黃睿臻，徐 勁，魏緒紅

（中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院生理教研室//疼痛研究中心，廣東廣州 510080）

長(zhǎng)春新堿和鉑類藥物等癌癥化療藥物的使用常常會(huì)引起外周神經(jīng)病變（chemotherapy-induced peripheral neuropathy，CIPN）。CIPN 主要表現(xiàn)為本來(lái)不引起疼痛的機(jī)械刺激及冷熱刺激所誘發(fā)的疼痛［1］。CIPN 限制化療藥物的使用并嚴(yán)重影響病人的生活質(zhì)量［2］，目前尚沒(méi)有較好的治療方法。因此，我們需要另一種新的有效的治療或預(yù)防CIPN的策略。病人腓腸神經(jīng)活檢和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，化療導(dǎo)致外周傳導(dǎo)觸壓覺的有髄傳入纖維丟失［3］，這可以解釋化療病人觸壓覺遲鈍。但是，肢體末梢麻木伴有劇烈疼痛的機(jī)制則不清楚。眾所周知，慢性疼痛是由C 纖維傳導(dǎo)的，而C 纖維又分為肽能和非肽能兩大類，前者表達(dá)IB4，投射到脊髓背角Ⅱ板層的內(nèi)側(cè)，而后者表達(dá)降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene related peptide，CGRP）、神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體TrkA和P物質(zhì)，投射到脊髓背角Ⅰ板層和Ⅱ板層的外側(cè)，直接與背角表達(dá)神經(jīng)激肽-1 受體（neurokinin-1 receptor，NK-1R）的神經(jīng)元形成突觸［4］。NK-1R 陽(yáng)性神經(jīng)元投射到高位中樞（丘腦和臂旁核）。研究表明，選擇性地去除脊髓背角NK-1R 陽(yáng)性投射神經(jīng)元可防止炎性痛和神經(jīng)病理性疼痛［5］。我們之前的研究表明，長(zhǎng)春新堿可引起脊髓背角CGRP 非肽能C 纖維芽生，但不能引起IB4肽能C 纖維芽生，這一變化可能是引起化療后疼痛產(chǎn)生的重要原因［6］。彌可保（甲鈷胺，McB）是包含鈷元素的一種維生素B12，對(duì)神經(jīng)組織有很強(qiáng)的親和作用。彌可保對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)有著重要的功能，如，促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)［7］。彌可保也可以顯著提高DNA 甲基化，并已有報(bào)道其可以調(diào)節(jié)糖尿病神經(jīng)病理性疼痛［8］、神經(jīng)損傷［9］、慢性壓迫性神經(jīng)損傷所引起的痛覺過(guò)敏［10］或帶狀皰疹后遺神經(jīng)痛［11］。目前彌可保用于治療糖尿病引起的周圍神經(jīng)病變［12］。但另一項(xiàng)研究報(bào)道，彌可保對(duì)腰椎狹窄引起的疼痛無(wú)效［13］。我們之前的研究報(bào)道，彌可保能防止長(zhǎng)春新堿誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛，但其機(jī)制目前仍不清楚。脊髓背角C 纖維誘發(fā)電位被認(rèn)為是神經(jīng)病理性疼痛的突觸模型，在本部分內(nèi)容中，我們將研究預(yù)防性給予彌可保對(duì)長(zhǎng)春新堿誘導(dǎo)的脊髓背角C 纖維誘發(fā)電位的影響，并進(jìn)一步觀察彌可保對(duì)脊髓背角核因子κB（NF-κB）信號(hào)通路激活的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)采用成年Sprague-Dawley（SD）大鼠，雄性，180～200 g，購(gòu)于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物的使用協(xié)議和動(dòng)物處理程序獲得了中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與使用委員會(huì)（IACUC）的批準(zhǔn)。動(dòng)物被分籠飼養(yǎng)并能夠自由獲取標(biāo)準(zhǔn)嚙齒動(dòng)物食物和水，室溫保持在（25 ± 1）℃，濕度保持在50%～60%，并處于12 h白天-黑夜循環(huán)照明的環(huán)境。所有的動(dòng)物被隨機(jī)分配到不同的處理組。

