王永樂，韓靜靜，王云婷，李宛蓉

（宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，安徽宿州 234000）

0 引言

新型冠狀病毒肺炎自2019 年12 月爆發(fā)以來，確診病例數(shù)仍在不斷增加，新型冠狀病毒肺炎已波及國內(nèi)多個省市及全球多個國家和地區(qū)。通過積極防控和救治，我國境內(nèi)疫情基本得到控制，僅在個別地區(qū)出現(xiàn)局部暴發(fā)和少數(shù)境外輸入病例。由于全球疫情仍在蔓延，且可能較長時期存在，新冠肺炎在我國傳播和擴(kuò)散的風(fēng)險也將持續(xù)存在[1]。

由于開發(fā)周期長，且病毒變異很快的特點，疫苗不能作為抵抗新冠肺炎的唯一途徑。新冠肺炎病情與個體體質(zhì)、病毒變異密切相關(guān)，表現(xiàn)錯綜復(fù)雜，病情演變與轉(zhuǎn)歸不一。中醫(yī)藥早期干預(yù)、辨證論治、整體調(diào)節(jié)對新冠肺炎療效確切[2]。通過辨證論治，多以提高人體免疫力及部分抗病毒、抗炎的中藥相互配伍使用，中藥復(fù)方在抗疫初期至目前都是對新冠肺炎的預(yù)防和輔助治療的重要方法之一[3-7]。

七味湯是由湖北省中醫(yī)院多位專家根據(jù)患者臨床癥候辨證論治、借鑒SARS 中醫(yī)防治經(jīng)驗研制出的藥方，該藥方在新型冠狀肺炎的預(yù)防上有顯著效果并得到廣泛應(yīng)用，這將是預(yù)防新型冠狀肺炎有效藥方之一。七味湯由黃芪15 g，炒白術(shù)9 g，防風(fēng)9 g，貫眾6 g，銀花9 g，陳皮6 g，佩蘭9 g 組成，臨床用來預(yù)防和治療新冠肺炎，具有清熱解毒、燥濕化濁、增強(qiáng)免疫力之功效。但是，該藥方需要通過現(xiàn)場熬制才能服用，耗費大量時間，也加大了疫情防控的工作量，加之有些普通民眾并不了解中藥熬制的方法，因此將七味湯開發(fā)為現(xiàn)代制劑尤為重要。采用單因素試驗及正交試驗優(yōu)化七味湯的最佳提取工藝。

1 儀器與材料

1.1 主要材料

黃芪，岷縣和泰中藥材有限公司提供；金銀花，河南省新封金銀花開發(fā)有限公司提供；炒白術(shù)，岷縣和泰中藥材有限公司提供；陳皮、佩蘭、貫眾、防風(fēng)，河北康安生物科技有限公司提供；其他試劑均為藥用試劑。

1.2 主要試驗儀器

V-5600 型紫外分光光度計，上海元析儀器有限公司產(chǎn)品；YRE-2000B 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)品；AL104 型分析天平，梅特勒-托利多股份有限公司產(chǎn)品；HH-ZK4 型恒溫水浴鍋，鞏義市予華儀器有限公司產(chǎn)品；SHZ-D(III)型循環(huán)水真空泵，鞏義市英峪高科儀器廠產(chǎn)品。

2 試驗方法

2.1 吸水率的測定

根據(jù)處方稱取，記質(zhì)量A，加入10 倍量水浸泡過夜后稱取藥材總質(zhì)量記為B，根據(jù)吸水率計算公式計算得吸水率。如此重復(fù)3 次試驗。

