葛甜甜，王 楠，高 靜*，張 崗，顏永剛，沈雨璇

(1 陜西中醫(yī)藥大學 藥學院/陜西省中醫(yī)藥管理局秦藥研發(fā)重點實驗室，西安 712046；2 陜西中醫(yī)藥大學 陜西中藥資源產業(yè)化省部共建協同創(chuàng)新中心/秦藥特色資源研究與開發(fā)國家重點實驗室(培育)，陜西咸陽 712083)

WOX(WUSCHEL-related homeobox)轉錄因子基因家族屬于植物同源框(homeobox)轉錄因子超家族的一個亞進化支[1]，其保守序列是由60個左右的氨基酸以“螺旋-環(huán)-螺旋-轉角-螺旋(helix-loop-helix-turn-helix)”構成的同源異型結構域(homeodomain，HD)。WOX轉錄因子通過HD與特定的DNA序列結合發(fā)揮生物學功能[2]，目前在擬南芥[3]、水稻[4]、烏拉爾圖小麥[5]、小桐子[6]和玉米[7]等植物中均有研究報道，廣泛參與干細胞分裂分化的調控、胚胎和器官的形成、花的發(fā)育等過程[8]。

擬南芥基因組中有15個WOX成員，分別是AtWUS和AtWOX1-AtWOX14[9]，其中，AtWOX13和AtWOX14對根和花器官的發(fā)育產生影響，AtWOX8和AtWOX9在受精卵發(fā)育成胚的過程中發(fā)揮作用，AtWOX11和AtWOX12共同參與影響外植體根的器官發(fā)育。WUS基因作為形成和維持莖頂端分生組織所必需的基因，其對莖尖分生組織中心區(qū)細胞的表達和子房、花藥的發(fā)育過程都具有一定的作用[10]。AtWOX5具有與WUS基因相似的功能，可以調控根尖分生組織的表達[11]。AtWOX1和AtWOX3共同調控葉片的橫向生長，影響葉片的寬度[12]。在水稻中有13個WOX成員，OsWUS在腋芽的背面表達，OsWOX3是AtWOX3的同源基因，在葉片和花器官原基中表達，并且其表達是葉片發(fā)育所必需的。OsWOX9是AtWOX5的同源基因，參與根尖分生組織的維持，在根的靜止中心(QC)的細胞中特異性表達[4]。

此外，有研究表明，WOX基因在植物響應干旱、低溫或鹽脅迫等非生物脅迫中發(fā)揮了關鍵作用[13]。在HOS9-1擬南芥突變體中，AtWOX6可影響冷脅迫的應答[14]。在水稻中，OsWOX11通過調節(jié)根毛發(fā)育來增強水稻的抗旱性[15]。同時，WOX基因受生長素(IAA)、脫落酸(ABA)和赤霉素(GA)和細胞分裂素(CTK)等激素的調控[4]。王培杰等[16]在不同激素處理茶樹的研究中發(fā)現，CsWOX5、CsWOX3、CsWOX2和CsWOX6分別受到乙烯(ETH)、ABA、茉莉酸甲酯(MeJA)和GA的顯著影響。Ohmori等[17]研究發(fā)現，OsWOX4通過參與CTK介導的水稻莖尖分生組織可維持未分化的狀態(tài)，促進植物地上部分的生長。OsWOX11可以直接抑制細胞分裂素A型響應調節(jié)劑(RR2)基因的表達，進而調控IAA和CTK，影響水稻不定根的生長發(fā)育[15]。

甘草(GlycyrrhizauralensisFisch.)是豆科甘草屬植物，以其根及根莖入藥，具有清熱解毒，緩急止痛，潤肺止咳的功效，對糖尿病、哮喘等有一定治療作用[18]。干旱[19]、高溫[20]和鹽脅迫[21]等非生物脅迫會嚴重威脅甘草的生長，降低甘草的產量和質量。本研究通過生物信息學的方法對GuWOX基因家族進行分析，并采用實時熒光定量PCR技術(qRT-PCR)研究GuWOX基因在不同組織(莖、幼葉、成熟葉、主根根尖、主根、側根根尖和側根)和不同處理(無磷、干旱和鹽脅迫以及ABA和GA3)下的表達模式，成功克隆4個GuWOX基因，為進一步探索GuWOX基因家族的功能和多樣化表達模式提供一定的理論參考。

