劉敏，宣自華，丁捷敏，孟祥文，賈曉益*

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,安徽 合肥 230012；2.安徽省中藥復(fù)方重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230012;3.安徽省中藥研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230012)

二妙散源于元代醫(yī)家朱丹溪的《丹溪心法》，由蒼術(shù)和黃柏1∶1配伍而成,主治濕熱下注、下焦?jié)癔彙⒆阆ゼt腫熱痛。在中醫(yī)基礎(chǔ)理論中二妙散是清熱燥濕的基礎(chǔ)名方[1]。其中黃柏為君藥，是蕓香科黃檗屬植物黃柏或黃皮樹的干燥樹皮，其味苦、性寒，歸腎、膀胱經(jīng)[2]。藥典記載主要功效為清熱燥濕、瀉火除蒸、解毒療瘡；蒼術(shù)為菊科植物北蒼術(shù)或茅蒼術(shù)的干燥根莖，其味甘而辛烈，性溫而燥，化濕運(yùn)脾，用于濕阻中焦，風(fēng)濕痹痛，眼目昏澀。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，黃柏中主要含有生物堿類，甾醇類，內(nèi)脂等化學(xué)成分[3]，蒼術(shù)根莖主要含有揮發(fā)油，油中主要含有β-桉油、蒼術(shù)醇、蒼術(shù)素等成分[4]。黃柏和蒼術(shù)具有抗菌、抗炎、止痛、改善機(jī)體免疫功能等作用[5-10]。在現(xiàn)代臨床上二妙散主要用于抗炎免疫的治療[11-12]。黃敬文等[13]人報(bào)道二妙散能夠保持Th1/Th2細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡從而改善銀屑病的發(fā)展。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)二妙散水提取物對(duì)AA大鼠模型有治療作用，能明顯降低關(guān)節(jié)炎大鼠病理變化[14]。還有文獻(xiàn)報(bào)道二妙散在共煎的過程中能促進(jìn)有效成分的溶出，具有更強(qiáng)的抗氧化作用[15]，所以二妙散在臨床應(yīng)用中具有廣闊的前景。但是，關(guān)于二妙散的急性毒性研究未見報(bào)道，本試驗(yàn)根據(jù)最大給藥劑量法[16]，將通過灌胃給予小鼠二妙散水提液，評(píng)價(jià)二妙散的安全性，為二妙散的抗炎免疫調(diào)節(jié)機(jī)制研究及臨床應(yīng)用提供基礎(chǔ)資料。

1 材料

1.1 動(dòng)物

選用SPF級(jí)健康適齡昆明小鼠40只，體質(zhì)量20～22 g，雌雄各半，購(gòu)于安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK(皖)2017—001。小鼠稱量體質(zhì)量后隨機(jī)分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)期間自由進(jìn)食飲水，環(huán)境適宜。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。

1.2 藥物

1.2.1 二妙散水提液的制備

蒼術(shù)、黃柏中藥飲片購(gòu)自于安徽省草藥制品有限公司(安徽省亳州市)。稱取蒼術(shù)、黃柏各200 g，加10倍水浸泡2 h，用武火煮沸后改用文火煎煮1.5 h。再分別以8倍水、6倍水先武后文煎煮1 h、0.5 h，合并3次濾液，濃縮至153 mL，最終生藥量為2.613g·mL-1(剛好能自由通過灌胃針頭的最大濃度)。密封分裝于4 ℃冰箱保存。

1.3 儀器設(shè)備及主要試劑

美菱醫(yī)用冷藏箱(YC-260L，中科美菱低溫科技股份有限公司)； 電子天平(mL104/02，梅特勒-托利多儀器上海有限公司)；血液細(xì)胞分析儀(希森美康XT4000i);生化分析儀(貝克曼 AU5800)；D-37520低溫高速離心機(jī)(Thermo scientific，美國(guó))；主要生化試劑購(gòu)自美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司。

2 方法

2.1 預(yù)試驗(yàn)

二妙散水提液組給藥劑量為209.04 g·kg-1的小鼠給藥后死亡2只，給藥量為156.78 g·kg-1的小鼠死亡1只，給藥量為130.65 g·kg-1和104.52 g·kg-1的小鼠未見死亡。因?yàn)橹滤缆饰催_(dá)70%，而且水提液的藥物濃度和給藥體積已經(jīng)達(dá)到最大限度。根據(jù)毒理學(xué)和中藥藥理實(shí)驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)，無法測(cè)出二妙散水提液的半數(shù)致死量(LD50)。因此我們對(duì)二妙散水提液進(jìn)行最大耐受量試驗(yàn)。

