陶夢丹，劉 妍

（1.東南大學(xué)生物科學(xué)與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，江蘇南京 210096；2.南京醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院干細(xì)胞與神經(jīng)再生研究所，江蘇南京 211166）

帕金森綜合癥（Parkinson′s disease，PD）又名震顫麻痹，由英國醫(yī)學(xué)家兼地質(zhì)學(xué)家James Parkinson 在其個(gè)人專著《論震顫麻痹》中首次提出［1-2］，現(xiàn)已成為繼阿爾茲海默病之后，第二常見的慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾?。?］。截至2020年，全球已超過6 百萬帕金森綜合癥患者［4］，且患病率逐年增加［5］，給個(gè)人、家庭以及整個(gè)社會帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。因此，探究有效的治療方式以及明確發(fā)病機(jī)制極具意義。迄今為止，帕金森綜合癥治療方案仍以藥物治療及手術(shù)治療法為主。藥物治療的主要機(jī)制在于增加腦內(nèi)的多巴胺遞質(zhì)。然而藥物治療雖可延緩病程，但無法進(jìn)行根治。此外，藥物治療具有脫靶效應(yīng)以及嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如“開關(guān)”現(xiàn)象等［6］。手術(shù)治療以深層腦部刺激（deep brain stimulation，DBS）為主，該法旨在利用電脈沖引起腦內(nèi)神經(jīng)元的異常放電來調(diào)控患者行為。DBS 常用于治療對于藥物治療或其他治療無效的嚴(yán)重患者［7］。然而DBS 具有一定有限性：①極易引起顱內(nèi)出血，其治療效果也難以控制［8］；②手術(shù)治療費(fèi)用高；③僅適用于PD 晚期且未癡呆患者。近二十年來，隨著研究深入，帕金森綜合癥的治療手段層出不窮。其中，干細(xì)胞治療法成為了研究熱點(diǎn)之一［4］。1981年，Evans 和Kaufman 首次將小鼠胚胎干細(xì)胞進(jìn)行分離，并證明小鼠胚胎干細(xì)胞不僅可以維持其多能性，還可被誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、造血細(xì)胞等。該分離技術(shù)的成功建立為1998 年Thomson等人從胚泡中成功分離人胚胎干細(xì)胞（human embryonic stem cell，hESC）提供了前提［9］。雖然研究者運(yùn)用hESC進(jìn)行許多人類胚胎發(fā)生以及疾病相關(guān)的研究，并取得了巨大的進(jìn)展，但鑒于人胚胎干細(xì)胞來自人類胚胎，其數(shù)量有限性以及倫理限制性成為人胚胎干細(xì)胞發(fā)展的主要制約因素。而后，2006年，Yamanaka 等［10］利用逆轉(zhuǎn)錄因子Sox2（sex determining region Y-box2），c-Myc（myelocytomatosis），Oct3/4（octamer-binding transcription factor 3/4）和Klf4（Kruppel-like factor 4）誘導(dǎo)小鼠成纖維細(xì)胞產(chǎn)生具備無限增殖且多分化潛能的hiPSC。hiPSC 與hESC 具備相似的分化潛力、形態(tài)、基因等特征。hiPSC不僅可極大地避免hESC引發(fā)的倫理問題，還包含了供體細(xì)胞的遺傳基因等背景，理論上更適合于個(gè)體化醫(yī)療的研究［11］。干細(xì)胞治療機(jī)制在于利用外源性多巴胺能神經(jīng)元替代內(nèi)源性受損細(xì)胞。研究者首先將hPSC 進(jìn)行定向誘導(dǎo)分化，之后再將所得細(xì)胞移植入黑質(zhì)等特定區(qū)域。干細(xì)胞移植治療法為帕金森綜合癥的治愈帶來了希望。除治療外，hPSC 作為生物模型，在帕金森綜合癥機(jī)制研究中也發(fā)揮著不可或缺的作用。理想的帕金森綜合癥模型應(yīng)當(dāng)可模擬人類疾病表征以及疾病進(jìn)程。然而化學(xué)損傷模型作為常用的帕金森綜合癥模型［12］，雖可以部分模擬帕金森綜合癥患者的臨床癥狀，如運(yùn)動(dòng)遲緩，靜止性震顫等，但其無法重現(xiàn)患者腦內(nèi)的神經(jīng)變性以及蛋白異常聚集的病變過程。此外，轉(zhuǎn)基因帕金森綜合癥小鼠模型較少能觀察到黑質(zhì)區(qū)域的神經(jīng)損傷［13］。因此，亟須一種可模擬病情進(jìn)展的疾病模型出現(xiàn)。人多能干細(xì)胞衍生而得的帕金森綜合癥中腦類器官模型的發(fā)育過程類似于人類中腦的發(fā)育過程，理論上可模擬不同階段的帕金森綜合癥征。并且，研究表明，該類器官模型可良好地模擬路易小體聚集等病理現(xiàn)象［14］。類器官彌補(bǔ)了細(xì)胞簡單模型以及動(dòng)物復(fù)雜模型的不足之處，為帕金森綜合癥等神經(jīng)退行性疾病的研究提供了重要的實(shí)驗(yàn)平臺（圖1）。

