǎn)物， 利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (Axygen Biosciences， Union City， CA， USA) 進行純化， Tris-HCl洗脫， 2%瓊脂糖電泳檢測． 將純化質(zhì)量合格的PCR產(chǎn)物用于DNA文庫構(gòu)建， 采用二代測序技術(shù)(Illumina)進行微生物多樣性測序．

1.3 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析

原始Illumina fastq文件采用QIIME v1.7.0(微生物生態(tài)學(xué)定量分析)進行多路分解、 質(zhì)量過濾和分析． 操作分類單元(OTUs)的閾值為97%的成對識別． 高可信度OTUs的識別標準： 任何樣本的總體豐度大于20個讀取片段， 按最小采樣序列個數(shù)進行子采樣． 利用基于taxa的OTUs計算細菌和真菌各門的相對豐度， 比較病株和健株根際土壤中微生物的總體分布． 根據(jù)OTU數(shù)據(jù)進行Alpha多樣性和Beta多樣性分析． 微生物群落Alpha多樣性采用ACE 指數(shù)、 Chao1 指數(shù)和Shannon 指數(shù)表示， ACE 指數(shù)和Chao1 指數(shù)是用來估量樣本內(nèi)微生物的豐富度， Shannon 指數(shù)是涵蓋物種豐富度及物種個體分布均勻度兩個方面的多樣性指標． 這3個指數(shù)越高， 代表樣本內(nèi)物種豐富度和多樣性越高． 微生物群落β多樣性采用PCoA(Principal Co-ordinates Analysis)分析并基于Bray_curtis矩陣進行作圖[31]．

將每個處理中平均相對豐度大于0.2%的細菌和真菌OTU進行篩選． 按照分子生態(tài)學(xué)網(wǎng)絡(luò)分析流程(MENAP)進行在線分析(http： //ieg2.ou.edu/MENA/main.cgi)， 完成在線分析后， 利用gephi軟件進行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建．

2 結(jié)果與分析

2.1 榨菜根際土壤微生物測序深度評估

通過細菌16S rDNA和真菌ITS高通量測序分析， 60份樣品(包括30個健株和30個病株根際土壤)共獲得細菌3 347 272個有效序列讀取數(shù)和13 253個OTUs， 平均讀取長度為256 bp， 樣本抽平后， 保留29 076個讀數(shù)進行分析； 獲得真菌4 226 818個有效序列讀取數(shù)和3 767個OTUs， 平均讀取長度為224 bp， 樣本抽平后， 保留41 228個讀數(shù)進行分析． 稀疏曲線(圖1)表明， 測序數(shù)量基本合理， 其深度足以進行下游分析．

圖1 根際土壤樣本稀釋曲線

2.2 土壤微生物Alpha多樣性分析

健株和病株根際土壤測定的細菌覆蓋率分別為97.46%和96.38%， 真菌覆蓋率分別為99.65%和99.58%， 該數(shù)據(jù)足以代表根際土壤細菌的多樣性， 并反映出真實環(huán)境中土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)． 對榨菜根腫病病株和健株的根際土壤微生物群落進行Alpha多樣性分析(表1)發(fā)現(xiàn)， 無論是細菌還是真菌， 其病株的ACE 指數(shù)， Chao1 指數(shù)均高于健株， 而Shannon 指數(shù)就細菌而言并未達到統(tǒng)計學(xué)意義， 但真菌的Shannon指數(shù)健株顯著高于病株． 結(jié)果表明， 病株根際土壤微生物群落豐富度較高， 而健株根際土壤微生物群落的均勻度較高， 亦即物種數(shù)量的分布更為均勻， 尤其是微生物中的真菌更為突出．

表1 根腫病病株和健株根際土壤Alpha多樣性指數(shù)

2.3 土壤微生物群落組成分析

由圖2a可知， 從榨菜植株根際土壤中檢測出的細菌隸屬于57個門， 155個綱， 326個目， 615個科， 1 346個屬． 主要細菌門(相對豐度E≥5%)包括變形菌門(Proteobacteria)占42.65%， 放線菌門(Actinobacteria)占19.54%， 擬桿菌門(Bacteroidetes)占8.78%， 綠彎菌門(Chloroflexi)占8.18%和酸桿菌門(Acidobacteria)占5.28%． 對榨菜根腫病病株和健株根際土壤細菌進行門水平的比較(圖2b)發(fā)現(xiàn)， 健株根際土壤中放線菌門的相對豐度比病株的高出了6.36倍， 而病株根際土壤中擬桿菌門的相對豐度比健株高出了4.19倍．

由圖2c可知， 從榨菜植株根際土壤中檢測出的真菌分別隸屬于8個門， 30個綱， 99個目， 228個科， 484個屬． 主要真菌門(相對豐度E≥10%)包括子囊菌門(Ascomycota)占46.35%， 接合菌門(Zygomycota)占17.75%， 壺菌門(Chytridiomycota)占17.5%， 擔子菌門(Basidiomycota)占12.52%． 對榨菜根腫病病株和健株根際土壤真菌進行門水平的比較(圖2d)發(fā)現(xiàn)， 病株根際土壤中壺菌門的相對豐度比健株高9.99倍， 健株根際土壤中擔子菌門的相對豐度比病株高9.11倍．