2.2 正式試驗(yàn)

2.2.1 最大耐受量試驗(yàn)

取SPF級(jí)昆明小鼠40只，雌雄各半。常規(guī)飼養(yǎng)一周后隨機(jī)分為二妙散水提液組和正常對(duì)照組并標(biāo)記稱重，每組20只。在禁食不禁水12 h后，水提液組用最大灌胃濃度2.613 g·mL-1，最大灌胃體積0.25 mL·10 g-1給小鼠灌胃，正常對(duì)照組灌等量生理鹽水。每日2次，間隔8 h，第二次給藥前4 h繼續(xù)禁食不禁水，然后兩組進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng)，連續(xù)觀察14 d。

2.2.2 指標(biāo)觀察及檢測(cè)

在給藥后4 h內(nèi)密切觀察小鼠的死亡情況，4 h穩(wěn)定之后在試驗(yàn)期間，每天上午和下午分別對(duì)小鼠進(jìn)行觀察，并記錄試驗(yàn)小鼠的行為活動(dòng)、外觀變化、器官分泌物、大小便、精神狀態(tài)、呼吸狀態(tài)和死亡情況；記錄給藥前1天和給藥后第7天、14天的體質(zhì)量變化；第14天觀察結(jié)束，禁食不禁水12 h后，摘除小鼠眼球取血，一部分放入抗凝管，用作血常規(guī)檢測(cè)。另一部分放入EP管中，靜置3 h后3 000 r·min-1離心15 min，取上清用作血液生化指標(biāo)檢測(cè)；解剖小鼠，摘取心、肝、脾、肺、腎等主要臟器，先肉眼觀察有無大小、顏色改變，有無結(jié)節(jié)、腫瘤和壞死現(xiàn)象。再剔除多余的結(jié)締組織，稱重后用于計(jì)算主要臟器系數(shù)，臟器指數(shù)=臟器濕重/質(zhì)量(mg·g-1)；然后將主要臟器用10%福爾馬林溶液固定，再用5% HNO3脫鈣，石蠟包埋、切片，進(jìn)行HE染色，用光學(xué)顯微鏡觀察各臟器病理組織學(xué)變化。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本試驗(yàn)用SPSS23.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，在數(shù)據(jù)資料符合正態(tài)分布的情況下，采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間應(yīng)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 二妙散對(duì)小鼠一般生理狀態(tài)影響

觀察表明，水提液組在給藥2 h內(nèi)小鼠精神萎靡，活動(dòng)和攝食飲水減少。有稀便現(xiàn)象，且大便次數(shù)增加。兩組口、鼻、眼、耳、均未見異常分泌物。8 h后水提液組小鼠精神狀態(tài)恢復(fù)，活動(dòng)增加，攝食飲水恢復(fù)正常。連續(xù)觀察14 d，給藥組小鼠行為活動(dòng)、精神狀態(tài)、呼吸運(yùn)動(dòng)、攝食飲水、大小便等情況與正常對(duì)照組相比無明顯差異，并且觀察期間，水提液組和空白組均未見小鼠死亡。

3.2 對(duì)小鼠體質(zhì)量變化的影響

試驗(yàn)期間，分別記錄各組小鼠給藥前和給藥后第7天、14天的體質(zhì)量。由表1可見水提液組在給藥后體質(zhì)量正常增加，第7天和第14天后的體質(zhì)量與正常對(duì)照組相比無顯著性差異(P>0.05)。

表1 二妙散水提液對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響

3.3 對(duì)小鼠血常規(guī)的影響

收集實(shí)驗(yàn)小鼠的血液樣本進(jìn)行血常規(guī)檢測(cè)，由表2可見水提液組的血小板(PLT)、血紅蛋白(HGB)、白細(xì)胞(WBC)、紅細(xì)胞(RBC)分別與正常對(duì)照組相比均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 二妙散水提液對(duì)小鼠血常規(guī)的影響

3.4 對(duì)小鼠血液生化指標(biāo)的影響

收集實(shí)驗(yàn)小鼠的血清，用全自動(dòng)生化儀分析谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)的含量，如表3所示，水提液組小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)的含量與正常對(duì)照組相比無顯著性差異(P>0.05)。