圖1 基于hPSC技術(shù)進(jìn)行疾病模型建立的示意圖Fig.1 Schematic representation of pluripotent stem cell generation and application

1 hPSC 在帕金森綜合癥治療研究中的進(jìn)展

1980 年，奧爾森等人將腎上腺髓質(zhì)細(xì)胞植入PD 患者的紋狀體內(nèi)。結(jié)果闡明，富含兒茶酚胺的細(xì)胞植入物對患有嚴(yán)重帕金森綜合癥的患者具有短暫的有益效應(yīng)［15］。此后，研究者將富含多巴胺能神經(jīng)祖細(xì)胞的胚胎腹側(cè)中腦組織移植到帕金森綜合癥患者的殼核中?；颊叩男袨檎系K不僅得以顯著改善，患者腦內(nèi)產(chǎn)生大量的外源性多巴胺神經(jīng)元并存活24 余年［16］。然而，胚胎腹側(cè)中腦組織經(jīng)移植后，雖可以在體內(nèi)產(chǎn)生新的多巴胺能神經(jīng)元，并且該神經(jīng)元可與宿主內(nèi)的神經(jīng)環(huán)路整合，但也僅有3%-5%的外源性神經(jīng)元存活，遠(yuǎn)不足腦內(nèi)所需量［17］。此外，人胚胎腹側(cè)中腦組織的獲取受倫理限制，無法大量運(yùn)用。這些因素都極大的限制了胚胎組織移植治療的發(fā)展。組織移植治療結(jié)果雖良莠不齊，但細(xì)胞替代治療法的可行性有目共睹。因此，如何獲得足量且有效的外源性多巴胺神經(jīng)元成為研究者們關(guān)注的焦點(diǎn)之一。