1 材料和方法

1.1 實驗材料及處理

試驗材料為甘草種子，于2020年4月采自新疆烏魯木齊，經陜西中醫(yī)藥大學黃文靜副教授鑒定為豆科植物甘草。挑選健康飽滿的種子以體積比為1∶3的30%過氧化氫：純凈水消毒30 min，用蒸餾水沖洗干凈后，放入鋪有2層濾紙的培養(yǎng)皿中，加適量水后進行催芽萌發(fā)，于人工氣候箱中(溫度25 ℃，相對濕度75%，光暗周期交替為12 h/12 h)進行為期7 d的催芽育苗，選擇長勢一致的幼苗植株移栽至塑料水培盆中，采用Hoagland全營養(yǎng)液水培1個月進行實驗。選取正常生長條件下的甘草莖、幼葉、成熟葉、主根根尖、主根、側根根尖和側根用于組織特異性表達分析。以缺磷的霍格蘭營養(yǎng)液(WP)、15 g/L聚乙二醇6000(PEG)[19]、150 mmol/L氯化鈉(NaCl)[21]模擬無磷、干旱和鹽脅迫處理，以霍格蘭全營養(yǎng)液培養(yǎng)作為對照組(CK)。用100 μmol/L ABA、100 μmol/L GA3[16]噴灑甘草葉片進行激素處理，對照用純水進行噴灑。實驗均設置3個生物學重復，在處理3、6、12和24 h后取甘草的葉和根，蒸餾水洗凈后，用錫紙包裹標記，液氮速凍后，于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方 法

1.2.1GuWOX基因家族成員的鑒定利用http://ngs-data-archive.psc.riken.jp/Gur-genome/網站獲取甘草的全基因組序列數據[22]，從TAIR(https://www.arabidopsis.org/)中獲取擬南芥15個AtWOX家族成員的蛋白全長序列。以AtWOX蛋白序列為查詢序列，進行Blast同源序列比對以獲得GuWOX的所有成員，并運用EBL-EBI(http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence/)在線工具分析候選蛋白序列的保守結構域，結合SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)在線分析工具進行驗證，使用DOG2.0軟件繪制蛋白結構域圖。

1.2.2 系統(tǒng)進化樹的構建利用MEGA7.0軟件通過鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)對GuWOX、AtWOX和OsWOX蛋白進行比對建樹；bootstrap值設置為1 000，其他為默認參數。

1.2.3 GuWOX蛋白信息學分析利用ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)在線工具分析GuWOX蛋白的理化性質，主要包括氨基酸殘基數、分子量、理論等電點、總平均親水性等。

分別利用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)、Cell-PLOC2.0(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/)在線分析工具對GuWOX蛋白的二級結構組成形式、亞細胞定位進行預測。利用TBtools軟件提取GuWOX基因起始密碼子上游2 000 bp的序列，將其提交到PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在線工具分析啟動子區(qū)域的順式作用元件。

1.2.4GuWOX基因的表達分析利用甘草的全基因組序列數據庫獲得GuWOX基因家族的CDS序列，使用Primer Premier5.0軟件，隨機選取5條GuWOX基因家族的CDS序列設計引物，并交由生工生物工程股份有限公司(上海)合成引物，引物序列見表1，以Actin作為內參基因[23]進行特異性表達分析。按照天根多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)的方法提取甘草根和葉RNA，并使用0.8%的凝膠電泳檢測RNA質量。模板cDNA采用FastKing RT Kit (With gDNase)試劑盒的方法合成。qRT-PCR采用SuperReal PreMix Plus (SYBR Green)試劑在qTOWER2.0實時PCR儀上完成，擴增體系含20 μL，分別包含1 μL cDNA，上下游引物各0.6 μL，10 μL SYBR MIX，

表1 qRT-PCR和基因克隆的引物序列

7.8 μL ddH2O；反應程序為：95 ℃預變性15 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)40次，試驗3次重復。數據結果采用2-ΔΔCT法[24]進行分析，用SPSS 25.0對數據進行顯著性分析，并用GraphPad Prism 8.0繪圖。

