藺曉源，鄧娜，夏旭婷，劉富林

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208)

腸易激綜合征(Irritable Bowel Syndrome，IBS)是一種以腹痛不適，排便習(xí)慣或大便性狀改變?yōu)橹饕憩F(xiàn)的功能性胃腸病。其全球患病率約為9%～20%，我國(guó)IBS的患病率地區(qū)差異較大，約在7%～11%[1]。臨床以腹瀉型腸易激綜合征(Diarrhea irritable bowel syndrome，IBS-D)最為常見，占整個(gè)IBS的74%[2]。IBS-D屬中醫(yī)“泄瀉”的范疇，發(fā)病機(jī)制尚不明確，至今亦無最佳治療方案。目前一致認(rèn)為，腦腸軸調(diào)控紊亂在IBS-D的發(fā)病中起主要作用[3]，而四神丸臨床用于治療IBS-D效果顯著[4-5]。因此，為了進(jìn)一步明確四神丸治療IBS-D的腦腸調(diào)控機(jī)制，本研究觀察了四神丸對(duì)IBS-D模型大鼠腦腸組織中腦腸肽胃促生長(zhǎng)素(Ghrelin)及其受體GHSR表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與藥物

SPF級(jí)雄性SD大鼠，60只，體質(zhì)量(200±20)g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，合格證號(hào)：SCXK(湘)2016-002。

四神丸，北京同仁堂天然藥物唐山有限公司生產(chǎn)(國(guó)藥準(zhǔn)字Z13020656)，用蒸餾水配制成濃度分別為0.732、0.366、0.183 g/mL的混懸液冰箱保存。得舒特，法國(guó)蘇威制藥公司生產(chǎn)(注冊(cè)證號(hào)H20120127)，用蒸餾水配制成濃度為1.523 mg/mL的混懸液冰箱保存。番瀉葉，購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院(符合國(guó)家藥典標(biāo)準(zhǔn))，傳統(tǒng)方法煎煮后濃縮成1.0 g/mL的藥液冰箱保存。

1.2 主要試劑與儀器

Ghrelin、GHSR兔抗多克隆抗體(Abcam，GR71314-1、GR80260-1)，PV-6001兔二步法試劑盒、ZLI-9018 DAB顯色試劑盒(中杉金橋)。賽默飛HistoStar包埋機(jī)、HM325輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)，奧林巴斯BX43熒光顯微鏡，海爾DW-86L386超低溫冰箱。

1.3 動(dòng)物分組與模型制備

先隨機(jī)取10只大鼠為正常組，其余設(shè)為造模組，參考文獻(xiàn)方法[6]采用番瀉葉灌胃加避水應(yīng)激法建立IBS-D大鼠模型。每天番瀉葉灌胃(10 mL/kg)，連續(xù)28 d后進(jìn)行避水應(yīng)激：每天上午將大鼠置于玻璃水槽內(nèi)的中央平臺(tái)上1 h，連續(xù)10 d。造模結(jié)束后再將模型大鼠隨機(jī)分為模型組、得舒特組和四神丸高、中、低劑量組，每組10只。

1.4 給藥與標(biāo)本采集

四神丸低、中、高劑量組給予1、2、4倍臨床等效劑量(1.83 mg/kg、3.66 mg/kg、 7.32 mg/kg)的四神丸混懸液灌胃，得舒特組給予臨床等效劑量(15.23 mg/kg)的得舒特混懸液灌胃，模型組給予蒸餾水灌胃，正常組常規(guī)喂養(yǎng)。連續(xù)給藥14 d。大鼠末次給藥后10%水合氯醛麻醉，冰盒上開顱取腦，后腹腔剪取小段十二指腸，PBS液漂洗后放入4%多聚甲醛固定液中。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 大鼠的排便情況觀察

在給藥前后將所有大鼠單獨(dú)放入墊有濾紙的小飼養(yǎng)籠內(nèi)，記錄每只在上午8—12時(shí)期間的稀便數(shù)和正常糞便數(shù)，并計(jì)算稀便率，稀便率=稀便數(shù)/(稀便數(shù)+正常糞便數(shù))×100%[7]。

1.5.2 大鼠的腸道動(dòng)力檢測(cè)

給藥前后各組大鼠禁食不禁水24 h，10%水合氯醛麻醉，將直徑為3 mm的玻璃小球放入距肛門 3 cm處的直腸內(nèi)，待大鼠蘇醒后放入墊有濾紙的籠內(nèi)單獨(dú)飼養(yǎng)，觀察并記錄大鼠直腸內(nèi)玻璃小球的排出時(shí)間[8]。

1.5.3 大鼠腦腸組織Ghrelin、GHSR的陽(yáng)性表達(dá)檢測(cè)

