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徐州地區(qū)354例耳聾患者耳聾基因篩查及基因譜分析

2022-04-19 08:57燕志強(qiáng)孫巖鄭桐高盛宏張俊王青盧宇
中華耳科學(xué)雜志 2022年2期
關(guān)鍵詞:基因突變耳聾位點

燕志強(qiáng)孫巖鄭桐高盛宏張俊王青盧宇

1陸軍第七十一集團(tuán)軍醫(yī)院/徐州醫(yī)科大學(xué)附屬淮海醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科(徐州 221004)

2四川大學(xué)華西醫(yī)院罕見病研究院(成都 610041)

兒童聽力下降,可導(dǎo)致語言和認(rèn)知功能發(fā)育遲緩;成年人聽力下降,對學(xué)業(yè)、工作及社會交流都會有很大影響。耳聾患者往往會受到旁人的歧視并被社會所孤立,這些問題給他們的身心健康帶來極大損害。此外,耳聾的治療、康復(fù)及教育所需要的費(fèi)用對耳聾家庭及國家社會也是一項沉重的負(fù)擔(dān)。因此,防聾治聾仍然是我國目前面臨的一項重大的醫(yī)學(xué)問題和社會問題。

遺傳因素是先天性耳聾的主要致病原因,也存在明顯的異質(zhì)性。目前已發(fā)現(xiàn)的非綜合征型耳聾基因110個,其中常染色體顯性遺傳非綜合征型聾(DFNA)基因45個,常染色體隱性遺傳非綜合征型聾(DFNB)基因70個,10個既表現(xiàn)為DFNA,又表現(xiàn)為 DFNB(COL11A2、GJB2、GJB6、MYO3A、MYO6、MYO7A、PTPRQ、TBC1D24、TECTA、TMC1),X-連鎖遺傳非綜合征型聾(DFNX)基因5個[1]。迄今為止已發(fā)現(xiàn)400多個遺傳綜合征伴有聽力障礙[2,3]。及時準(zhǔn)確的鑒別出耳聾患者的致病原因是否與遺傳因素有關(guān),哪些基因變異導(dǎo)致了耳聾,如何有效地阻斷耳聾基因的下一代遺傳是耳科醫(yī)師關(guān)注和研究的重點。由于臨床耳聾基因芯片在技術(shù)上和普及性上的局限性,目前我國耳聾臨床基因診斷仍有許多不足,許多檢出的基因突變致病性不明,另外尚有更多的新致聾基因有待揭示。

本研究以聾校學(xué)生為主要研究對象,旨在探索提高耳聾基因診斷方法與策略,一方面提高診斷率,同時盡可能節(jié)省資源提升診斷效率。

1 材料與方法

1.1 研究對象

研究對象來自徐州地區(qū)的354名聾校學(xué)生,年齡3-22歲,女性111例,男性243例,均為漢族。經(jīng)現(xiàn)場詢問病史、專科查體及聽力測試等方法,對聾校學(xué)生進(jìn)行了集中調(diào)查收集資料,征求患者及家屬同意并簽署知情同意書采集血樣,同時進(jìn)行科普宣傳及教育學(xué)習(xí)。所有患者家屬均簽署知情同意書。所有患者根據(jù)世界衛(wèi)生組織WHO《障礙、殘疾和殘廢的國際分類》(1997)聽力損失分級標(biāo)準(zhǔn),受檢對象中3人為中度感音神經(jīng)性聾,其余均為重度或極重度感音神經(jīng)性聾。首先采用SNPscan技術(shù)對36個GJB2基因突變位點、77個SLC26A4基因突變位點以及2個mt DNA突變位點(m.1555A>G、m.1494C>T)進(jìn)行檢測,隨后對基因診斷結(jié)果陰性病例采用大規(guī)模平行測序技術(shù)行158個耳聾相關(guān)基因檢測。

