龐安然 應(yīng)航

浙江中醫(yī)藥大學(xué)（浙江杭州 310053）

中風(fēng)在我國(guó)的發(fā)病率已經(jīng)超過(guò)379/10萬(wàn)，位列世界第一，是我國(guó)居民首位死亡原因，其中缺血性中風(fēng)最為常見(jiàn)，占比高達(dá)80%[1,2]。當(dāng)缺血性中風(fēng)病變部位為聽(tīng)覺(jué)皮層，還可能導(dǎo)致中樞性耳聾（Cen-tral deafness，CD），這類(lèi)患者多表現(xiàn)為聽(tīng)覺(jué)忽視、辨聲障礙、聲源定位能力差等臨床特征[3]。中樞性耳聾患者預(yù)后較差，以保護(hù)神經(jīng)元為目的的治療手段尚未取得較好的療效。星形膠質(zhì)細(xì)胞是缺血性中風(fēng)病理現(xiàn)象的活躍參與者，它約占人腦體積的50%。大腦皮層主要分布的是原漿性星形膠質(zhì)細(xì)胞，且對(duì)缺血性中風(fēng)更為敏感[4]，主要表現(xiàn)為星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖，其增殖發(fā)生在病灶周?chē)鷧^(qū)域，形成的膠質(zhì)瘢痕有助于維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)并隔離病變區(qū)域[5,6]。但影響缺血性中風(fēng)后星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖的因素尚不明確。

腦組織內(nèi)穩(wěn)定的pH值是維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常生理功能的關(guān)鍵，而缺血性中風(fēng)會(huì)伴隨腦組織pH值的顯著降低[7]。當(dāng)細(xì)胞外pH值降低時(shí)會(huì)激活酸敏感離子通道（ASICs），這是一類(lèi)H+激活的配體門(mén)控非選擇性陽(yáng)離子通道，是機(jī)械感應(yīng)性上皮鈉通道/退化蛋白（Epithelial Na+channel/degenerin，ENaC/DEG）超家族中的一員[8,9]。ASICs廣泛分布于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中，ASICs對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能均發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，參與了疼痛、學(xué)習(xí)、突觸可塑性等一系列生理和病理過(guò)程[10,11]。同聚體ASIC1a可通透 Ca2+，并對(duì)H+高度敏感[12]，缺血性中風(fēng)后,ASIC1a被激活,引起非谷氨酸依賴(lài)性神經(jīng)元損傷[8]。中樞神經(jīng)元ASIC1a的功能和作用機(jī)制已較為明確，而有關(guān)星形膠質(zhì)細(xì)胞ASIC1a的功能尚且不明[13]。探索聽(tīng)覺(jué)皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞ASIC1a的功能可能有助于中樞性耳聾治療策略的發(fā)展[14]。因此，本研究目的在于探究ASIC1a在缺氧/復(fù)氧所致小鼠聽(tīng)覺(jué)皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)野生型C57BL/6j小鼠（WT）購(gòu)自上海杰思捷公司，Asic1a敲除小鼠（Asic1a KO）由上海交通大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 主要試劑

胎牛血清（ThermoFisher）、CCK-8試劑盒（碧云天/Beyotime）、EdU試劑盒（碧云天/Beyotime）、DMEM高糖培養(yǎng)基（ThermoFisher）、DMEM無(wú)糖培養(yǎng)基（Solarbio?）、兔抗鼠 ASIC1a一抗（IF/1:100，WB/1:1000，proteintechTM）、山羊抗兔Alexa Fluor?555（1:200,abcam）、山羊抗兔 IgG 二抗，HRP（1:5000，ThermoFisher）；山羊抗鼠GFAP一抗（1:100,abcam）、驢抗山羊Alexa Fluor? 647（1:500,abcam）、BCA蛋白定量試劑盒（雅酶?）、封閉液BSA（5%;Solarbio）、Triton X-100（0.5%;Solarbio）等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 聽(tīng)覺(jué)皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)及純化

