周 勇，范伏元，柳玉佳，李 妲

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208 2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007)

肺纖維化(Pulmonary fibrosis，PF)是以肺泡間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、纖維母細(xì)胞增生和肺泡間質(zhì)纖維結(jié)締組織沉積為特征的免疫介導(dǎo)的慢性進(jìn)展性疾病[1]。該病預(yù)后不佳，生存率低，中位生存期為2～3年，我國(guó)肺纖維化的5年生存率大約為30%，嚴(yán)重威脅人類健康[2]。目前，肺纖維化的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，但炎癥反應(yīng)與之聯(lián)系緊密[3]。西醫(yī)治療肺纖維化的手段有限，長(zhǎng)期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑的副作用較大。因此，尋找治療PF的新思路意義重大。桃紅四物湯是中醫(yī)經(jīng)典名方，源自《醫(yī)宗金鑒》，具有養(yǎng)血、活血祛瘀之效，廣泛應(yīng)用于冠心病、腦梗死、糖尿病、關(guān)節(jié)炎等疾病的治療[4]。臨床研究表明，桃紅四物湯可以抑制血清中的炎癥因子，從而達(dá)到治療相關(guān)疾病的效果[5-6]。本次研究提出假設(shè)，桃紅四物湯可能通過(guò)降低模型大鼠炎癥因子表達(dá)，從而起到治療肺纖維化的作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)SD雌性大鼠50只，體質(zhì)量(200±20)g，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心統(tǒng)一代購(gòu)，動(dòng)物供應(yīng)商編碼：GYS-201905230001，質(zhì)量合格編號(hào)：ZS-202011170012，倫理審核編號(hào)：LLBH-202010150003，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF清潔級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 甲潑尼龍片劑(天津天藥藥物股份有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：H20020224)，桃紅四物湯組成：當(dāng)歸、熟地、川芎、白芍、桃仁各10 g，紅花6 g。各藥物均選用湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房藥材。先取各藥加水適量，花、葉、細(xì)莖類質(zhì)地較疏松和輕浮的植物藥一般浸泡20～30 min后入煎，根、果實(shí)類藥物需浸泡60 min后入煎。第一遍煎煮時(shí)水量應(yīng)為藥材量的5～8倍。煎藥一般先用大火煮沸后，再用文火煮，本次實(shí)驗(yàn)煎2次。第1次煎制結(jié)束后，將藥汁濾出，重新加水至高出藥平面約0.5～1 cm，進(jìn)行第2次煎制。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)材料 博來(lái)霉素(北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：Z8020)，多聚甲醛(Biosharp生物公司，貨號(hào)：2275)，水合氯醛(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；臺(tái)式高速離心機(jī)(塞維爾servicebio生物科技有限公司D1008E)，大鼠IL-1β、IL-6、TNF-αELISA檢測(cè)試劑盒(美國(guó)AndyGene公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物模型制備 采用氣管內(nèi)滴注博來(lái)霉素制備PF模型，腹腔注射10%水合氯醛(3.5 mL/kg)麻醉大鼠，后將其固定，使大鼠的頭部與桌面呈約30°夾角，剃頸毛，消毒頸部皮膚，嚴(yán)格無(wú)菌操作下，用外科手術(shù)刀在頸中作長(zhǎng)約1 cm切口，充分分離并暴露氣管，直視下將裝有博來(lái)霉素(4 mg/kg)的1 mL注射器針頭穿刺兩環(huán)狀軟骨間的氣道中，快速將藥物推入氣管中，期間保持針頭穩(wěn)定在氣管中央，退針后將鼠板與桌面呈90°夾角，來(lái)回旋轉(zhuǎn)鼠板，盡可能使博來(lái)霉素均勻分布在雙肺中。再用手術(shù)線縫合傷口，待大鼠麻醉醒后置于鼠盒，放回籠位飼養(yǎng)。對(duì)照組采用上述方法給予等體積生理鹽水[7]。

1.2.2 動(dòng)物分組及給藥方式 50只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 d后隨機(jī)分成5組，每組10只：Ⅰ空白組、Ⅱ模型組、Ⅲ甲潑尼龍組、Ⅳ桃紅四物湯低劑量組、Ⅴ桃紅四物湯高劑量組。灌胃給藥，從造模24 h后起，每天1次，連續(xù)灌胃28 d，直到取材。參照人體與動(dòng)物體表面積的折算系數(shù)[8]，將給藥量按標(biāo)準(zhǔn)體重?fù)Q算成大鼠的每日用藥劑量，將甲潑尼龍片劑制備成0.2 g/L的混懸液，中藥湯劑熬制成低劑量為2 g/mL，高劑量為4 g/mL的水煎劑；Ⅲ組給藥劑量為1.8 mg /( kg·d)，Ⅳ組給藥劑量為2 g /( kg·d)，Ⅴ組給藥劑量為4 g /( kg·d)。空白組、模型組給予等體積0.9%氯化鈉注射液。

1.3 觀察指標(biāo)及檢驗(yàn)方法

連續(xù)給藥28 d后，用10%水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血，室溫靜置30 min后離心(4 500 r·min-1，5 min，4 ℃)，分離血清，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書方法檢測(cè)血清中TNF-α、IL-1β、IL-6含量。取大鼠左側(cè)肺組織以4%多聚甲醛固定，采用蘇木素-伊紅(HE)染色，在光鏡下觀察肺組織肺泡炎癥和纖維化程度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 病理組織觀察