1.2 提取DNA

所有受檢對象采集外周血5ml備用,應(yīng)用AxyPrep血基因組DNA中量試劑盒提取DNA。具體操作步驟按照說明書進(jìn)行。

1.3 常見耳聾致病基因突變的檢測

利用SNPscan技術(shù)采用聯(lián)合設(shè)計的基因芯片對所有患者首先進(jìn)行常見致病基因篩查,該基因芯片包含36個GJB2基因突變位點、77個SLC26A4基因突變位點、2個線粒體突變位點(m.1555A>G、m.1494C>T)。具體檢測步驟參考操作說明書及先期報道[4]。

1.4 應(yīng)用大規(guī)模平行測序方法檢測158個耳聾基因

對常見耳聾致病基因診斷結(jié)果陰性結(jié)果患者,采用由袁慧軍教授團(tuán)隊研發(fā)的耳聾基因大規(guī)模平行測序方法測定158個耳聾相關(guān)基因,其中包括已知非綜合征型耳聾基因和常見綜合征型耳聾基因。

步驟及方法簡述如下:用安捷倫公司定制目標(biāo)區(qū)域捕獲試劑盒(Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA),根據(jù)試劑盒說明書(Agilent Technolo-gies,Santa Clara,CA,USA)進(jìn)行基因組DNA建庫。捕獲了158個基因的所有外顯子、側(cè)翼區(qū)內(nèi)含子和剪接區(qū)域。精確定量后,在Illumina HiSeq2000分析儀上對捕獲的DNA片段進(jìn)行測序。按照標(biāo)準(zhǔn)Illumina程序進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和生物信息學(xué)處理。使用BWA軟件包(http://bio-bwa.sourceforge)將測序所得短片段序列與GRCh37/hg19參考基因組數(shù)據(jù)集比對,識別可能影響蛋白質(zhì)功能的非同義候選突變,候選致病變異通過公共數(shù)據(jù)庫和內(nèi)部外顯子組數(shù)據(jù)庫中等位基因頻率小于0.005進(jìn)行篩選。

對新發(fā)現(xiàn)罕見變異的患者,收集家庭成員信息和血樣,通過Sanger測序?qū)蜻x致病突變進(jìn)行基因分型,進(jìn)行共分離分析。

2 結(jié)果

2.1 常見耳聾致病基因突變的檢測

354例患者共檢出113例(31.92%)攜帶GJB2基因致病突變,其中53例GJB2基因致病突變(14.97%)為復(fù)合雜合突變,60例(16.95%)GJB2基因突變?yōu)榧兒贤蛔儯?8例(16.38%)攜帶SLC26A4基因致病突變,其中SLC26A4基因復(fù)合雜合突變37例(10.45%),純合突變21例(5.93%),另外有m.1555A>G均質(zhì)性突變4例(1.13%),未發(fā)現(xiàn)m.1494C>T突變病例。

2.2 158個耳聾基因大規(guī)模平行測序檢測

對初篩后未診斷的179例患者進(jìn)行158個耳聾相關(guān)基因大規(guī)模平行測序檢測,其中41例(11.58%,41/354)基因診斷陽性,共包括11個耳聾基因,其中GJB2基因3例,SLC26A4基因9例,MYO15A基因13例,CDH23基因5例,具體情況見表1。GJB2基因和SLC26A4基因分別較常見耳聾致病基因突變檢測新增檢出突變位點2個和10個。

表1 復(fù)篩檢測耳聾相關(guān)基因情況Table 1 The deafness related genes detected by secondary screening

2.3 基因譜及診斷率

經(jīng)常見耳聾致病基因檢測發(fā)現(xiàn)陽性患者175例,診斷率49.43%;應(yīng)用大規(guī)模平行測序方法檢測158個耳聾基因發(fā)現(xiàn)陽性病例41人,診斷率11.58%,累計陽性患者216人,診斷率61.02%。經(jīng)兩次檢測共檢出各種致病基因12個,其中GJB2、SLC26A4基因致病率分別高達(dá)32.77%(116/354)、18.93%(67/354),其余依次為MYO15A、CDH23、m.A1555G、MYO7A、OTOF、TMPRSS3、POU3F4、PCDH15、LR-TOMT及MARVELD2。徐州地區(qū)耳聾基因譜如圖1。