1.2.5GuWOX基因克隆利用甘草的全基因組序列數據庫獲得GuWOX基因家族的CDS序列設計克隆引物(表1)，以甘草葉片cDNA為模板進行PCR擴增，PCR反應體系(20 μL)為cDNA 2.0 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 7 μL，2×Hieff TM PCR Master Mix酶10 μL。PCR擴增程序設置為94 ℃預變性4 min，95 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸90 s，35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。將PCR產物送生工生物工程股份有限公司(上海)測序。

2 結果與分析

2.1 GuWOX基因家族蛋白結構的鑒定

將AtWOX蛋白序列與甘草全基因組數據進行Blast比對，共鑒定獲得16個GuWOX蛋白序列，為進一步確定所獲得的GuWOX是否屬于WOX家族，使用EBL-EBI在線分析工具對所獲得的GuWOX進行保守結構域分析，并結合SMART在線分析工具對其進行驗證。如圖1所示，將最終所得GuWOX蛋白序列分別命名為GuWOX1～GuWOX16，這16個GuWOX蛋白均具有一個HD，屬于典型的WOX家族成員。

圖1 GuWOX蛋白保守結構域

2.2 GuWOX基因家族系統(tǒng)進化樹分析

為揭示GuWOX基因家族蛋白的進化關系，通過鄰接法構建GuWOX、AtWOX和OsWOX蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹。圖2顯示，GuWOX家族蛋白分為3個亞家族，為現代支、中間支和遠古支，其中現代支包括GuWOX1～GuWOX9，中間支包括GuWOX10、GuWOX11、GuWOX15、GuWOX16，遠古支包括GuWOX12～GuWOX14。GuWOX12～GuWOX14和AtWOX13、AtWOX14聚在同一分支，預測GuWOX12～GuWOX14調控植物生長發(fā)育，可能與AtWOX13、AtWOX14有相同的功能。

圖2 GuWOX、AtWOX和OsWOX家族成員蛋白系統(tǒng)進化樹

2.3 GuWOX蛋白的生物信息學分析

對16個GuWOX蛋白的基本理化性質進行分析(表2)，其氨基酸殘基數在168～452 aa之間，分子量為19.39～50.11 kD。理論等電點(pI)值在5.28～8.97之間，說明它們可能在不同的微環(huán)境中發(fā)揮功能。脂肪系數為50.83～68.56，蛋白不穩(wěn)定系數在51.07～71.30左右，均大于40，為不穩(wěn)定蛋白。總平均親水性為-1.08～-0.51，均為負值。

表2 GuWOX蛋白的理化性質

通過對GuWOX蛋白進行二級結構和亞細胞定位的預測(表3)，結果表明除GuWOX1和GuWOX2無規(guī)則卷曲的比例分別為45.11%和47.02%外，其余14個蛋白的無規(guī)則卷曲比例都大于50%，GuWOX蛋白以無規(guī)則卷曲為主要結構形式。亞細胞定位結果顯示GuWOX蛋白均定位在細胞核上。

表3 GuWOX蛋白的二級結構預測

2.4 GuWOX基因家族啟動子的順式作用元件分析

利用PlantCARE分析GuWOX基因的啟動子序列。結果顯示(表4)，GuWOX啟動子中包含的元件按照功能主要分為5類，為應答逆境順式調控元件、光響應元件、組織特異性元件、蛋白質結合位點和激素響應元件。其中，63%的GuWOX家族成員具有TC-rich repeats、LTR、GC-motif等3個應答逆境順式調控元件。光響應元件，包括3-AF1bindingsite、AAAC-motif、GT1-motif，11個GuWOX家族成員均具有該元件。HD-Zip1元件僅存在于GuWOX14中，CAT-box元件存在于GuWOX1、GuWOX5、GuWOX7、GuWOX11、GuWOX13等5個成員中。此外，19%GuWOX家族成員具有IAA順式作用元件TGA-element、25%的成員具有響應GA應答的GARE-motif作用元件，31%的成員具有響應水楊酸(SA)應答的TCA-element作用元件，94%的成員具有ABA順式作用元件ABRE，因此GuWOX基因可能參與甘草的分生組織生長、對逆境脅迫的響應以及激素調節(jié)甘草的發(fā)育。