一般而言，多能干細(xì)胞具有多向分化潛能，并不適宜直接移植。并且，神經(jīng)干細(xì)胞傾向于分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞以及中間神經(jīng)元［18］，無法在腦內(nèi)產(chǎn)生足量的多巴胺能神經(jīng)元。因此，移植多巴胺能前體細(xì)胞更具有可行性和安全性。2006 年，Roy 等［19］首次將hESC來源的多巴胺能神經(jīng)前體細(xì)胞移植入小鼠腦內(nèi)。經(jīng)檢測，鼠腦內(nèi)存在大量具有黑質(zhì)表型的外源性多巴胺能神經(jīng)元，小鼠行為也得以改善。然而，于鼠腦內(nèi)，可觀測到大量具有致瘤潛質(zhì)的處于有絲分裂期的神經(jīng)上皮細(xì)胞。之后，Kirkeby［20］、Kirkes 等［21］將hPSC 誘導(dǎo)方案進(jìn)行優(yōu)化，他們在分化過程中添加了SMAD 信號雙重抑制劑以及高濃度的Sonic Hedgehog，以促進(jìn)多巴胺能前體細(xì)胞的產(chǎn)生。所得細(xì)胞經(jīng)移植后，鼠腦內(nèi)未有畸胎瘤產(chǎn)生。此后，hESC 誘導(dǎo)所得的多巴胺能前體細(xì)胞移植治療在非人類靈長動(dòng)物模型中也展現(xiàn)了優(yōu)異的結(jié)果［22］，極大的推動(dòng)了干細(xì)胞移植治療帕金森綜合癥的臨床試驗(yàn)。然而，移植治療實(shí)驗(yàn)中，模型動(dòng)物需較長時(shí)間地被給與免疫抑制劑，如SRL、FTY720、FK506 等。免疫抑制劑雖可以降低患者的免疫排斥反應(yīng)，但長期使用，會出現(xiàn)腎功能損傷、中性粒細(xì)胞減少等不良反應(yīng)。要在臨床試驗(yàn)中使用基于多能干細(xì)胞的療法，不僅需要克服宿主對外源性細(xì)胞的排斥反應(yīng)，還需減弱甚至避免免疫抑制劑的副作用?？茖W(xué)家認(rèn)為，hiPSC源自患者體細(xì)胞，具有與患者相同的遺傳背景。因此在應(yīng)用理論上，hiPSC可以顯著減少甚至消除免疫反應(yīng)的產(chǎn)生。將iPSC 誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元，為之后hiPSC 來源的多巴胺能前體細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)提供了基礎(chǔ)。2013 年，Morizane［23］將自體移植與異體移植進(jìn)行對比，研究結(jié)果表明自體移植會減少約50%的排斥反應(yīng)，或?qū)⒔鉀Q免疫排斥問題。2017 年，來自日本京王大學(xué)的Kikuchi［24］將人源性多能干細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的多巴胺能前體細(xì)胞移植入帕金森綜合癥靈長類動(dòng)物模型的紋狀體中，并利用MRI以及正電子發(fā)射斷層掃描技術(shù)（PET）檢測移植細(xì)胞的存活、擴(kuò)增、整合以及宿主的免疫反應(yīng)。研究表明，人源性多巴胺能前體細(xì)胞移植治療對模型動(dòng)物的組織學(xué)以及行為學(xué)均有改善作用。

至此，hPSC 衍生的多巴胺能前體細(xì)胞移植試驗(yàn)均已進(jìn)入臨床試驗(yàn)期。2017年5月，我國科學(xué)家周琪領(lǐng)先于全球，進(jìn)行了hESC 源的多巴胺能前體細(xì)胞移植治療帕金森綜合癥的臨床試驗(yàn)。此外，于2018 年，Barker 等［25］首次進(jìn)行hiPSC 源的多巴胺能前體細(xì)胞移植治療帕金森綜合癥的人體實(shí)驗(yàn)。2020 年5 月，Schweitzer 及其同事完成了全球首例帕金森綜合癥人自體誘導(dǎo)的中腦多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)，實(shí)現(xiàn)了帕金森綜合癥人運(yùn)動(dòng)功能完全恢復(fù)的案例。充分證明了神經(jīng)前體細(xì)胞移植，是重構(gòu)受損的腦環(huán)路以及治療神經(jīng)退行性疾病的重要途徑［26］，也是繼藥物治療和手術(shù)治療之后的第三大醫(yī)學(xué)干預(yù)模式。