圖1 徐州地區(qū)耳聾基因譜Fig.1 Gene spectrum of deafness in Xuzhou area

2.4 GJB2、SLC26A4基因位點突變頻率

GJB2、SLC26A4基因是最常見的致聾基因,常見耳聾致病基因突變的檢測共檢出不同GJB2基因陽性突變位點10個,SLC26A4陽性突變位點18個,二次檢測分別新增突變位點2個、8個,累計分別12、26個。GJB2基因突變頻率最高的為c.235delC突變,共檢出56例(48.28%,56/116)純合突變患者,SLC26A4基因突變頻率最高的為c.919-2A>G突變,共檢出20例(20/77)純合突變患者,各突變位點突變頻率情況見下圖2、3。

圖2 GJB2各基因位點突變頻率Fig.2 Mutation frequency of each locus of GJB2

圖3 SLC26A4各基因位點突變頻率Fig.3 Mutation frequency of each locus of SLC26A4

3 討論

耳聾是臨床常見疾病,也是常見的出生缺陷,是中國乃至全球重要的致殘原因。遺傳性耳聾約占先天性耳聾人群的60%,除人工耳蝸外目前尚無其它有效的治療方法,盡管助聽器和人工耳蝸技術(shù)取得了進(jìn)步,但聽覺的質(zhì)量仍然無法模仿正常的耳朵[5]?,F(xiàn)階段,我們臨床工作中遺傳性耳聾基因診斷采用的芯片僅包含了中國人群最常見的突變熱點,更全面的基因檢測技術(shù)雖然能夠檢測出更多的基因,但是檢出基因的一些變異是否致病仍不能確定,另外尚有更多的新致聾基因有待揭示和探索。這些所面臨的問題及困難給我們提出了挑戰(zhàn),促使我們必須積極應(yīng)對,尋找簡便、快速、低成本、高通量的遺傳性耳聾篩查方法及診斷技術(shù),提高診斷率,對于阻斷其遺傳通路,預(yù)防其發(fā)生將起到十分關(guān)鍵的作用。

本研究中我們分兩階段先后對常見耳聾致病基因進(jìn)行初篩,158個耳聾相關(guān)基因復(fù)篩檢測模式,后期我們擬通過全外顯子測序鑒定致病基因,以期發(fā)現(xiàn)新的致病基因及突變,提高診斷率。

本研究通過對354名先天性耳聾患者進(jìn)行基因?qū)W分析,結(jié)果顯示本地區(qū)耳聾基因診斷率較高的分別為GJB2>SLC26A4>MYO15A>CDH23>12SrRNA,診斷率分別為32.77%、18.93%、3.67%、1.41%及1.13%。其中采用大規(guī)模平行測序檢測158個耳聾相關(guān)基因二次檢測檢出了41例(11.58%)患者的致病基因。

本研究中共檢測了兩種線粒體耳聾相關(guān)基因突變,僅有m.1555A>G發(fā)現(xiàn)4例患者,這些患者大多具有明確的氨基甙糖甙類藥物用藥史,為遺傳因素和環(huán)境因素相互作用致病。m.1494C>T基因突變發(fā)病率低,分布較局限,本研究沒有發(fā)現(xiàn)m.1494C>T陽性患者,提示m.1555A>G是本地主要的線粒體耳聾基因突變形式。m.1555A>G在各個地區(qū)的致病率差異較大,本研究結(jié)果提示m.1555A>G致病率為1.13%(4/354),相比較而言處于較低水平[6]。