每組隨機(jī)取出5個(gè)腦腸組織標(biāo)本，石蠟包埋、切片脫蠟，滅活內(nèi)源性過氧化酶，微波抗原熱修復(fù)、封閉，依次滴加一抗(Ghrelin、GHSR)4 ℃過夜、滴加二抗37 ℃孵育30 min、滴加SABC 37 ℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染、封片。使用圖像分析軟件拍攝200倍鏡下圖像，選取400倍鏡下陽(yáng)性表達(dá)不重復(fù)的5個(gè)視野，分析Ghrelin、GHSR免疫陽(yáng)性染色的平均OD值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 四神丸對(duì)稀便率的影響

給藥前與正常組比較，各組大鼠的稀便率均升高(P<0.01)，且組間差異不顯著(P>0.05)。給藥后與正常組比較，模型組大鼠的稀便率升高(P<0.01)；與模型組比較，各給藥組的稀便率均明顯下降(P<0.01) ，且以四神丸高劑量組下降最為明顯(P<0.01)，其余治療組之間差異不顯著(P>0.05)，見表1。

表1 各組大鼠稀便率比較

2.2 四神丸對(duì)玻璃小球排出時(shí)間的影響

給藥前與正常組比較，各組大鼠的玻璃小球排出時(shí)間均減少(P<0.01)，且組間差異不顯著(P>0.05)。給藥后與正常組比較，模型組大鼠的玻璃小球排出時(shí)間顯著減少(P<0.01)；與模型組比較，各給藥組的玻璃小球排出時(shí)間均明顯增加(P<0.01) ，給藥組之間的差異不顯著(P>0.05)，見表2。

表2 各組大鼠玻璃小球排出時(shí)間比較

2.3 四神丸對(duì)下丘腦Ghrelin、GHSR表達(dá)的影響

Ghrelin、GHSR免疫陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)在下丘腦中為棕黃色或棕褐色染色。模型組Ghrelin、GHSR表達(dá)均較正常組明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，各給藥組均可下調(diào)Ghrelin、GHSR的陽(yáng)性表達(dá)(P<0.05)，且四神丸高劑量組的Ghrelin表達(dá)低于低劑量組(P<0.05)；而四神丸高、中劑量組與得舒特組的Ghrelin表達(dá)比較差異不顯著(P>0.05)，各給藥組的GHSR表達(dá)之間比較差異亦不顯著(P>0.05)，見表3，圖1、2。

表3 各組大鼠下丘腦Ghrelin、GHSR表達(dá)比較

2.4 四神丸對(duì)十二指腸Ghrelin、GHSR表達(dá)的影響

Ghrelin、GHSR免疫陽(yáng)性表達(dá)在十二指腸組織中分布廣泛,在黏膜固有層、肌層平滑肌中均勻分布，呈棕黃色染色，其在模型組中的表達(dá)均顯著高于正常組(P<0.01)。各給藥組Ghrelin表達(dá)減少，與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，且四神丸高劑量組和得舒特組優(yōu)于低劑量組(P<0.05)。除四神丸低劑量組外，其余各給藥組GHSR表達(dá)減少，與模型組比較差異均有顯著性(P<0.05)，且四神丸高、中劑量組和得舒特組優(yōu)于低劑量組(P<0.05)。對(duì)Ghrelin、GHSR陽(yáng)性表達(dá)的影響，四神丸高、中劑量組與得舒特組比較差異均不顯著(P>0.05)，見表4，圖3、4。

圖1 各組大鼠下丘腦Ghrelin陽(yáng)性表達(dá)(×200)

圖2 各組大鼠下丘腦GHSR陽(yáng)性表達(dá)(×200)

圖3 各組大鼠十二指腸Ghrelin陽(yáng)性表達(dá)(×200)

圖4 各組大鼠十二指腸GHSR陽(yáng)性表達(dá)(×200)

表4 各組大鼠十二指腸Ghrelin、GHSR陽(yáng)性表達(dá)的平均OD值比較

3 討論

目前雖然IBS-D的病因病機(jī)尚不明確，但多數(shù)研究已證實(shí)其與內(nèi)臟高敏感、腸道動(dòng)力改變及腦腸軸異常等多因素有關(guān)。腸道動(dòng)力改變一直被視為IBS病發(fā)病機(jī)制的主要環(huán)節(jié)，與腦腸軸調(diào)節(jié)失衡、腸道菌群失調(diào)等因素有關(guān)，是IBS-D出現(xiàn)大便稀薄、次數(shù)增多的重要原因[9]。而腦腸軸調(diào)控障礙又可通過兼具神經(jīng)遞質(zhì)與內(nèi)分泌激素雙重身份的腦腸肽在外周和中樞水平形成一個(gè)協(xié)調(diào)統(tǒng)一的整體，調(diào)節(jié)著胃腸運(yùn)動(dòng)、感覺及分泌等復(fù)雜功能[10]。正基于此，羅馬Ⅳ標(biāo)準(zhǔn)將包括IBS在內(nèi)的功能性胃腸病，重新定義為腦-腸互動(dòng)異常。有臨床研究發(fā)現(xiàn)，脾虛型IBS-D患者血清中促胃腸動(dòng)力的腦腸肽5-HT、SP含量增加，而抑胃腸動(dòng)力的腦腸肽VIP含量減少，說明腦腸肽調(diào)控在IBS-D的發(fā)病中起重要作用[11]。