*表示p<0.05， **表示p<0.01， ***表示p<0.001， 差異有統(tǒng)計學(xué)意義．

2.4 土壤微生物Beta多樣性分析

榨菜根腫病病株和健株根際土壤中細菌和真菌群落的主坐標分析(PCoA)如圖3． 細菌群落第1，2主坐標的貢獻率分別為24.92%和8.54%， 真菌群落分別為18.85%和11.26%． 由圖3看出， 無論是細菌群落還是真菌群落， 其健株根際土壤樣本主要分布在2，3象限， 且較為集中， 而病株根際土壤樣本主要分布在1，4象限， 且較為分散． 這說明各采樣點健株根際土壤的微生物群落(包括細菌和真菌)， 其結(jié)構(gòu)大體相似， 而病株根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)差異較大， 這也說明病株與健株的根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)顯著不同．

圖3 病株與健株的基于bray-curtis距離的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)分析

2.5 土壤微生物網(wǎng)絡(luò)拓撲分析

構(gòu)建基于隨機矩陣理論(RMT)網(wǎng)絡(luò)分析圖， 能闡明微生物群落中不同物種間的相互作用并尋找影響整個群落組成變化的關(guān)鍵物種． 由關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)圖可知， 健株根際土壤微生物群落網(wǎng)絡(luò)圖中各物種表現(xiàn)更為活躍， 構(gòu)成的關(guān)聯(lián)也較病株根際土壤多(圖4)． 其網(wǎng)絡(luò)拓撲參數(shù)(表2)顯示， 健株根際土壤細菌網(wǎng)絡(luò)含有40個節(jié)點、 38個邊緣， 而病株根際土壤中僅含有27個節(jié)點、 22個邊緣； 健株根際土壤真菌網(wǎng)絡(luò)含有78個節(jié)點、 171個邊緣， 而病株根際土壤中僅含有45個節(jié)點、 71個邊緣． 從連接度來看， 無論是細菌還是真菌， 健株均高于病株．

表2 病株和健株根際土壤微生物群落的系統(tǒng)發(fā)育分析生態(tài)學(xué)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)指標

每個節(jié)點代表1個OTU， 節(jié)點顏色是根據(jù)微生物所屬門進行染色的． 較大的節(jié)點表示中間中心性，線表示節(jié)點之間的相關(guān)性， 綠線和紅線分別表示正相關(guān)性和負相關(guān)性．

此外， 根據(jù)網(wǎng)絡(luò)拓撲分析還篩選出， 最大中心性排名前10的微生物物種(OTU)， 其中已被明確鑒定的細菌有Mucilaginibacter(OTU12403)和Variovorax(OTU11035)， 真菌有Penicillium(OTU378，OTU1296)和Cryptococcus(OTU2623)， 這些物種具有高度的中心性和相關(guān)性， 可能是維持微生物生態(tài)網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)定和抑制根腫病發(fā)生的關(guān)鍵性微生物．

3 討論

越來越多的研究認為植物根際土壤微生物群落是影響植物健康和抑制土傳病害的重要因素． 一般來說， 較高的微生物群落多樣性能緩沖病原物入侵的影響， 進而也改變了根際微生物群落的功能和組成[30，32]． 根際微生物群落多樣性越高， 物種越豐富， 作物抗病性就越強[33-34]． 本研究通過Alpha多樣性分析結(jié)果表明， 雖然反映群落物種豐富度的ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)在病株根際土壤中比健株根際土壤更高， 但其反映群落多樣性的Shannon指數(shù)卻正好相反， 即健株根際土壤微生物群落的多樣性高于病株根際土壤． Shannon多樣性指數(shù)是群落物種豐富度和物種個體分布(均勻度)的測量指數(shù)， 因此這一結(jié)果也表明健株根際土壤微生物群落的豐富度(物種數(shù))雖然較低， 但其每個物種的個體分布更均勻． 向立剛等[31]的研究也表明， 因病枯萎或者死亡的植株， 由于其根系分泌物的影響， 根際土壤微生物群落的豐富度大大增加． 但Wei等[35]報道認為， 青枯病菌的入侵導(dǎo)致番茄根際土壤微生物群落多樣性和豐富度降低， 為病原物的再次入侵提供了更好的條件[35]． 因此， 如何求得土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性、 群落穩(wěn)定性以及植物抗病性三者最恰當?shù)慕M合， 將是今后研究的一個重要課題．

Beta多樣性利用各樣本序列間的進化關(guān)系及豐度信息來計算樣本間距離， 反映樣本(組)間是否具有顯著的微生物群落差異． 本研究采用主坐標分析(PCoA)對各采樣點進行降維排序分析， 結(jié)果表明， 健株根際土壤微生物群落， 無論是細菌或真菌都比較集中， 主要分布在第2，3象限， 而病株的比較分散， 主要分布在第1，4象限． 這一結(jié)果反映出健株和病株根際土壤微生物群落在組成結(jié)構(gòu)上存在一定的差異性， 健株根際土壤微生物的群落組成結(jié)構(gòu)在各采樣點上相似度較高， 而病株的差異較為顯著， 進一步說明榨菜根腫病的發(fā)生影響了根際土壤微生物群落的組成結(jié)構(gòu)．