1.2 藥品

長(zhǎng)春新堿（深圳萬(wàn)樂(lè)藥業(yè)有限公司，中國(guó)）用無(wú)菌生理鹽水配成50 μg/mL，密封、遮光保存于4 ℃；以每天0.1 mg/kg 的劑量對(duì)大鼠腹腔注射上述長(zhǎng)春新堿溶液，連續(xù)給藥10 d，每天1次［6］以建立化療藥物誘導(dǎo)的疼痛模型。彌可保注射液（0.5 mg/mL，衛(wèi)材株式會(huì)社，日本）密封、遮光保存于4 ℃。因化療性藥物誘導(dǎo)的疼痛治療難度大于預(yù)防性給藥，我們選擇于腹腔注射長(zhǎng)春新堿造模前的15 d開始預(yù)先使用上述彌可保注射液對(duì)大鼠進(jìn)行預(yù)防性給藥，以1 mg/kg［14］的劑量每隔一天腹腔注射給藥1次，直到最后1 次長(zhǎng)春新堿給藥后的第9 d（即第1次給長(zhǎng)春新堿后19 d），如兩個(gè)藥物需要同一天給藥，則彌可保在長(zhǎng)春新堿注射之前30 min給藥。具體給藥方式見圖1。

圖1 大鼠實(shí)驗(yàn)分組給藥及其實(shí)驗(yàn)情況Fig.1 The drug administration in different groups of rats and the experimental timeline

1.3 50%機(jī)械刺激撤足閾值測(cè)定

于測(cè)試前3 d將大鼠放置于透明有機(jī)玻璃箱內(nèi)適應(yīng)環(huán)境，每次20 min 以上，每天1 次。正式測(cè)試時(shí)待大鼠安靜后，采用Chaplan 等［15］提出的Up-Down 方法，選10 根強(qiáng)度呈對(duì)數(shù)遞增方式的纖維毛（von Frey hairs，3.84，4.08，4.17，4.31，4.56，4.74，4.93，5.07，5.18，5.46，Aesthesio，Italy）分別對(duì)大鼠后肢左右腳足心部進(jìn)行刺激，每次刺激持續(xù)時(shí)間為6～8 s。大鼠出現(xiàn)快速撤足和（或）舔足反應(yīng)則為撤足反應(yīng)陽(yáng)性，如無(wú)出現(xiàn)則為撤足反應(yīng)陰性。以對(duì)數(shù)值3.84（壓力0.692 g）刺激強(qiáng)度為初始刺激強(qiáng)度，若撤足反應(yīng)為陰性則選用相鄰遞增的刺激強(qiáng)度的纖維毛繼續(xù)刺激，若撤足反應(yīng)為陽(yáng)性則選擇相鄰遞減的刺激強(qiáng)度給予刺激。50%機(jī)械刺激撤足閾值的計(jì)算算式：50%機(jī)械刺激撤足閾值（50% Paw withdrawal threshold，式中Xf為最末次測(cè)試von Frey hair的對(duì)數(shù)值；k值可根據(jù)撤足反應(yīng)模式查表（Chaplan 等［15］提出的Up-Down 方法）得出；δ為10 根von Frey hair 間對(duì)數(shù)差值的均值。

1.4 電生理記錄和坐骨神經(jīng)刺激

在第19 d 分別取生理鹽水組、長(zhǎng)春新堿組、長(zhǎng)春新堿+彌可保組、生理鹽水+彌可保組的大鼠，每組5～7 只用烏拉坦（1.5 g/kg）腹腔注射麻醉；在腰4～6 間行椎板切除術(shù)，暴露脊髓腰膨大部位。游離左側(cè)坐骨神經(jīng)，使用雙極氯化銀電極刺激坐骨神經(jīng)。除用于記錄的脊髓節(jié)段外，暴露的神經(jīng)組織均用37 ℃石蠟油覆蓋。應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法記錄脊髓背角C 纖維誘發(fā)電位，記錄方法如文獻(xiàn)所述［16］。通過(guò)氯化銀電極電刺激游離的坐骨神經(jīng)以誘發(fā)脊髓背角場(chǎng)電位。玻璃微電極（電阻0.5～1 MΩ）進(jìn)行細(xì)胞外記錄，用電控的微量推進(jìn)器（Narishige scientific instrument laboratory）將電極深度控制在脊髓表面以下300～500 μm。用數(shù)/模轉(zhuǎn)換器（ADC-42.PICO）以10 kHz 的速度處理和儲(chǔ)存數(shù)據(jù)。以C 纖維誘發(fā)電位的幅度作為參數(shù)。單方波（1～20 V，0.5 ms）刺激分離的左側(cè)坐骨神經(jīng)誘發(fā)脊髓背角場(chǎng)電位，記錄曲線穩(wěn)定后靜置15 min，隨后分別以1 V、2.5 V、5 V、7.5 V、10 V、12.5 V、15 V、20 V、26 V 的刺激強(qiáng)度，每個(gè)刺激強(qiáng)度刺激坐骨神經(jīng)3次，每次刺激間隔1 min，以記錄不同刺激強(qiáng)度對(duì)C纖維誘發(fā)場(chǎng)電位幅度的影響，坐骨神經(jīng)的刺激點(diǎn)到脊髓背角的記錄點(diǎn)距離約為10 cm。