表4 GuWOX基因順式作用元件分析

2.5 GuWOX基因家族在不同組織中的表達分析

組織特異性表達分析發(fā)現(圖3),5個GuWOX在不同組織的表達量存在著一定的差異。其中，GuWOX1在側根中的表達量顯著高于其他基因(P<0.05)，為2.29。在成熟葉中GuWOX1的表達量相較于其他基因最低，為0.45，并且，相較于其余6種組織，GuWOX1在側根中的表達量最高。GuWOX15在莖中的表達顯著高于其他基因(P<0.05)，但其在不同組織間的表達無顯著差異(P>0.05),同時，GuWOX15在幼葉、成熟葉、主根根尖、側根根尖和側根的表達均顯著高于GuWOX12(P<0.05)。以上結果說明了GuWOX基因可能參與甘草的不同生長發(fā)育過程。

不同大寫字母表示同一基因不同組織的表達差異顯著(P<0.05)。不同小寫字母表示同一組織不同基因的表達差異顯著(P<0.05)

2.6 GuWOX基因在非生物脅迫下的表達分析

甘草葉中基因表達結果如圖4所示，與對照相比，干旱處理3 h時GuWOX1、GuWOX6、GuWOX15均上調表達(P<0.05)，GuWOX15還在干旱處理12 h時顯著上調表達且表達量最高，為19.63。GuWOX12在3～24 h內的表達量持續(xù)上調。在鹽處理中，GuWOX1、GuWOX6、GuWOX15的表達量隨脅迫時間增加呈下調趨勢。在無磷處理中，GuWOX1、GuWOX6、GuWOX15在3 h時顯著上調(P<0.05)，在6 h時顯著下調(P<0.05)。激素ABA處理后GuWOX6、GuWOX12、GuWOX15在3和6 h時均顯著上調(P<0.05)。GuWOX1的表達在3～12 h顯著上調(P<0.05)，在12～24 h顯著下調(P<0.05)。激素GA3處理6 h時后，與對照相比，5個GuWOX基因均呈上調表達(P<0.05)。

不同大寫字母表示同一處理不同時間下同一基因的表達差異顯著(P<0.05)，不同小寫字母表示同一處理同一時間下不同基因的表達差異顯著(P<0.05)，下同

甘草根中基因表達結果如圖5所示，與對照相比，干旱、鹽和無磷處理6和12 h時GuWOX15顯著上調(P<0.05)。GuWOX5在3種處理3和24 h時均上調表達(P<0.05)，并且在3～12 h下調，12～24 h上調。ABA處理6 h時這5個基因均上調表達(P<0.05)。GuWOX1和GuWOX15在12～24 h均顯著下降(P<0.05)，GuWOX12的表達量在3～24 h先上升后下降(P<0.05)。GA3處理下，3 h時GuWOX12和GuWOX15顯著上調(P<0.05)，GuWOX5和GuWOX6分別在6和24 h時上調表達(P<0.05)。

圖5 不同處理下甘草根中GuWOX基因的表達水平

2.7 GuWOX基因的全長克隆

以甘草葉片cDNA為模板，經PCR擴增獲得GuWOX1、GuWOX5、GuWOX6和GuWOX12的cDNA序列，其cDNA全長分別為557、707、716、578 bp，且分別編碼184、237、237、191個氨基酸(圖 6)。

M. DL3000；1. GuWOX1；2. GuWOX5；3. GuWOX6；4. GuWOX12

3 討 論

WOX轉錄因子是植物特有的轉錄因子，參與植物生長發(fā)育調控和應答非生物脅迫[25]。本研究利用生物信息學的方法在甘草基因組中共鑒定出16個GuWOX基因家族成員，其均含有HD[26]。經過系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現，GuWOX基因編碼的蛋白被分為3個進化支，分別有3、4和9個成員分布于遠古支、中間支和現代支中，這與在擬南芥中的研究一致[3]，每一個進化支都包含了單子葉植物水稻OsWOX基因家族和雙子葉植物甘草GuWOX、擬南芥AtWOX基因家族成員，推測WOX基因的分化早于單雙子葉植物的分化。GuWOX家族蛋白均為親水性不穩(wěn)定蛋白質，相似的理化性質預示各個成員間可能具有某些相似的功能。GuWOX家族蛋白亞細胞定位均在細胞核上，說明GuWOX基因家族在細胞核中發(fā)揮作用，這與擬南芥中AtWUS、AtWOX3、AtWOX4、AtWOX6和水稻中OsWOX3、OsWOX9和OsWOX11的亞細胞定位結果一致[27-29]。

