石孟瑤，朱潔，方莉，童佳兵，王小樂(lè)，高雅婷，劉桐，李澤庚，*

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230038；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，安徽 合肥 230031)

慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary diseases，COPD)是一種進(jìn)行性和損傷肺血管、肺實(shí)質(zhì)以及氣道的慢性疾病[1]。肺動(dòng)脈高壓(pulmonary artery hypertension，PH)作為COPD的常見(jiàn)合并病，是導(dǎo)致COPD預(yù)后不良的重要因素。肺血管重塑是PH的重要病理改變，表現(xiàn)為肺血管壁增厚導(dǎo)致的管腔狹窄，血流阻力增加[2-3]。早期對(duì)肺血管重構(gòu)及時(shí)干預(yù)，控制COPD進(jìn)一步發(fā)展合并PH，對(duì)降低病死率至關(guān)重要。而肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與凋亡失衡，肺內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，平滑肌細(xì)胞(pulmonary arterial smooth muscle cell，PASMCs )過(guò)度增殖遷移是促使肺血管重構(gòu)的主要機(jī)制之一[4]。因此，干預(yù)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與凋亡失衡是防治COPD合并肺動(dòng)脈高壓的有效方法。

COPD屬中醫(yī)學(xué)的“肺脹”“喘病”等范疇，該病主要病理特點(diǎn)為本虛標(biāo)實(shí)，虛病位主累及肺、脾、腎三臟，標(biāo)實(shí)主要指痰濁、血瘀[5-6]。清張璐《張氏醫(yī)通 肺萎肺脹》曰：“痰夾瘀血礙氣而脹”[7]，從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)角度出發(fā)，脈為血之府，肺血管重構(gòu)相關(guān)病變類似于血脈不利導(dǎo)致血液瘀阻，肺為儲(chǔ)痰之器，痰瘀互結(jié)聚于肺，辨為痰瘀阻肺之證[8]。前期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明芪白平肺膠囊能夠干預(yù)肺血管重構(gòu)的[9]，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明芪白平肺膠囊可以通過(guò)線粒體凋亡途徑，降低低氧造模下的PASMCs中Bcl-2水平，提高Bax的水平，抑制了PASMCs增殖能力[10]，但其相關(guān)的體內(nèi)機(jī)制有待進(jìn)一步明確。為此，本研究在前期研究基礎(chǔ)上觀察芪白平肺膠囊對(duì)COPD痰瘀阻肺大鼠肺血管的凋亡/增殖程度的影響，探究其改善COPD合并PH的可能機(jī)制。

1 材料及方法

1.1 主要儀器

香煙煙熏箱(自制,長(zhǎng)130 cm×寬80 cm×高75 cm)；臺(tái)式冷凍離心機(jī)(安徽，嘉文儀器裝備有限公司)；生物組織自動(dòng)脫水機(jī)(湖北，亞光)；生物組織包埋機(jī)(湖北，亞光)；徠卡切片機(jī) (德國(guó)，Leica)；顯微鏡(日本，OLYMPUS)；熒光定量PCR儀(美國(guó)，Thermo Scientific)。

1.2 主要試劑與藥品

芪白平肺膠囊由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑中心提供；雄獅牌香煙(焦油：11 mg，煙堿：1.2 mg，浙江中煙工業(yè)公司)；大鼠血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF);ELISA試劑盒(武漢 基因美，JYM0634Ra)；Trizol(America Life technogies，251804)，Novostart SYBR qPCR SuperMix Plus(上海，novoprotein，1910G08)，PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(大連，TaKaRa，AJ51485A)，兔抗大鼠Bax抗體(上海 abcam，ab32503)；兔抗大鼠Bcl-2抗體(上海 abcam，ab32124)，通用型二抗試劑盒(北京 Zsbio，PV-6000)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠，由山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK20190003。安徽中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物房飼養(yǎng)，自由取食、飲水，保持室內(nèi)溫度(22～24℃)及相對(duì)濕度(40%～50%)穩(wěn)定，采光好，室內(nèi)干凈整潔。

1.4 方法

1.4.1 模型建立及分組給藥

參照?qǐng)F(tuán)隊(duì)前期造模方法[11]建立COPD痰瘀阻肺證病證結(jié)合大鼠模型。30只SPF級(jí)大鼠隨機(jī)分成正常組、模型組、芪白平肺膠囊組(10只/組)。每天將模型組與芪白平肺膠囊組大鼠置于自制的1 m3熏煙箱內(nèi)煙熏，每天煙熏1 h，每次20支香煙。煙熏后將大鼠置于常壓低氧裝置內(nèi)，每天低氧5 h(氧濃度10%～10.5%，CO20.03%左右)。連續(xù)造模4周，6 d/周。正常組大鼠正常飼養(yǎng)。其中，芪白平肺膠囊組每天造模結(jié)束后予以藥物灌胃1次(10 mL/kg，每1 mL含芪白平肺膠囊0.1 g)，正常組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃。