大鼠肺組織的HE染色結(jié)果如圖1顯示，空白組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，肺泡腔明顯，肺泡壁薄，肺組織未見明顯充血水腫，未見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組大鼠肺泡腔縮小，肺泡壁明顯增厚增寬，可見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，部分細(xì)支氣管上皮細(xì)胞脫落。甲潑尼龍組及桃紅四物湯低、高劑量組肺組織與模型組相比較，肺泡壁變薄，可見局部充血，少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，其中甲潑尼龍組和高劑量桃紅四物湯組的纖維化程度更低。見圖1。

圖1 各組肺組織HE染色觀察(×200倍)

2.2 各組血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量比較

與空白組比較，模型組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，甲潑尼龍組、桃紅四物湯低、高劑量組血清中的IL-1β、IL-6、TNF-α顯著降低(P<0.05)。其中，甲潑尼龍組與桃紅四物湯高劑量比較IL-1β、IL-6、TNF-α差異不具有顯著性(P>0.05)，甲潑尼龍組與桃紅四物湯低劑量比較IL-1β、IL-6、TNF-α差異具有顯著性(P<0.05)，桃紅四物湯劑低劑量組與桃紅四物湯高劑量組之間IL-1β、IL-6、TNF-α差異不具有顯著差異性(P>0.05)。見表1。

表1 5組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量

3 討論

肺纖維化屬于中醫(yī)學(xué)“肺痹”和“肺痿”等范疇，《素問(wèn)·痹論篇》記載：“肺痹者，煩滿而喘”，《素問(wèn)·五臟生成》提出：“有積氣在胸中，喘而虛，名曰肺痹?！薄督饏T要略》將肺痿單獨(dú)列為專篇論述，指出：“痿者萎也，如草木之萎而不榮?！逼洳∫虿C(jī)復(fù)雜，中醫(yī)認(rèn)為氣虛、痰阻、瘀血是主要病理因素，早期肺脾氣虛為主，外邪侵襲肺及脈絡(luò)，致痰瘀互結(jié)，病程延綿，在治法上主張清熱化痰治標(biāo)的同時(shí)，也注重活血化瘀以治本[9]。有醫(yī)家認(rèn)為，血瘀貫穿于肺纖維化的全過(guò)程，活血化瘀法貫穿于肺纖維化治療之始終[10]。桃紅四物湯是在四物湯的基礎(chǔ)上加入活血化瘀的桃仁、紅花，使其在調(diào)補(bǔ)氣血的同時(shí)，活血化瘀的功效更佳。

肺纖維化的病理特征為早期肺泡上皮細(xì)胞的彌漫性損傷，引起肺泡炎癥，當(dāng)肺部炎癥持續(xù)存在，而免疫相關(guān)因子通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑擴(kuò)大肺組織的損傷，導(dǎo)致大量成纖維細(xì)胞聚集，驅(qū)動(dòng)膠原、ECM沉積和組織收縮，引起肺實(shí)質(zhì)增厚及瘢痕形成[11]。TNF-α是一種重要的炎癥介質(zhì)，有聚集炎癥細(xì)胞的作用，肺損傷早期增加的TNF-α可上調(diào)黏附分子和化學(xué)趨化分子，是損傷肺炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的原因，TNF-α也是一種致纖維化因子，可刺激成纖維細(xì)胞的增值；IL-1β、IL-6 是重要的促炎因子，主要功能是通過(guò)趨化炎癥細(xì)胞聚集和促進(jìn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，加速肺纖維化早期的肺泡炎癥反應(yīng)，進(jìn)而介導(dǎo)特發(fā)性肺纖維化的發(fā)生[12]?，F(xiàn)代研究證實(shí)，桃紅四物湯可通過(guò)提高抗氧化能力，降低過(guò)氧反應(yīng)等對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化起到保護(hù)作用[13]，且具有抑制TNF-α和IL-6的失控性釋放，清除炎癥介質(zhì)，減少炎癥滲出，促進(jìn)炎癥吸收的作用[14]。本研究結(jié)果顯示，通過(guò)博來(lái)霉素制作的肺纖維化大鼠模型組與空白組比較，肺泡壁增寬增厚，肺組織結(jié)構(gòu)紊亂，炎性細(xì)胞滲出明顯，表示造模成功，而TNF-α、IL-1β、IL-6明顯升高，表示炎性因子在肺纖維化中發(fā)揮重要作用。與模型組比較，藥物干預(yù)組肺組織少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡壁較薄，TNF-α、IL-1β、IL-6降低，且隨著劑量上升，指標(biāo)下降更明顯。與甲潑尼龍組比較，桃紅四物湯低劑量組肺組織損傷更嚴(yán)重，炎癥因子升高；桃紅四物湯高劑量組肺組織及炎性因子無(wú)明顯變化。這說(shuō)明桃紅四物湯能明顯降低肺纖維化中的炎性因子，改善肺纖維化組織結(jié)構(gòu)，其中高劑量組效果與甲潑尼龍相似，病理結(jié)果也證實(shí)了此結(jié)論。

綜上，桃紅四物湯可以抑制炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的釋放，通過(guò)抗炎作用發(fā)揮抗纖維化作用，其抗纖維化機(jī)制有待進(jìn)一步明確。