1.5 免疫熒光實(shí)驗(yàn)

分別取生理鹽水組、長(zhǎng)春新堿造模組、長(zhǎng)春新堿+彌可保組、生理鹽水+彌可保組的大鼠，經(jīng)腹腔注射烏拉坦（1.5 g/kg）麻醉后，剪開胸腔，灌注針經(jīng)心尖垂直插入左心室至主動(dòng)脈，快速灌注生理鹽水300 mL，再用40 g/L 的多聚甲醛300 mL 灌注，解剖大鼠取出脊髓腰膨大段，再放入40g/L 的多聚甲醛中后固定1 h，隨后轉(zhuǎn)入30%蔗糖中脫水3 d。標(biāo)本經(jīng)蔗糖脫水后進(jìn)行冰凍切片（LEICA CM1900），脊髓切片厚度為25 μm，4 ℃短暫保存。收集脊髓冰凍切片后用0.01mol/L PBS 洗3 次，每次10 min，然后室溫下用免疫染色封閉液（Beyotime Biotechnology，China）作用于切片1 h。隨后加入對(duì)應(yīng)的一抗，分別為anti-calcitonin gene related peptide，anti-CGRP（1：200；rabbit；CST，USA），anti-phosphorylated NF-κB p65（Ser311；1：200；rabbit；Abcam，UK），anti-IL-10（1：100；rabbit；Abcam，UK），anti-NeuN（1：200；mouse；Abcam，UK），anti-GFAP（1：600；rabbit；Abcam，UK），anti-Iba-1（1：500；rabbit；Abcam，UK），搖床4℃孵育12 h，洗去一抗，用0.01M PBS 漂洗，每次10 min，共3 次，加入與一抗對(duì)應(yīng)的二抗，分別為Cy3-conjugated（1：400；Jackson ImmunoResearch，USA），Alexa 488-conjugated（1：500；Jackson ImmunoResearch，USA），避光室溫下慢搖1 h，隨后洗去二抗，再用0.01mol/L PBS 洗4次，每次10 min，隨機(jī)挑選切片貼于防黏附載玻片上，滴上含防熒光猝滅劑的封片液（Southern Biotech，USA）并用蓋玻片輕輕封片，防止氣泡產(chǎn)生。將制作好的玻片于4 ℃下避光晾干后立即于熒光顯微鏡（Leica DFC350 FX camera，Heidelberg，Germany）下觀察并拍照。組織切片免疫熒光染色結(jié)果的半定量分析使用Image Pro 軟件，計(jì)算每張切片上免疫陽(yáng)性區(qū)域而獲得。隨機(jī)挑選5～6張切片的拍照結(jié)果，導(dǎo)入Image Pro 軟件分析陽(yáng)性區(qū)域大小，用陽(yáng)性區(qū)域的面積比上脊髓背角的總面積；以及計(jì)數(shù)脊髓背角神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量，分別用p-p65 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比上神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)目。