1.4.2 肺組織病理檢查

取右肺上葉于4%甲醛固定48 h后進(jìn)行石蠟包埋、切片、制片，后進(jìn)行HE染色觀察肺組織病理形態(tài)。

1.4.3 ELISA檢測(cè)血清中VEGF的表達(dá)水平

大鼠末次給藥后，經(jīng)麻醉，腹主動(dòng)脈取血，經(jīng)4℃ 800×g離心15 min，取上層血清，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清中VEGF表達(dá)水平。

1.4.4 熒光定量PCR法檢測(cè)肺血管中Bax、Bcl-2基因表達(dá)

取適量組織充分研磨，加入1 mL Trizol，孵育10 min，12 000 r/min 4℃ 離心10 min，取上清液，加入一半體積無(wú)水乙醇，混勻，靜置2 min，12 000 r/min 4 ℃ 離心3 min，棄廢液，加入500 μL洗滌液，靜置2 min，12 000 r/min 4℃ 離心30 s，棄廢液。按說(shuō)明書(shū)準(zhǔn)備相應(yīng)反應(yīng)混合物，37 ℃，15 min；85 ℃，5 s，取出上述反應(yīng)液，即為cDNA，采用SYBR Green 熒光PCR檢測(cè)組織中的Bax、Bcl-2 mRNA表達(dá)。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列表

1.4.5 Western blot檢測(cè)肺血管組織的Bax、Bcl-2蛋白水平

分離肺葉外肺動(dòng)脈，按50 mg加入500 μLRIPA裂解液(含1 mmol PMSF)，冰上勻漿并裂解20 min后，經(jīng)12 000r/min 4 ℃,離心10 min后收集含有總蛋白的上清液，按1∶4比例加5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液和上清液，渦旋混勻后，100 ℃煮沸8 min制備樣品。待樣品冷卻到室溫后，Western blot法檢測(cè)樣品中Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)情況，其中Bax和Bcl-2抗體按1∶1 000比例稀釋，二抗按1∶10 000稀釋。

1.4.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺組織病理形態(tài)對(duì)比

正常組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)未見(jiàn)明顯破壞，肺血管管壁薄，內(nèi)皮細(xì)胞連續(xù)均勻排列，管壁各層未見(jiàn)明顯浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞、無(wú)明顯增生的平滑肌細(xì)胞。模型組可明顯看見(jiàn)肺泡結(jié)構(gòu)破壞，融合，管腔內(nèi)有滲出物，肺血管增厚明顯，管壁有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，管腔狹窄。芪白平肺膠囊組大鼠有少量肺泡壁結(jié)構(gòu)破壞，管壁各層有少許炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，肺血管增厚程度較模型組明顯減低，見(jiàn)圖1。

圖1 肺組織HE染色(×200)

2.2 血清中VEGF表達(dá)水平比較

與正常組相比，模型組的血清VEGF表達(dá)水平明顯升高(P<0.01)；與模型組相比，芪白平肺膠囊組VEGF水平明顯降低(P<0.01)，見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠血清VEGF水平比較

2.3 肺血管組織中的Bax、Bcl-2 mRNA表達(dá)

與正常組相比，模型組肺血管組織中Bax mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)，Bcl-2 mRNA表達(dá)明顯增多(P<0.01)；與模型組相比，芪白平肺膠囊組Bax mRNA表達(dá)增多(P<0.01)，Bcl-2 mRNA表達(dá)降低(P<0.01)，見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠組織Bax、Bcl-2mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

2.4 肺血管組織的Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)比較

與正常組相比，模型組肺血管組織中Bax蛋白表達(dá)水平降低(P<0.01)，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.01)；與模型組相比，芪白平肺膠囊組Bax蛋白表達(dá)相對(duì)增多(P<0.01)，Bcl-2蛋白表達(dá)降低(P<0.01),見(jiàn)表4。各組大鼠肺血管中Bax、Bcl-2蛋白條帶圖見(jiàn)圖2。