吸水率計算公式：

2.2 提取液的含量測定

2.2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

先配制出0.1 mg/mL 的葡萄糖標(biāo)液100 mL，然后稱取蒽酮50 mg 加蒸餾水25 mL，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98%的濃硫酸75 mL 配制蒽酮硫酸溶液[8]。顯色劑用量的考查：在0.1 mL 葡萄糖標(biāo)液中加蒸餾水至1 mL，分別加入不同量的顯色劑，測定吸光度。顯色時間的考查：在0.1 mL 葡萄糖標(biāo)液中加蒸餾水至1 mL，加入蒽酮硫酸溶液9 mL 后，分別沸水浴3，6，9，11 min，冷卻，測定吸光度。繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線：改變葡萄糖標(biāo)液和蒸餾水的用量，再分別加入顯色劑9 mL，沸水浴9 min，于波長625 nm處測定吸光度[9]。

2.2.2 多糖含量的測定

取稀釋后的七味湯提取液1 mL，加入9 mL 蒽酮-硫酸溶液，沸水浴9 min，冷卻后測吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查看對應(yīng)的多糖質(zhì)量濃度[9]，并依據(jù)多糖提取率公式計算多糖提取率。

多糖提取率公式：

式中：Y——七味湯多糖提取率，%；

C——七味湯中多糖質(zhì)量濃度，mg/mL；

V——七味湯稀釋液體積，mL；

N——七味湯提取液稀釋倍數(shù)；

m——樣品質(zhì)量，g。

2.3 單因素試驗對多糖提取率的影響

以復(fù)方中總多糖含量為評價指標(biāo)，單因素試驗分別篩選復(fù)方提取時煎煮時間、煎煮次數(shù)、加水量。

（1） 煎煮時間對提取率的影響。選取煎煮時間分別為0.5，1.5，3.0 h，浸泡時間12 h，10 倍用水量，煎煮2 次后濃縮、定容，測定吸光度，計算多糖提取率。

（2） 煎煮次數(shù)對提取率的影響。選取煎煮次數(shù)分別為1，2，3 次，10 倍用水量，浸泡12 h，煎煮1.5 h 后濃縮、定容，測定吸光度，計算多糖提取率。

（3） 加水量對提取率的影響。分別加5，10，15 倍用水量，浸泡12 h，煎煮1 h，煎煮2 次后濃縮、定容，測定吸光度，計算多糖提取率。

2.4 正交試驗優(yōu)選提取工藝

藥材的主要有效成分多為有機(jī)酸、皂苷及多糖類成分，均有較好的水溶性，且該方臨床以湯劑形式應(yīng)用，為充分保證其原有的臨床療效與物質(zhì)基礎(chǔ)，試驗采用水煎煮法進(jìn)行提取。根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以復(fù)方中總多糖含量為評價指標(biāo)，采用正交試驗法對用水量（A）、煎煮時間（B） 和煎煮次數(shù)（C） 進(jìn)行三因素三水平的正交試驗[10-11]。

正交試驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 正交試驗因素與水平設(shè)計

3 試驗結(jié)果

3.1 吸水率測定

根據(jù)吸水率計算公式算出吸水率。重復(fù)3 次試驗后稱量藥材吸水前后總質(zhì)量得試驗結(jié)果平均吸水率為327%。

3.2 多糖含量的測定

（1） 吸收曲線。用紫外-可見分光光度計于波長500~700 nm 處進(jìn)行光譜掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在波長625 nm 處有最大吸收，故試驗采用625 nm 為測定波長。

（2） 顯色劑用量。顯色劑用量與吸光度的關(guān)系（見圖1），當(dāng)顯色劑用量為9 mL 時吸光度最大，故試驗采用顯色劑用量為9 mL。

（3） 顯色時間。吸光度與顯色時間關(guān)系（見圖2），沸水浴時間在9 min 內(nèi)，隨著時間的增加吸光度值顯著增大，9 min 后吸光度值減小，12 min 后吸光度值大致保持不變，因而最佳顯色時間為9 min。