聽(tīng)覺(jué)皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞分離自出生后1～2 d野生型C57BL/6j和Asic1a敲除小鼠。將聽(tīng)覺(jué)皮層組織剪碎，加入0.25%胰酶0.5 mL于37℃恒溫培養(yǎng)箱中消化12 min，并每隔4 min取出晃動(dòng)1次。加入1 mL 10%FBS終止消化。反復(fù)輕柔吹打后用40 μm濾網(wǎng)過(guò)濾，1000 rpm離心5 min，去除上清，用DMEM培養(yǎng)基重懸。置于10 cm培養(yǎng)皿差速貼壁15 min除去成纖維細(xì)胞，并將細(xì)胞懸液重新接種在6 cm的培養(yǎng)皿里。原代星形膠質(zhì)細(xì)胞在恒溫培養(yǎng)箱（37℃,5%CO2）中培養(yǎng)7 d后，200 rpm振蕩過(guò)夜，純化。

1.2.2 聽(tīng)覺(jué)皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組

參照前人OGD/R模型[15]模擬體內(nèi)缺血再灌注損傷過(guò)程。純化后星形膠質(zhì)細(xì)胞隨機(jī)分為常氧組、缺氧組，其中常氧組和缺氧組的細(xì)胞培養(yǎng)液又分別分為無(wú)糖組（無(wú)糖DMEM+青-鏈霉素）和有糖組（25 mM DMEM+青-鏈霉素）。將常氧組細(xì)胞培養(yǎng)皿置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，將無(wú)糖組培養(yǎng)液更換為無(wú)糖DMEM處理24 h后將培養(yǎng)皿置于缺氧培養(yǎng)箱中以1% O2濃度缺氧培養(yǎng)6 h，再置于恒溫培養(yǎng)箱中復(fù)氧0 h；12 h；24 h；48 h；72 h。

1.2.3 ASIC1a表達(dá)量檢測(cè)

（1）免疫熒光檢測(cè)ASIC1a的表達(dá)：分別將不同分組的星形膠質(zhì)細(xì)胞去除培養(yǎng)基，PBS清洗3遍，預(yù)冷的4%PFA室溫固定15 min，PBS清洗3遍，用0.5%Triton X-100室溫通透15 min后，PBS清洗5 min×3次，用5%BSA溶液室溫封閉30 min，在4℃搖床上孵育ASIC1a和GFAP一抗過(guò)夜，PBS清洗5 min×3次，加入ASIC1a和GFAP的熒光二抗，室溫避光孵育1 h，PBS再次清洗5 min×3次，DAPI染核，PBS封片，共聚焦熒光顯微鏡（Zeiss710,德國(guó)）下觀察和拍照。

（2）免疫印跡檢測(cè)：分別收集野生型常氧和缺氧/復(fù)氧72 h的聽(tīng)覺(jué)皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞。用含2%蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液分別裂解每組細(xì)胞。BCA試劑盒蛋白定量后，以每組35 μg上樣量，在SDS-PAGE凝膠上分離，并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；1×TBST洗膜10 min×3次后，在4℃搖床上將膜與ASIC1a一抗孵育過(guò)夜，再孵育HRP二抗，1×TBST洗膜10 min×3次；然后用ECL發(fā)光液（碧云天/Beyotime）于曝光儀下顯影（密立博）。

1.2.4 聽(tīng)覺(jué)皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

（1）CCK-8：在96孔板中接種各組聽(tīng)覺(jué)皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)后，每孔接種100 μL 4×103個(gè)細(xì)胞。將細(xì)胞置于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h待其貼壁，缺氧6 h處理后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，再置于恒溫培養(yǎng)箱中孵育2 h,記為復(fù)氧0 h；用酶標(biāo)儀（Bio-Tek）測(cè)定450 nm處的吸光度（OD值），以600 nm作為參考波長(zhǎng)，分別測(cè)量各組細(xì)胞在復(fù)氧0 h、12 h、24 h、48 h、72 h的OD值，計(jì)算每組細(xì)胞相對(duì)于自身復(fù)氧0 h的細(xì)胞增殖倍數(shù)。