表4 各組大鼠肺血管組織Bax、Bcl-2蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

注：A.正常組；B.模型組；C.芪白平肺膠囊組。圖2 各組大鼠肺血管中Bax、Bcl-2蛋白條帶圖

3 討論

COPD在中醫(yī)屬于“肺脹”“喘證”等范疇，以虛為本，痰、瘀為標(biāo)，病位在肺，痰瘀阻肺證是COPD常見(jiàn)證型之一[12-13]，有研究基于數(shù)據(jù)挖掘法發(fā)現(xiàn)痰濕證、血瘀證是COPD穩(wěn)定期常見(jiàn)基礎(chǔ)證候[14]。用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)觀點(diǎn)聯(lián)系，可理解為肺血管與肺絡(luò)有一定關(guān)聯(lián)，肺絡(luò)受損與肺血管重構(gòu)有一定聯(lián)系[15]。肺血管壁主要分為3層：內(nèi)膜、中膜層、外膜層，當(dāng)受到低氧等刺激，肺血管各層均發(fā)生變化，其中主要由效應(yīng)細(xì)胞—PASMCs組成的中膜層異常肥大、增殖、遷移到內(nèi)膜層導(dǎo)致肺血管管腔狹窄[16]，血液循環(huán)不暢，機(jī)體處于高凝狀態(tài)，進(jìn)而發(fā)生肺動(dòng)脈高壓，導(dǎo)致肺心病。這種肺血管的異常增生狀態(tài)主要跟肺血管平滑肌細(xì)胞增殖及抵抗凋亡有關(guān)，也就是一種增殖與凋亡的失衡狀態(tài)[17]。芪平白肺膠囊功效主益氣活血化瘀，臨床上對(duì)COPD有一定療效，能夠干預(yù)肺血管重構(gòu)，延緩COPD進(jìn)一步發(fā)展成PH[18]。

Bcl家族蛋白在細(xì)胞凋亡機(jī)制中發(fā)揮著決定性作用，其中Bcl家族蛋白成員Bax促進(jìn)細(xì)胞凋亡，Bcl-2作為控制凋亡的關(guān)鍵蛋白可以結(jié)合Bax從而達(dá)到抗凋亡的效果[19-20]，研究發(fā)現(xiàn)香煙刺激下肺血管中Bax蛋白及mRNA表達(dá)降低，Bcl-2蛋白及mRNA表達(dá)升高且隨著吸煙時(shí)間增多而表達(dá)增加[21]。劉楊等[22]研究發(fā)現(xiàn)異綠原酸A可以降低成纖維細(xì)胞的Bcl-2表達(dá)，促進(jìn)Bax表達(dá)，促進(jìn)關(guān)節(jié)請(qǐng)內(nèi)成纖維細(xì)胞的凋亡，減弱成纖維細(xì)胞抗凋亡的能力，達(dá)到改善關(guān)節(jié)腔積液的效果。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明芪白平肺膠囊治療后的COPD痰瘀阻肺證大鼠，Bax基因及蛋白升高表達(dá)水平增高，Bcl-2基因及蛋白的表達(dá)降低，說(shuō)明芪白平肺膠囊能夠?qū)е路窝芷交〖?xì)胞趨向凋亡，起到抑制肺血管中細(xì)胞的增殖效果，改善血管管腔狹窄。

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是一種血管損傷因子，主要表達(dá)于血管平滑肌及氣道中，在吸煙、低氧、炎癥等刺激因素影響下，VEGF的分泌增多能夠，導(dǎo)致血管通透性增加及血管內(nèi)皮增殖，參與肺血管重構(gòu)[23]。研究發(fā)現(xiàn)溴域抑制劑可以通過(guò)抑制VEGF/PI3K/AKT通路，促進(jìn)Bax表達(dá)水平升高，降低Bcl-2表達(dá)水平，促進(jìn)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞凋亡[24]。謝文英等[25]研究發(fā)現(xiàn)二陳湯能夠降低COPD大鼠肺組織中VEGF水平從而抑制肺血管重構(gòu)。本研究結(jié)果顯示模型組的大鼠血清中VEGF的水平升高，而芪白平肺膠囊組的大鼠血清中VEGF水平降低，說(shuō)明芪白平肺膠囊可以降低VEGF水平抑制肺血管平滑肌細(xì)胞增殖及遷移，干預(yù)肺血管重構(gòu)。

本研究發(fā)現(xiàn)，芪白平肺膠囊改善COPD痰瘀阻肺證大鼠肺血管重構(gòu)的機(jī)制可能與降低了血清中VEGF的水平及調(diào)控Bax/Bcl-2蛋白的表達(dá)，改善血管凋亡與增值的失衡有關(guān)。然而芪白平肺膠囊是否通過(guò)下調(diào)VEGF水平抑制PI3K/AKT通路，增加肺血管中的Bax的含量，降低Bcl-2的含量還需進(jìn)一步研究。