Ghrelin是一種主要由胃組織X/A 樣細(xì)胞分泌的腦腸肽，在腸道、下丘腦、垂體等組織中也有合成，其調(diào)節(jié)攝食、胃腸動(dòng)力等多種胃腸道生理作用主要由其受體GHSR所介導(dǎo)，可經(jīng)旁分泌、自分泌、遠(yuǎn)距分泌等方式，通過腦腸軸間的神經(jīng)內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)直接或間接地參與胃腸道活動(dòng)[12]。有研究表明，IBS-D模型大鼠血清Ghrelin含量明顯增加[13]；GHSR缺陷(Ghsr-/-)小鼠胃排空的延遲可能與其GHSR的缺失及胃肌層中神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量的減少有關(guān)[14]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，脾腎陽(yáng)虛型IBS-D大鼠脊髓組織中Ghrelin、GHSR的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)增多，其mRNA表達(dá)也明顯增加[6]。本研究結(jié)果顯示，IBS-D大鼠下丘腦、十二指腸組織中Ghrelin、GHSR的陽(yáng)性表達(dá)也均明顯增強(qiáng)。

IBS-D屬中醫(yī)“泄瀉”范疇，病位在腸，脾失健運(yùn)是其關(guān)鍵，同時(shí)與腎密切相關(guān)。我們通過研究泄瀉的中醫(yī)證型、證候等分布規(guī)律發(fā)現(xiàn)，泄瀉中脾腎陽(yáng)虛證的證型比例在9.21%以上[15-16]。四神丸是治療脾腎陽(yáng)虛型泄瀉的經(jīng)典名方。方中君以補(bǔ)骨脂溫腎助陽(yáng)、壯火益土、暖脾止瀉；臣以肉豆蔻溫中澀腸；佐以吳茱萸助陽(yáng)止瀉，五味子收斂固澀。我們的Meta分析結(jié)果表明，四神丸治療IBS-D臨床有效率優(yōu)于西藥組，且安全性更高[17]。也有研究顯示，四神丸治療IBS-D的作用與保護(hù)腸黏膜屏障、改善腸道運(yùn)動(dòng)和內(nèi)在敏感性有關(guān)[18]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，四神丸可影響脾腎陽(yáng)虛型IBS-D大鼠結(jié)腸CRF的蛋白和mRNA表達(dá)[19]，亦可降低模型大鼠脊髓組織中Ghrelin、GHSR的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和mRNA表達(dá)[6]。

本研究采用番瀉葉灌胃加避水應(yīng)激法建立大鼠模型，發(fā)現(xiàn)模型大鼠的稀便率升高，玻璃小球排出時(shí)間減少，表明該模型改變了大鼠的腸道功能，與IBS-D患者的臨床癥狀相似。模型組的稀便率升高提示模型大鼠呈腹瀉狀態(tài)，四神丸各劑量組的稀便率均明顯下降，表明四神丸能改善IBS-D模型大鼠的腹瀉狀態(tài)。模型組的玻璃小球排出時(shí)間減少提示模型大鼠的腸道轉(zhuǎn)運(yùn)功能發(fā)生改變，四神丸各劑量組的玻璃小球排出時(shí)間均明顯增加，表明四神丸能改善IBS-D模型大鼠的腸道轉(zhuǎn)運(yùn)功能。此外，四神丸各劑量均可下調(diào)下丘腦中Ghrelin、GHSR和十二指腸中Ghrelin的陽(yáng)性表達(dá)(P<0.01)，且四神丸高劑量?jī)?yōu)于其低劑量(P<0.05)；四神丸高、中劑量亦均可降低十二指腸中GHSR的陽(yáng)性表達(dá)(P<0.05)，且優(yōu)于其低劑量(P<0.05)。該結(jié)果表明四神丸治療IBS-D具有一定的劑量依賴性，其對(duì)IBS-D腸道運(yùn)動(dòng)的調(diào)控作用可能與調(diào)節(jié)Ghrelin及其受體GHSR在腦腸互動(dòng)中的表達(dá)密切有關(guān)，可為探明四神丸治療IBS-D的腦腸肽胃腸運(yùn)動(dòng)調(diào)控機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。