（4） 標(biāo)準(zhǔn)曲線。葡萄糖質(zhì)量濃度與吸光度的關(guān)系（見圖3），得出吸光度（Y） 與葡萄糖質(zhì)量濃度（X） 的回歸方程為Y=0.0401X+0.002 2，R2=0.998 3，在質(zhì)量濃度0~10 mg/mL 內(nèi)線性關(guān)系良好。

顯色劑用量與吸光度關(guān)系曲線見圖1，顯色時間與吸光度關(guān)系曲線見圖2，葡萄糖質(zhì)量濃度與吸光度關(guān)系見圖3。

圖1 顯色劑用量與吸光度關(guān)系曲線

圖2 顯色時間與吸光度關(guān)系曲線

圖3 葡萄糖質(zhì)量濃度與吸光度關(guān)系

3.3 單因素試驗和正交試驗篩選最優(yōu)提取工藝

3.3.1 煎煮時間對多糖提取率的影響

選取煎煮時間分別為0.5，1.0，1.5 h，浸泡時間12 h，8 倍用水量，煎煮2 次后，濃縮、定容，測定吸光度，計算多糖提取率。

煎煮時間與多糖提取率的關(guān)系見圖4。

圖4 煎煮時間與多糖提取率的關(guān)系

3.3.2 煎煮次數(shù)對多糖提取率的影響

選取煎煮次數(shù)分別為1，2，3 次，8 倍用水量，浸泡12 h，煎煮1 h 后定容，測定吸光度，計算多糖提取率。

煎煮次數(shù)與多糖提取率的關(guān)系見圖5。

圖5 煎煮次數(shù)與多糖提取率的關(guān)系

3.3.3 加水量對多糖提取率的影響

分別加6，8，10 倍用水量，浸泡12 h，煎煮1 h煎煮2 次后定容，測定吸光度，計算多糖提取率。

加水量與多糖提取率的關(guān)系見圖6。

圖6 加水量與多糖提取率的關(guān)系

3.4 正交試驗結(jié)果

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以多糖含量為指標(biāo)，對煎煮時間、煎煮次數(shù)、加水量進(jìn)行三因素三水平的正交試驗。

正交試驗結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2 正交試驗結(jié)果

由表2 可知，用水劑量1，2，3 分別代表用水量為6，8，10 倍；煎煮時間1，2，3 分別代表煎煮時間為0.5，1.0，1.5 h；煎煮次數(shù)1，2，3 分別代表煎煮次數(shù)為1，2，3 次；影響因素主次關(guān)系由大到小是煎煮次數(shù)、用水劑量和煎煮時間。

由表3 可知，加水量（A） 因素F0.05(2,2)＜F＜F(2,2)0.01，即0.01＜p＜0.05，差異顯著。

表3 方差分析

煎煮時間（B） 因素F＜0.05(2,2)，即p＞0.05，差異不顯著。煎煮次數(shù)（C） 因素F＞0.01(2,2)，即p＜0.01，差異極顯著。

通過正交試驗結(jié)果可知，七味湯提取工藝的最佳水平為A3B3C3，即用水量為10 倍，煎煮時間為1.5 h，煎煮次數(shù)為3 次。

4 結(jié)論

以多糖提取率作為指標(biāo)，采用單因素試驗與正交試驗法對優(yōu)化七味湯最佳提取工藝。結(jié)果表明，七味湯提取工藝的最佳提取工藝為用水量為10 倍，煎煮時間1.5 h，煎煮次數(shù)3 次。

七味中藥材中都含有的有效物質(zhì)是多糖，因此將多糖提取率作為測定標(biāo)準(zhǔn)，通過單因素試驗與正交因素相結(jié)合得出最佳提取方案。優(yōu)化了七味湯的最佳提取工藝，將七味湯制成現(xiàn)代顆粒藥劑奠定基礎(chǔ)。后續(xù)將對七味湯的抑菌作用進(jìn)行研究，并將七味湯開發(fā)為七味顆粒劑，希望可以作為病毒性肺炎及細(xì)菌性肺炎的輔助用藥。