（2）EdU染色：將聽(tīng)覺(jué)皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞接種到共聚焦培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24 h。1% O2缺氧6 h再?gòu)?fù)氧72 h后，在恒溫培養(yǎng)箱中EdU孵育3 h。用4%PFA固定細(xì)胞5 min后，PBS洗滌5 min×3次，用0.5%Triton X-100室溫滲透15 min。PBS再次洗滌后，GFAP一抗孵育過(guò)夜，PBS洗滌，孵育二抗1 h，PBS洗滌；DAPI染細(xì)胞核10 min，PBS洗滌并封片，并在共聚焦顯微鏡下觀察拍照。

1.2.5 細(xì)胞缺氧/復(fù)氧造模過(guò)程

細(xì)胞缺氧/復(fù)氧造模過(guò)程如圖1所示。

圖1 聽(tīng)覺(jué)皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞缺氧/復(fù)氧造模過(guò)程Fig.1 A process of hypoxia/reoxygenation modeling of audi-tory cortex astrocytes

1.2.6 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)在SPSS 25.0軟件中進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)（independent-samples T test）和單因素方差分析（one-way ANOVA）。數(shù)據(jù)均用±s表示，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P<0.01為顯著性差異；image J軟件進(jìn)行染色細(xì)胞計(jì)數(shù)以及免疫印跡灰度分析；在Prism 8軟件中進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié)果

2.1 純化后聽(tīng)覺(jué)皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP染色結(jié)果

純化后的聽(tīng)覺(jué)皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞多為原漿性，細(xì)胞體較大，細(xì)胞扁而寬，分支少，如圖2所示。

圖2 純化后聽(tīng)覺(jué)皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP染色圖（200×）。Fig.2 GFAP staining of astrocytes in auditory cortex after pu-rification(200×).

2.2 聽(tīng)覺(jué)皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞ASIC1a蛋白表達(dá)量在缺氧/復(fù)氧后增加

前人研究[13]已表明ASIC1a存在于星形膠質(zhì)細(xì)胞，因此本研究就缺氧/復(fù)氧前后聽(tīng)覺(jué)皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞ASIC1a蛋白的表達(dá)量是否存在差異進(jìn)行探究。臨床研究顯示[16]高血糖合并缺血性中風(fēng)患者預(yù)后更差，考慮到糖濃度的影響，故將常氧組和缺氧組又分別分為有糖組和無(wú)糖組。如圖3野生型小鼠各組細(xì)胞缺氧/復(fù)氧72h后免疫印跡條帶及統(tǒng)計(jì)結(jié)果所示，相比于常氧無(wú)糖條件，缺氧/復(fù)氧和有糖刺激顯著促進(jìn)了星形膠質(zhì)細(xì)胞ASIC1a蛋白的表達(dá)（F=21.72；P<0.001）。如圖4免疫熒光的結(jié)果所示，缺氧組ASIC1a平均熒光強(qiáng)度高于常氧組（F=19.91；P=0.026）。以上結(jié)果表明，在缺氧/復(fù)氧后，聽(tīng)覺(jué)皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞ASIC1a蛋白表達(dá)量增加。

圖3 野生型小鼠各組星形膠質(zhì)細(xì)胞復(fù)氧72 h后ASIC1a的表達(dá)量（A：WB條帶結(jié)果；B：WB灰度分析,以GAPDH為參考，計(jì)算各組ASIC1a相對(duì)于GAPDH的表達(dá)量，n=3;*P<0.05，**P<0.01）。Fig.3 Expression of ASIC1a in astrocytes of WT mice after 72 h of reoxygenation(A:Western blot results;B:WB gray-scale analysis,with GAPDH as reference,the expression of ASIC1a relative to GAPDH in each group was calculated,n=3;*P<0.05,**P<0.01).

圖4 野生型小鼠各組星形膠質(zhì)細(xì)胞復(fù)氧72 h免疫熒光圖（A：200×；ASIC1a，綠色熒光；GFAP，紅色熒光；DAPI，藍(lán)色熒光；B：ASIC1a平均熒光強(qiáng)度，n=3，*P<0.05）。Fig.4 Immunofluorescence of astrocytes in WT mice after 72 h reoxygenation(A:200×;ASIC1a,green fluorescence;GFAP,red fluorescence;DAPI,blue fluorescence;B:ASIC1a mean fluorescence intensity,n=3,*P<0.05).