表3 二妙散水提液對(duì)小鼠血液生化指標(biāo)的影響

3.5 對(duì)小鼠主要臟器系數(shù)的影響

解剖小鼠，摘取心、肝、脾、肺、腎等主要臟器，先肉眼觀察心、肝、脾、肺、腎大小、顏色、有無明顯改變。再剔除多余的結(jié)締組織，稱重后計(jì)算臟器系數(shù)，比較各組間臟器系數(shù)的變化。由表4可見水提液組小鼠的心、肝、脾、肺、腎系數(shù)與正常對(duì)照組相比無顯著性差異(P>0.05)。

表4 二妙散水提液對(duì)小鼠臟器系數(shù)的影響

3.6 小鼠主要臟器病理組織學(xué)檢測(cè)

摘取試驗(yàn)小鼠心、肝、脾、肺、腎等重要臟器，肉眼可觀察到主要臟器大小、顏色、結(jié)構(gòu)均正常。病理組織學(xué)切片結(jié)果也表明水提液組與正常對(duì)照組相比均未見明顯病變。說明本試驗(yàn)二妙散水提液對(duì)檢測(cè)小鼠主要臟器沒有造成急性損傷，見圖1。

注：A.心臟；B.肝臟；C.脾臟；D.肺臟；E.腎臟。圖1 小鼠主要臟器HE染色圖(×100)

4 討論

二妙散作為清熱燥濕藥的基礎(chǔ)名方，在臨床上對(duì)于關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)等具有良好的治療作用。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，研究者從細(xì)胞水平以及分子生物學(xué)角度研究了二妙散對(duì)于抗炎免疫的可能作用機(jī)制。多種研究證據(jù)表明，二妙散以黃柏和蒼術(shù)1∶1為最佳比例,通過抑制IL-1β、TNF-α等炎癥因子的產(chǎn)生從而減輕炎癥的發(fā)生與發(fā)展，機(jī)體免疫調(diào)節(jié)的失衡都會(huì)導(dǎo)致炎癥因子的產(chǎn)生。雖然二妙散的藥用價(jià)值高，但中藥成分復(fù)雜，存在多種生物活性成分，其安全性和毒副作用也備受關(guān)注。急性毒性實(shí)驗(yàn)是指在24 h內(nèi)動(dòng)物接受藥物1～2次，觀察給藥后7～14 d內(nèi)動(dòng)物所產(chǎn)生的急性中毒反應(yīng)[17]。本實(shí)驗(yàn)遵循《中藥新藥研制開發(fā)技術(shù)與方法》中“中藥、天然藥物急性毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則”設(shè)計(jì)了二妙散水提液的急性毒性試驗(yàn)研究。

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果顯示二妙散水提液給藥量大于130.65 g·kg-1時(shí)小鼠出現(xiàn)致死現(xiàn)象，這可能是由于藥物濃度過大導(dǎo)致，也提示我們藥物共煎過程中可能會(huì)產(chǎn)生復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)從而會(huì)有“增毒、減毒”的作用。最大耐受量結(jié)果顯示，與正常組比，水提液組在給藥2 h內(nèi)小鼠精神萎靡，活動(dòng)和攝食飲水減少，出現(xiàn)大便稀薄的現(xiàn)象，且大便次數(shù)增加。這可能是由于高劑量的藥物對(duì)于胃腸道存在一定的刺激。兩組眼、耳、口、鼻均未見異常分泌物。8 h后水提液組小鼠精神狀態(tài)恢復(fù)，活動(dòng)增加，攝食飲水恢復(fù)正常。連續(xù)觀察14 d，給藥組小鼠行為活動(dòng)、精神狀態(tài)、呼吸運(yùn)動(dòng)、攝食飲水、大小便等情況與正常對(duì)照組相比無明顯差異。水提液組與正常組相比體質(zhì)量均增加，且無顯著性差異(P>0.05)。與正常組相比，兩組給藥組臟器系數(shù)無顯著性差異(P>0.05)。進(jìn)一步對(duì)主要臟器病理形態(tài)學(xué)進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示各組小鼠均未出現(xiàn)由受試藥物引起的中毒性的病理改變。血常規(guī)和血液生化指標(biāo)也顯示各組間并無顯著性差異(P>0.05)。

綜上所述，通過二妙散水提液的最大耐受量試驗(yàn)，對(duì)昆明小鼠的急性毒性結(jié)果顯示，試驗(yàn)小鼠在給藥量為130.65 g·kg-1時(shí)各檢測(cè)指標(biāo)均無顯著性差異，表明二妙散水提液最大耐受量為130.65 g·kg-1，在大于該劑量時(shí)會(huì)產(chǎn)生毒性作用。