2 hPSC 在帕金森綜合癥機(jī)制研究中的進(jìn)展

2.1 帕金森綜合癥中腦類器官模型的建立

2008年，Park及其同事首次將病人體細(xì)胞誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化為hiPSC，成功構(gòu)建唐氏綜合征、亨廷頓、帕金森綜合癥患者來源的hiPSC［27-28］。之后，研究人員利用2D 培養(yǎng)體系將hiPSC 誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元，作為體外分化以及發(fā)育調(diào)控研究的模型，如對精神分裂癥［29-30］、雙相情感障礙［31-32］、抑郁癥［33］、帕金森綜合癥等［34-35］的研究。然而，盡管2D 培養(yǎng)技術(shù)相對成熟及穩(wěn)定且疾病研究也取得了相應(yīng)的成果，但2D 培養(yǎng)無法良好地模擬腦內(nèi)三維空間上的結(jié)構(gòu)以及由各種因子和信號所組成的復(fù)雜的微環(huán)境，更無法準(zhǔn)確概括細(xì)胞與細(xì)胞/細(xì)胞外基質(zhì)之間的相互作用［36-37］。研究表明，2D所得的多巴胺能神經(jīng)元雖具備部分病理特征，如上調(diào)的氧化應(yīng)激的敏感性［35］，但分化所得神經(jīng)元不僅成熟度較低［38］，目前也極少有報(bào)道表明該模型可模擬路易小體的異常聚集現(xiàn)象［39］。

為了更好的探究帕金森綜合癥患者腦內(nèi)細(xì)胞的狀態(tài)，研究者采用類器官技術(shù)進(jìn)行探究。類器官是指在體外環(huán)境下產(chǎn)生的具備三維結(jié)構(gòu)的微型模器官，可模擬部分人體組織或器官的生理功能。并且，組成類器官的細(xì)胞具有與體內(nèi)發(fā)育過程相似的定向分化性［40］。研究表明，類器官與腦內(nèi)器官具有極高的相似度［41］。類器官培養(yǎng)技術(shù)最早期運(yùn)用于小腸類器官的建立［37］，直至2013 年，人腦類器官才得以建立，例如Lancaster［42］建立的皮層類器官、Muguruma［43］建立的小腦類器官等。

中腦是多巴胺能神經(jīng)元的主富集區(qū)域，該區(qū)域參與控制一系列聽覺、視覺以及運(yùn)動(dòng)，是人腦不可或缺的區(qū)域之一。2016 年，新加坡科學(xué)家Jo 與其同事建立了模擬人中腦結(jié)構(gòu)的類器官模型［44］，并通過一系列手段證明了該模型的功能活性。此外，研究者在該類器官模型內(nèi)檢測到多巴胺能神經(jīng)元的主要標(biāo)志物神經(jīng)黑色素。在此基礎(chǔ)上，研究者們也通過自體衍生的iPSC 建立了具有自身遺傳信息的帕金森綜合癥中腦類器官模型［45］。帕金森綜合癥中腦類器官模型的建立為帕金森綜合癥發(fā)病機(jī)制的闡明以及分子機(jī)制的研究提供了平臺（表1）。

表1 2D多巴胺能神經(jīng)元及3D中腦類器官分化方法Table 1 Differentiation of 2D dopaminergic neurons and 3D midbrain organoids

2.2 帕金森綜合癥中腦類器官模型的應(yīng)用與展望

自帕金森綜合癥中腦類器官技術(shù)建立以來，已有許多科學(xué)家依此進(jìn)行分子機(jī)制等層面的探究且取得了良好的研究成果。如Kim［46］利用患者自體體細(xì)胞建立含有自身遺傳信息的hiPSC，并結(jié)合中腦類器官分化技術(shù)成功模擬了G2019S-LRRK2 散發(fā)性帕金森綜合癥。研究者證明該中腦類器官可呈現(xiàn)與PD 患者相似的病理學(xué)特征，如α-突觸核蛋白異常聚集及清除。除此之外，研究者還發(fā)現(xiàn)TXNIP 可以介導(dǎo)G2019S-LRRK2 的病理表型，該發(fā)現(xiàn)不僅為治療該疾病提供了新的藥物作用靶點(diǎn)，也為靶向性藥物的篩選提供了新的方向。