2.3 ASIC1a蛋白表達(dá)增加抑制缺氧/復(fù)氧后聽(tīng)覺(jué)皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖

本研究就上述實(shí)驗(yàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞ASIC1a蛋白表達(dá)增加對(duì)其增殖的影響進(jìn)行探究。如圖5 CCK-8統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果所示：常氧條件下，野生型小鼠ASIC1a蛋白表達(dá)量低，野生型與Asic1a敲除小鼠聽(tīng)覺(jué)皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖無(wú)顯著差異（t=1.159；P=0.262）；在缺氧/復(fù)氧72h條件下，野生型小鼠ASIC1a蛋白表達(dá)增加，Asic1a敲除小鼠聽(tīng)覺(jué)皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖高于野生型小鼠（t=-2.275；P=0.035），且有糖環(huán)境增殖更為顯著（t=10.244；P<0.001）。圖6 EdU細(xì)胞增殖熒光染色結(jié)果顯示，Asic1a敲除小鼠聽(tīng)覺(jué)皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞缺氧/復(fù)氧72h后正在增殖細(xì)胞數(shù)要顯著高于野生型小鼠（F=13.13；P<0.001）。上述結(jié)果表明，ASIC1a蛋白表達(dá)增加可抑制缺氧/復(fù)氧后聽(tīng)覺(jué)皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖。

圖5 野生型和Asic1a基因敲除小鼠聽(tīng)覺(jué)皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖倍數(shù)（A：野生型常氧對(duì)照組，n=10;B：Asic1a基因敲除常氧對(duì)照組，n=10;C：野生型1% O2缺氧6 h復(fù)氧各個(gè)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖倍數(shù)，n=10；D：Asic1a基因敲除1% O2缺氧6 h復(fù)氧各個(gè)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖倍數(shù)，n=10；各組細(xì)胞以自身0 h作為對(duì)照，分別計(jì)算各個(gè)時(shí)間點(diǎn)相對(duì)于0 h的細(xì)胞增殖倍數(shù)；**P<0.01）。Fig.5 Fold change of proliferation in auditory cortex astro-cyte of WT and Asic1a KO mice(A:WT normoxia control group,n=10;B:Asic1a KO normoxia control group,n=10;C:WT 1% O2hypoxia for 6 h reoxygenation at each time point of cell proliferation,n=10;D:Asic1a KO 1% O2hypoxia for 6 h reoxygenation at each time point of cell proliferation,n=10;The cells in each group were used as the control at 0 h,and the cell proliferation fold at each time point relative to 0 h was calculated respectively;**P<0.01).

圖6 野生型和Asic1a敲除小鼠聽(tīng)覺(jué)皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞復(fù)氧72 h正在增殖細(xì)胞數(shù)（A：EdU熒光染色圖，200×，EdU綠色，DAPI藍(lán)色；B：復(fù)氧72 h正在增殖細(xì)胞比例統(tǒng)計(jì)圖，n=8，細(xì)胞增殖比=（EdU和GFAP共染/DAPI和GFAP共染）×100%，*P<0.05，**P<0.01）。Fig.6 The number of proliferating cells in auditory cortex astrocytes of WT and Asic1a KO mice after reoxygenation for 72 h(A:EdU fluorescence staining,200×,EdU green,DAPI blue;B:Reoxygenation 72 h Statistical chart of the propor-tion of proliferating cells,n=8,cell proliferation ratio=(EdU and GFAP co-staining/DAPIand GFAP co-staining)×100%,*P<0.05,**P<0.01).