1.6 Western blot實(shí)驗(yàn)

在第1、3、7、14 d 時(shí)，分別取生理鹽水組、長(zhǎng)春新堿組的大鼠，每組5～7只用烏拉坦（1.5 g/kg）腹腔注射麻醉動(dòng)物麻醉后，解剖大鼠并快速取出腰膨大段脊髓置于液氮中冷凍，然后加入SDS裂解液（Sigma-Aldrich，USA）（10 μL/mg）和蛋白磷酸酶抑制劑（Roche，Switzerland）勻漿并超聲破碎，13 600×g4 ℃離心后取上清液，上清用SDS-PAGE進(jìn)行分離，并轉(zhuǎn)至PVDF膜（Sigma-Aldrich，USA）上。1%BSA室溫（Sigma-Aldrich，USA）封閉1 h，然后再在4℃環(huán)境下 與一抗（phosphorylated NF-κB p65；Ser311；rabbit；1：1 000；Abcam；UK or NF-κB p65；rabbit；1：1 000；Abcam；UK or β-actin；rabbit；1：1 000；Abcam；UK）一起輕搖孵育過(guò)夜。第2 天用TBST 洗4 遍，隨后用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（goat anti-rabbit IgG，1：10 000；Abcam，UK）孵育1 h，TBST洗4遍，經(jīng)ECL發(fā)光液（Shanghai Epizyme Biomedical Technology，China）顯色曝光，再經(jīng)化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Tanon，China）內(nèi)置CCD 攝像頭拍攝顯影條帶，使用Image-Pro Plus 軟件對(duì)圖像進(jìn)行灰度分析。對(duì)每個(gè)目的條帶進(jìn)行總灰度值的分析，并用β-actin的總灰度值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

通過(guò)graphpad 6.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤（means ± SEM）表示。首先用Shapiro-Wilk 檢驗(yàn)數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布，P＞0.05被認(rèn)為符合正態(tài)分布。二組計(jì)量資料的均數(shù)比較，如果每一組資料都呈正態(tài)分布并且方差齊性，組間比較采用t檢驗(yàn)，反之用秩和檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗(yàn)。多組數(shù)據(jù)組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）繼以Tukey 檢驗(yàn)。P＜0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 連續(xù)腹腔注射長(zhǎng)春新堿引起機(jī)械痛敏

與手術(shù)前基礎(chǔ)值比較，腹腔注射長(zhǎng)春新堿（vincristine，VCR，0.1mg·kg-1/day，1 次/天，連續(xù)注射10 d）引起大鼠雙側(cè)后肢50%機(jī)械刺激撤足閾值顯著下降。如圖2 A 所示，注射長(zhǎng)春新堿后第4 d，同側(cè)后肢的50% 機(jī)械刺激撤足閾值已由術(shù)前的25.67 g 降至6.52 g（Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，Z=-2.032，P=0.042），之后持續(xù)維持在比較低的水平，術(shù)后19 d 時(shí)仍然維持在低水平（Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，Z=-2.023，P=0.043），對(duì)側(cè)后肢的50%機(jī)械刺激撤足閾值的變化與同側(cè)后肢類似，說(shuō)明腹腔注射長(zhǎng)春新堿可引起大鼠雙側(cè)后肢長(zhǎng)時(shí)間的機(jī)械痛覺過(guò)敏。

2.2 彌可保抑制長(zhǎng)春新堿引起的脊髓背角病理性突觸可塑性的發(fā)生

C 纖維介導(dǎo)的突觸傳遞效率的增強(qiáng)與疼痛密切相關(guān)，其表現(xiàn)為脊髓背角C 纖維誘發(fā)場(chǎng)電位幅值的增大。如圖2 B，我們發(fā)現(xiàn)與生理鹽水組相比，長(zhǎng)春新堿造模組大鼠在第19 d時(shí)（從第一次給長(zhǎng)春新堿算起），脊髓背角C 纖維誘發(fā)場(chǎng)電位幅值在給予坐骨神經(jīng)5 V 或10 V 單次電刺激時(shí)均顯著增大。值得注意的是，坐骨神經(jīng)給予5 V 的單次電刺激時(shí)，長(zhǎng)春新堿造模組的大鼠可被誘發(fā)C 纖維誘發(fā)場(chǎng)電位（0.018 ± 0.008）mV，而生理鹽水對(duì)照組、生理鹽水+彌可保組和長(zhǎng)春新堿+彌可保組幾乎不能誘發(fā)C-纖維誘發(fā)場(chǎng)電位。如圖2 C，當(dāng)刺激強(qiáng)度從5 V 逐漸增大到12.5 V 時(shí)，同一強(qiáng)度的刺激在長(zhǎng)春新堿組大鼠誘發(fā)的C 纖維誘發(fā)場(chǎng)電位的幅值明顯大于生理鹽水組。與生理鹽水組相比，當(dāng)刺激強(qiáng)度為12.5 V 時(shí)，長(zhǎng)春新堿組大鼠誘發(fā)的C 纖維誘發(fā)場(chǎng)電位的幅值明顯增大（Z=-2.371，P=0.016）；而長(zhǎng)春新堿+彌可保組大鼠C纖維誘發(fā)場(chǎng)電位幅值明顯小于長(zhǎng)春新堿組（Z=-2.611，P=0.008），單獨(dú)給予彌可保組大鼠C 纖維誘發(fā)場(chǎng)電位幅值也明顯小于長(zhǎng)春新堿組（Z=-2.627，P=0.009）。以上結(jié)果說(shuō)明長(zhǎng)春新堿處理可能導(dǎo)致了C 纖維介導(dǎo)的突觸傳遞效率的增強(qiáng)；而預(yù)防性給予彌可保能夠緩解長(zhǎng)春新堿的上述作用，單獨(dú)使用彌可保也能降低C 纖維誘發(fā)場(chǎng)電位的幅值，說(shuō)明彌可保可能對(duì)正常動(dòng)物的基礎(chǔ)痛閾也有影響。