在第二階段新發(fā)現(xiàn)的基因突變既有常見致病基因GJB2、SLC26A4,還有其他9個耳聾相關(guān)基因,這些相關(guān)基因致病率相對于GJB2、SLC26A4基因普遍偏低,但MYO15A、CDH23基因致病率處于相對較高水平,在本組病例中高于12SrRNA(m.1555A>G)致病率。通過這些檢測有助于我們了解本地區(qū)耳聾基因分布情況,繪制本地區(qū)耳聾基因突變譜,并與其它地區(qū)進(jìn)行對照,發(fā)現(xiàn)地區(qū)間的差異,從而對后續(xù)其他患者的檢測提供指導(dǎo)和借鑒具有重要的科學(xué)意義。

Reiisi等報道在全球范圍內(nèi),常染色體隱性遺傳非綜合征型耳聾基因最常見的致病基因依次為GJB2、SLC26A4、MYO15A、OTOF和CDH23[7]。袁永一等針對中國患者的一項研究顯示常染色體隱性遺傳非綜合征型耳聾基因最常見的致病基因依次為GJB2、SLC26A4、12SrRNA、MYO15A、POU3F4和USH2A[8]。這些結(jié)果與本研究結(jié)果基本一致,其中OTOF基因在本研究中致病率偏低,而MYO15A基因致病率在本地區(qū)較高,這些結(jié)果表明耳聾基因在中國人群中的致病形式大致相似,但也存在一定的地區(qū)差異性。

本研究結(jié)果提示GJB2基因在本地區(qū)的主要突變形式是c.235delC,其次是c.299_300delAT、c.176_191del16。戴樸等對北京市180,469名新生兒行基因篩查結(jié)果亦提示,此三種突變熱點是主要突變形式,攜帶率分別為1.80%、0.50%、0.12%[9]。在許多西方種群中,c.35delG為GJB2基因的主要突變熱點,c.167delT在德系猶太人中很常見;而在印度和巴基斯坦血統(tǒng)的個體中,c.71G>A是常見的GJB2基因突變[10-12]。SLC26A4基因是僅次于GJB2基因的耳聾致病基因,檢測結(jié)果顯示本地區(qū)SLC26A4基因主要突變形式是c.919-2A>G,其次是c.2168A>G及c.1229C>T,與國內(nèi)之前的報道基本一致[13]。戴樸等對北京市180,469名新生兒行基因篩查結(jié)果亦提示c.919-2A>G、c.2168A>G攜帶率分別為1.34%、0.27%[9]。研究顯示伊朗人群SLC26A4基因主要突變熱點為c.1334T>G,捷克種群中最常見的突變?yōu)閏.412G>T,而c.707T>C、c.1246A>C、c.1001+1G>A主要在白種人中檢測到,c.2168A>G是韓國人中主要突變熱點,c.1826T>G和c.1001+1G>A突變則分別在南美和北美的失聰人群中為主要發(fā)現(xiàn),顯示出顯著的地區(qū)及種族差異[14,15]。本研究在二次檢測時確診了共12例GJB2和SLC26A4基因致病的病例,其中11例在初篩中檢出為攜帶者,說明在本地區(qū)的篩查中選擇GJB2基因235delC和SLC26A4基因c.919-2A>G熱點突變可以有效檢出和發(fā)現(xiàn)患者的可疑病因,同時也提示在耳聾患者的篩查中發(fā)現(xiàn)雜合突變,應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步檢測明確遺傳性病因。本研究二次檢測的突變譜提示可將SLC26A4基因c.1001+5G>C納入徐州地區(qū)初篩熱點突變范圍,以進(jìn)一步提高初篩檢出率。

本研究顯示首先通過常見致病基因及熱點突變位點的初步篩查,篩查陰性耳聾患者再次行耳聾相關(guān)基因篩查檢測策略,顯著提高了遺傳耳聾患者致病基因診斷率。同時對于更為全面的了解本地區(qū)耳聾患者的耳聾致病基因突變譜也有重要的科學(xué)意義。對于經(jīng)二次檢測均陰性患者,我們擬進(jìn)行全外顯子測序,這對于進(jìn)一步全面了解耳聾致病基因有重要意義。

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