WOX基因對植物的生長發(fā)育、抗逆性、植物激素信號轉導等起著重要的調控作用[13]。水稻中OsWOX11參與側根原基萌生、不定根伸長和根表皮細胞分化為根毛，最終增加根系生物量，促進吸水，幫助抵御干旱脅迫[30]。干旱處理6和12 h時GuWOX15在甘草根中被誘導上調，推測GuWOX15可能通過調控根的發(fā)育以抵御干旱脅迫。蔡璐羽等[31]研究發(fā)現，低磷脅迫顯著增加WOX5在大豆側根尖和主根尖的表達。GuWOX1在側根的表達量最高，并且在缺磷處理12 h時，在根中被上調表達，推測GuWOX1可能與其同源基因AtWOX5有相似的功能，在根尖分生組織發(fā)育中起作用，參與根的形成，在缺磷條件下增加根系表面積，提高對養(yǎng)分吸收。此外，GuWOX1在幼葉內有較高的表達，說明了GuWOX1可能在其他組織部位發(fā)揮作用。本研究結果中，甘草的葉和根中的WOX基因在脅迫條件下整體表達水平較高，說明GuWOX在甘草響應干旱、鹽和缺磷脅迫中發(fā)揮積極作用。

有研究表明，WOX基因在調控植物生長發(fā)育過程受IAA、ABA和GA等激素的調節(jié)[15]。本實驗中，在GuWOX啟動子區(qū)域觀察到大量激素響應元件，包括分別參與ABA、IAA、SA、GA反應中的順式作用元件ABRE、TGA-element、TCA-element、GARE-motif，因此，WOX基因參與ABA、GA等信號轉導途徑。在擬南芥中，外源施加GA后，AtWOX14過表達會刺激GA3-氧化酶(GA3ox)合成代謝基因的表達并抑制GA2-氧化酶(GA2ox)分解代謝基因，促進生物活性GA的積累[32]。本研究中，與AtWOX14親緣關系較近的GuWOX12在GA3處理下，3 h時在甘草根中被誘導上調，推測外源施加GA3可能通過增加植物體內GA含量，調節(jié)甘草生長發(fā)育。在ABA處理下，甘草根中5個GuWOX基因在處理6 h時均被誘導上調表達，此外，順式作用元件分析表明這5個GuWOX基因均具有ABA響應元素。ABA在植物抵御干旱脅迫的機制中作為一種化學信號，通過誘導植物氣孔關閉，減少蒸騰作用導致的水分散失，從而有助于植物保存水分[33-34]。GuWOX15應答干旱脅迫及外源ABA處理的表達模式相近，干旱和ABA處理12 h時均上調表達，這與桑樹中BpWOX8被這兩種處理誘導上調的結果一致[35]。因此，GuWOX基因家族可能通過介導植物激素調節(jié)途徑，在植物生長、發(fā)育和抵御逆境脅迫中發(fā)揮作用。

本研究獲得了16個GuWOX基因分為3個分支，熒光定量結果表明，GuWOX1在側根中的表達量較高，GuWOX15在莖中的表達量較高。GuWOX1、GuWOX5、GuWOX6、GuWOX12和GuWOX15在非生物脅迫和激素處理的不同時間被誘導上調表達，表明了GuWOX參與甘草生長發(fā)育、逆境脅迫的應答以及植物激素調節(jié)，并且克隆得到GuWOX1、GuWOX5、GuWOX6、GuWOX12共4個基因，分別編碼184、237、237、191個氨基酸。后續(xù)將對其功能及其調控機制進行研究，為甘草抗逆新品種選育提供參考。