3 討論

中樞性耳聾的主要病發(fā)原因?yàn)槿毖灾酗L(fēng)引起的聽(tīng)覺(jué)皮層病變，其特征是外周聽(tīng)力正常，但大腦皮層喪失了感知聽(tīng)覺(jué)信號(hào)的能力[3,17]。星形膠質(zhì)細(xì)胞在缺血性中風(fēng)后仍可大量存活，缺血再灌注早期其增殖有利于神經(jīng)保護(hù)，并促進(jìn)中樞神經(jīng)元軸突再生[18]。ASIC1a能感知缺血性中風(fēng)所致的細(xì)胞外酸性環(huán)境[9]，探索星形膠質(zhì)細(xì)胞ASIC1a的作用至關(guān)重要。本研究結(jié)果顯示，聽(tīng)覺(jué)皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞ASIC1a蛋白在缺氧/復(fù)氧刺激后的表達(dá)量要高于常氧環(huán)境，且在有糖缺氧/復(fù)氧刺激下的表達(dá)量顯著增加。ASIC1a蛋白的表達(dá)上調(diào)會(huì)抑制聽(tīng)覺(jué)皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞在缺氧/復(fù)氧后的增殖，且有糖缺氧/復(fù)氧刺激增強(qiáng)了抑制效果。本研究對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞在缺血性中風(fēng)病理過(guò)程中的作用有了更深入的認(rèn)識(shí)。

ASIC1a通道的激活介導(dǎo)了缺血再灌注后大腦皮層神經(jīng)元的損傷，這種損傷主要發(fā)生在再灌注時(shí)期[19]，既往研究對(duì)其機(jī)制已有較深入的研究。Xiong[20]等報(bào)道缺血再灌注激活了小鼠皮層神經(jīng)元ASICs，增強(qiáng)了通道的電流幅值和延長(zhǎng)了去敏感化時(shí)間。缺血期間，Ca2+/鈣調(diào)素依賴(lài)性蛋白激酶II（CaMKII）促進(jìn)ASIC1a的磷酸化，增強(qiáng)了其對(duì)H+的敏感性，加劇神經(jīng)元損傷。而星形膠質(zhì)細(xì)胞ASIC1a在缺血再灌注后的作用尚不清晰。過(guò)往研究認(rèn)為[21]，對(duì)Ca2+具有高度通透性的谷氨酸受體是介導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鈣超載導(dǎo)致細(xì)胞死亡的主要通道。Huang[13]的研究顯示星形膠質(zhì)細(xì)胞ASIC1a在生理狀態(tài)下主要表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi)，不發(fā)揮功能性作用。近年來(lái)，Yang[22]等在癲癇模型小鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞膜上檢測(cè)到ASIC1a樣電流，介導(dǎo)Ca2+內(nèi)流，表明小鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞ASIC1a具有功能性作用，促進(jìn)了慢性癲癇的發(fā)展。本研究通過(guò)離體培養(yǎng)的原代聽(tīng)覺(jué)皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞證實(shí)，缺氧/復(fù)氧病理?xiàng)l件可使ASIC1a蛋白的表達(dá)上調(diào)，也說(shuō)明ASIC1a參與了缺氧/復(fù)氧后聽(tīng)覺(jué)皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞的病理過(guò)程。

ASIC1a通道在不同類(lèi)型細(xì)胞的增殖中發(fā)揮著不同的作用。Tao[23]等研究表明ASIC1a通過(guò)ERK/MAPK（Extracellular Signal-Regulated Kinase/Mi-togen-activated protein kinase）通路促進(jìn)滑膜成纖維細(xì)胞的增殖，抑制ASIC1a通道活性可減少滑膜增生從而延緩類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)展。而本研究結(jié)果表明ASIC1a蛋白的表達(dá)上調(diào)會(huì)抑制缺氧/復(fù)氧后聽(tīng)覺(jué)皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖。星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖受Notch-1通路調(diào)控。星形膠質(zhì)細(xì)胞Notch-1通路蛋白在缺氧刺激后表達(dá)增加，此信號(hào)通路的激活可顯著促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖[24]。由此，我們猜測(cè)缺氧/復(fù)氧病理刺激下ASIC1a可能通過(guò)抑制Notch-1通路蛋白磷酸化從而抑制了聽(tīng)覺(jué)皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖，其機(jī)制有待實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

星形膠質(zhì)細(xì)胞在減輕缺血性中風(fēng)所致神經(jīng)損傷中發(fā)揮著重要作用[25,26]，進(jìn)一步的研究可探索ASIC1a參與聽(tīng)覺(jué)皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞缺氧/復(fù)氧后增殖的信號(hào)通路及機(jī)制，從而為中樞性耳聾的確診和治療提供新思路。