圖2 腹腔注射長(zhǎng)春新堿引起大鼠雙側(cè)后肢50%機(jī)械刺激撤足閾值顯著下降和各組大鼠C纖維誘發(fā)場(chǎng)電位的記錄情況Fig.2 Intraperitoneal injection of vincristine decreased the 50%paw withdrawal threshold in bilateral hindpaw in rats and the C-fiber evoked field potential recordings

2.3 彌可保抑制長(zhǎng)春新堿引起的脊髓背角CGRP纖維芽生

如圖3 所示，與生理鹽水組（圖3 A）相比，長(zhǎng)春新堿給藥第19 d 時(shí)，大鼠脊髓背角CGRP 陽(yáng)性纖維的數(shù)目明顯增多（圖3 C，E；Z=-2.611，P=0.008），而給予彌可保（長(zhǎng)春新堿給藥前15 d 即開始給藥，持續(xù)到最后一次長(zhǎng)春新堿給藥結(jié)束后9 d）可顯著減少脊髓背角CGRP 的纖維數(shù)目（圖3 D，E；Z=-2.611，P=0.008），提示抑制CGRP 纖維芽生可能是抑制脊髓背角C 纖維誘發(fā)電位長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)（long-term potentiation，LTP）的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。彌可保慢性處理對(duì)正常大鼠脊髓背角CGRP 陽(yáng)性纖維的數(shù)目無(wú)顯著影響（圖3 B，E；Z=-1.984，P=0.056）。

圖3 腹腔注射彌可?？梢种崎L(zhǎng)春新堿引起的脊髓背角CGRP陽(yáng)性C纖維增多Fig.3 Intraperitoneal injection of McB inhibited the sprouting of CGRP positive C-fibers in the spinal dorsal horn induced by vincristine

2.4 彌可保防止長(zhǎng)春新堿引起的脊髓背角NF-κB信號(hào)通路的激活

NF-κB 由p65 或p50 組成。p65 作為NF-κB 通路的主要部分，p-p65 表達(dá)的增加反映了NF-κB 的激活，NF-κB p65 激活之前需要磷酸化將其錨定到細(xì)胞核中特定的目標(biāo)基因。NF-κB 也被報(bào)道可以調(diào)節(jié)一些致炎細(xì)胞因子的表達(dá)，從而在CIPN 中發(fā)揮重要作用［6］。因此我們用蛋白質(zhì)印跡和免疫熒光方法觀察了彌可保對(duì)脊髓背角p-p65 表達(dá)的影響，以此觀察對(duì)NF-κB 通路激活的影響。Western Blot 結(jié)果表明，長(zhǎng)春新堿造模組第14 d 時(shí)大鼠脊髓背 角p-p65 的表達(dá) 顯著增加（圖4A，F(xiàn)（4，20）=16.90，P＜0.000 1；單因素方差分析繼以Tukey′s 多重比較）。免疫熒光雙染結(jié)果顯示，p-p65 在NeuN標(biāo)記的神經(jīng)元（圖4 B，D，K）、Iba1 標(biāo)記的小膠質(zhì)細(xì)胞（圖4 E，G，K）及GFAP 標(biāo)記的星型膠質(zhì)細(xì)胞都有表達(dá)（圖4 H，J，K）。與生理鹽水組（圖4 L）相比，長(zhǎng)春新堿造模組大鼠在第19 d 時(shí)p-p65 表達(dá)增加（圖4 M）。以上結(jié)果表明無(wú)論是神經(jīng)元還是膠質(zhì)細(xì)胞的NF-κB 通路在給予長(zhǎng)春新堿后都被激活。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)表明，給予彌可?？娠@著減少長(zhǎng)春新堿（第19 d）脊髓背角神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)p-p65 的表達(dá)（圖4 K-N，Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，Z=-2.611，P=0.008），說(shuō)明彌可保抑制了NFκB通路的激活。