有研究表明， 子囊菌門、 擔子菌門、 壺菌門等是根際土壤中相對豐度較高的真菌門[36]． 本研究發(fā)現(xiàn)， 在健株根際土壤真菌群落中， 擔子菌門的相對豐度顯著高于病株土壤， 前人研究也表明擔子菌門的微生物在抑病土壤中的豐富度較高[37]． 擔子菌門的微生物是土壤碳循環(huán)中的重要分解者[38]， 能把木質(zhì)素、 纖維素等分解成小分子化合物， 因此健康根際土壤中相對豐度較高的擔子菌門能促進土壤碳循環(huán)的利用[39]， 從而可能在一定程度上抑制榨菜根腫病的發(fā)生． 也有研究表明， 某些特定的細菌類群是土壤發(fā)揮抑病作用的重要指標[40]， 土壤根際微生物群落中變形菌門、 酸桿菌門、 放線菌門、 厚壁菌門等對維護植物健康發(fā)揮著重要作用[40-42]． 放線菌門的很多細菌能產(chǎn)生抗生素從而對病原物起到控制作用[43]． 本研究發(fā)現(xiàn)， 健株根際土壤細菌群落放線菌門的相對豐度顯著高于病株根際土壤， 進而有助于抑制根腫病的發(fā)生．

土壤微生物群落網(wǎng)絡(luò)互作中聯(lián)系越多， 表明其穩(wěn)定性越高， 抑制病原物入侵的能力也會越強[35，44]． 本研究根際土壤微生物群落網(wǎng)絡(luò)拓撲圖及其參數(shù)顯示， 無論是真菌還是細菌， 其健株的節(jié)點數(shù)、 邊緣數(shù)和連接度均大于病株， 表明健株根際土壤微生物群落內(nèi)物種的相互作用更為緊密， 因此能更好地發(fā)揮生態(tài)效益， 抑制榨菜根腫病病原物的入侵． 此外， 本研究通過網(wǎng)絡(luò)分析篩選出網(wǎng)絡(luò)中心性值最大的， 亦即在群落中具有關(guān)鍵性作用的物種， 其中已鑒定出的細菌Mucilaginibacter在健康根際土壤中顯著富集， 但其在土壤中所發(fā)揮的作用還有待探索[45]． 另一種已鑒定出的細菌Variovorax其某些株系所產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物， 或者其產(chǎn)生的鐵載體在維護植物健康中發(fā)揮著重要作用[46]． 有研究表明，Variovorax是土壤微生物群落的一類核心細菌屬， 在維持土壤微生物-植物信號網(wǎng)絡(luò)的復(fù)雜生態(tài)網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著重要作用[47]． 在已鑒定出的真菌中， 青霉菌屬Penicillium大多數(shù)被認為是土壤腐生菌， 但對立枯絲核病原菌的拮抗作用也被廣泛報道[48-49]， 其生物學(xué)特性已經(jīng)在生物技術(shù)領(lǐng)域中得到了廣泛利用． 另一種鑒定出的真菌Cryptococcus同時對多種病原真菌禾谷鐮孢菌(Fusariumgraminearum)、 擴張青霉病菌(Penicilliumexpansum)、 灰葡萄孢(Botrytiscinerea)和匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)等表現(xiàn)出良好的拮抗活性[50-51]， 其拮抗機制主要包含生態(tài)位競爭、 誘導(dǎo)植株抗病性和形成生物膜等[52]． 前人研究也表明在健康根際土壤中Cryptococcus具有較高的豐度， 它與病原物之間存在顯著負相關(guān)[53-54]． 目前尚未探究評估所篩選出來的潛在拮抗微生物類群與根腫病之間的直接相關(guān)性， 以及其抑病效果及作用機制． 因此， 這些特定細菌類群的有益作用及對根腫病發(fā)生的影響將是未來進一步深入研究的內(nèi)容．

近年來， 農(nóng)業(yè)微生物生物防治的重點由單一微生物菌株轉(zhuǎn)向微生物組的群體水平， 基于微生物組的合成功能菌群研究， 借以改變土壤微生物群落的組成和結(jié)構(gòu)， 對抑制土傳病害具有重要作用． Niu等[55]構(gòu)建有7種有益微生物組成的群落對鐮刀菌(Fusariumverticillioides)引起的土傳病害具有很好的防控效果； 短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)、 枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)及萎蔫短小桿菌(Curtobacteriumflaccumfa-ciens)組合對于提升黃瓜抵御不同病原菌的能力有顯著效果[56]； 通過接種黃單胞菌(Xanthomonas)、 寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonas)和微桿菌(Microbacterium)可以提高作物對擬南芥真菌病原體的抵抗力[57]． 這些組合模型也為今后進一步研究通過有益合成功能菌群操縱榨菜根際微生物群落來防控根腫病提供了科學(xué)的理論依據(jù)和技術(shù)參考．