圖4 腹腔注射彌可?？梢种崎L(zhǎng)春新堿引起的脊髓背角p-p65表達(dá)增多Fig.4 Intraperitoneal injection of McB inhibited the up-regulation of p-p65 in the spinal dorsal horn induced by vincristine

IL-10 作為一種抗炎細(xì)胞因子，也可以抑制如IL-1β、TNF-α 和IL-6 等多種促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生［17］。我們觀察到與生理鹽水組相比（圖5 A，D），長(zhǎng)春新堿組給藥后第19 d 時(shí)脊髓背角IL-10 的表達(dá)顯著降低（圖5 B，D，Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，Z=-2.611，P=0.009），而給予彌可保組大鼠其脊髓背角抗炎細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)明顯上調(diào)（圖5 C，D，Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，Z=-2.402，P=0.0159）。在生理鹽水組，免疫熒光雙染顯示IL-10 只表達(dá)在神經(jīng)元（圖5 E-G），在星形膠質(zhì)細(xì)胞（圖5 H-J）及小膠質(zhì)細(xì)胞（圖5 K-M）沒(méi)有觀察到IL-10的表達(dá)。

圖5 預(yù)先給予彌可?？赡孓D(zhuǎn)長(zhǎng)春新堿引起的脊髓背角IL-10表達(dá)減少Fig.5 Pretreatment with McB reversed the decrease of IL-10 in the spinal dorsal horn after vincristine treatment

3 討論

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)預(yù)防性使用彌可保顯著抑制了長(zhǎng)春新堿誘導(dǎo)的脊髓背角C 纖維誘發(fā)場(chǎng)電位的增大。同時(shí)，彌可保抑制了脊髓背角CGRP 纖維的增多及NF-κB 通路的激活，并且增加了IL-10的表達(dá)。這些結(jié)果表明，彌可保通過(guò)抑制NF-κB通路的激活及糾正炎性細(xì)胞因子失衡防止中樞敏感化。

傷害性刺激可導(dǎo)致坐骨神經(jīng)C 纖維與脊髓背角形成的突觸傳遞效率顯著增強(qiáng)。表現(xiàn)為脊髓背角神經(jīng)元的興奮性持續(xù)性增高，即形成了中樞敏感化，這可能是產(chǎn)生持續(xù)性疼痛的重要原因之一［18］。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)腹腔注射彌可保（維生素B12 的一種活性結(jié)構(gòu)）可防止長(zhǎng)春新堿誘導(dǎo)的脊髓背角C 纖維誘發(fā)電位LTP，提示彌可?？赏ㄟ^(guò)防止中樞敏感化起作用。除此之外，長(zhǎng)春新堿處理也可引起外周敏感化［19］，即導(dǎo)致初級(jí)傳入纖維的自發(fā)活動(dòng)（異位放電）［20］，這也是引起神經(jīng)病理性疼痛的關(guān)鍵因素［21］。最近的一項(xiàng)研究表明，彌可?？梢燥@著地抑制CCD 大鼠背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的異位自發(fā)放電［22］。在本研究中，彌可保為腹腔注射，其可以通過(guò)血液循環(huán)到達(dá)全身各處組織，包括背根神經(jīng)節(jié)，因此彌可保也有可能通過(guò)防止外周敏感化起作用。

化療藥物長(zhǎng)春新堿的使用常常會(huì)導(dǎo)致病理性疼痛。傳導(dǎo)慢性疼痛的C 纖維分為表達(dá)IB4非肽能纖維和表達(dá)CGRP 肽能兩大類。我們之前的研究表明，長(zhǎng)春新堿可引起脊髓背角CGRP 肽能C 纖維芽生，但不能引起IB4非肽能C 纖維芽生。這一變化可能是引起化療后疼痛產(chǎn)生的重要原因［6］。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)彌可保可以防止CGRP 肽能C纖維芽生。這可能是彌可保減弱痛覺過(guò)敏的重要原因。

NF-κB 通路的激活可以使致炎細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1β 和IL-6 等細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄增多，其被證明參與了長(zhǎng)春新堿誘導(dǎo)的痛覺過(guò)敏和痛覺異常的發(fā)展［23］。因此，減少炎性因子的生成被認(rèn)為是防止病理性疼痛的有效手段，彌可保和天竺葵的合用已被報(bào)道可以通過(guò)減少TNF-α 的生成減緩泰素誘導(dǎo)的周圍神經(jīng)病變［24］。而我們之前的Western blot 實(shí)驗(yàn)也表明彌可?？蓽p少TNF-α 在脊髓背角的表達(dá)量［14］。在本研究中，我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，彌可?？梢栽诩顾璞辰且种芅F-κB p65的磷酸化，提示彌可?？赏ㄟ^(guò)抑制NF-κB 減少致炎細(xì)胞因子的表達(dá)。IL-10 是一種重要的抗炎細(xì)胞因子，在給予長(zhǎng)春新堿后其表達(dá)顯著下調(diào)，而彌可保則可以增加IL-10 的表達(dá)。與之一致的是，鞘內(nèi)注射IL-10 基因治療藥物可以抑制泰素誘導(dǎo)的機(jī)械觸誘發(fā)痛敏［25］。以上結(jié)果提示彌可保可能通過(guò)平衡致炎與抗炎細(xì)胞因子的表達(dá)，改善神經(jīng)元生存的局部微環(huán)境，進(jìn)而抑制神經(jīng)病理性疼痛。

除了彌可保單獨(dú)使用外，其通常還與維生素E等其他藥物聯(lián)合使用［26］。在2 型糖尿病引起的周圍神經(jīng)病變中，彌可保、α-硫辛酸和普瑞巴林的聯(lián)合使用比單獨(dú)使用普瑞巴林提供了更強(qiáng)的鎮(zhèn)痛作用［27］。因此彌可保與其他藥物聯(lián)合使用可能比單獨(dú)應(yīng)用更加有效。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)與生理鹽水處理相比較，單獨(dú)慢性給予彌可?？娠@著下調(diào)刺激C 纖維誘發(fā)場(chǎng)電位的幅度，說(shuō)明彌可保本身對(duì)正常狀態(tài)下C纖維與脊髓背角感覺細(xì)胞的突觸傳遞可能有抑制作用，提示其對(duì)治療急性疼痛可能也有效。但在之前的相關(guān)研究中，我們發(fā)現(xiàn)單獨(dú)使用彌可保對(duì)正常大鼠對(duì)脊髓后角相關(guān)炎性指標(biāo)IL-10 及TNF-α 的表達(dá)并無(wú)顯著影響［13］，在本研究中單獨(dú)使用彌可保對(duì)正常大鼠CGRP 表達(dá)也無(wú)顯著影響。綜合判斷，我們推測(cè)彌可保抑制正常情況下突觸傳遞的功能可能不是通過(guò)抑制脊髓背角炎性指標(biāo)所進(jìn)行的。有研究報(bào)道高濃度彌可?？梢苑€(wěn)定局部細(xì)胞膜內(nèi)外離子通道，降低細(xì)胞膜內(nèi)外離子濃度差，減少動(dòng)作電位產(chǎn)生，從而抑制異位放電［22］。我們推測(cè)彌可?？赡芡ㄟ^(guò)抑制突觸前動(dòng)作電位的發(fā)放進(jìn)而抑制了C 纖維神經(jīng)遞質(zhì)，包括谷氨酸和ATP 向脊髓背角的釋放，具體的機(jī)制還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探討。

綜上所述，本研究證明預(yù)防性使用彌可?？娠@著抑制長(zhǎng)春新堿誘導(dǎo)的脊髓背角C 纖維誘發(fā)場(chǎng)電位的增大。同時(shí)，彌可保抑制了脊髓背角CGRP 纖維的芽生及NF-κB 通路的激活，并且增加了IL-10的表達(dá)。