類器官模型除了可應(yīng)用于細(xì)胞水平機(jī)制的探究外，或可運(yùn)用于亞細(xì)胞水平機(jī)制的研究，如對多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)遞質(zhì)釋放等行為的探究。遞質(zhì)作為生物信息傳遞的要素之一，是細(xì)胞維持正?；顒?dòng)的基本元素。單細(xì)胞內(nèi)遞質(zhì)釋放的準(zhǔn)確檢測對探索相關(guān)疾病研究具有重要意義。細(xì)胞內(nèi)遞質(zhì)儲存于囊泡內(nèi)。囊泡膜由磷脂層、跨膜蛋白以及細(xì)胞膜表面的親水化合物組成，其內(nèi)含物的正常釋放是維持細(xì)胞機(jī)能的重要機(jī)制之一［47］。α-突觸蛋白的異常聚集已被證明與家族型帕金森綜合癥相關(guān)。有研究報(bào)道表明該蛋白可通過與磷脂的結(jié)合發(fā)生作用，并累積于突觸前端，從而造成囊泡釋放障礙［48］。因此，實(shí)時(shí)準(zhǔn)確的檢測囊泡釋放的方法是帕金森綜合癥分子機(jī)制研究中不可或缺的一部分。遞質(zhì)的檢測一般有微量透析法、高效液相法（HPLC）、伏安法等。以往研究中常使用微量透析法和高效液相法，它們雖可以檢測環(huán)境內(nèi)多巴胺濃度的變化，但無法實(shí)現(xiàn)在體的神經(jīng)遞質(zhì)檢測。伏安法主要利用了多巴胺具有易氧化的特性，當(dāng)外界給予700～1200 mV 的電壓刺激時(shí)，多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)囊泡中所含的分子得以釋放并發(fā)生氧化還原反應(yīng)，之后該分子釋放的電子產(chǎn)生電流信號。該方法優(yōu)勢在于其可進(jìn)行多巴胺釋放時(shí)的實(shí)時(shí)監(jiān)測與定量分析，為多巴胺的在體檢測提供可能［49］。2014 年，周專課題組［50］將人源性多巴胺能神經(jīng)前體細(xì)胞移植入帕金森綜合癥小鼠內(nèi)，并通過微透析的高效液相色譜法和電化學(xué)碳纖維電極共同測定。結(jié)果顯示在體外（腦片）和體內(nèi)紋狀體中均有出現(xiàn)多巴胺釋放和再攝取的恢復(fù)。該實(shí)驗(yàn)表明了電化學(xué)碳纖維電極檢測腦內(nèi)多巴胺的釋放以及再攝取的可行性，但該實(shí)驗(yàn)的檢測仍停留于多細(xì)胞水平，普通的微電極用于單突觸及單個(gè)囊泡的釋放的檢測依然面臨著巨大的挑戰(zhàn)。隨著研究的不斷深入，納米電極的制備技術(shù)使得檢測單個(gè)突觸間隙遞質(zhì)，甚至單個(gè)囊泡的釋放成為了現(xiàn)實(shí)［51］。然而，如何進(jìn)行人源性單細(xì)胞甚至單囊泡水平的神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺的檢測尚未見報(bào)道。

帕金森綜合癥類器官模型的建立為人源性單細(xì)胞的檢測提供了平臺。因此，之后研究中或可將帕金森綜合癥類器官模型與納米電極相結(jié)合，應(yīng)用于單細(xì)胞中單個(gè)囊泡儲存與釋放行為檢測，并以此探究人類帕金森綜合癥進(jìn)程中囊泡釋放與重?cái)z取行為的差異以及特異性分子等在神經(jīng)遞質(zhì)釋放中的作用，為帕金森綜合癥的病因研究提供支持。

隨著干細(xì)胞技術(shù)的不斷革新與優(yōu)化，科學(xué)家運(yùn)用hPSC 進(jìn)行了許多開創(chuàng)性試驗(yàn)，為帕金森綜合癥等神經(jīng)退行性疾病的治愈帶來了新的希望。此外，hPSC 衍生所得的中腦類器官也已成為了帕金森綜合癥機(jī)制研究中不可或缺的模型之一。然而，目前為止，類器官仍具有一定的局限性，如缺乏血管［52］以及免疫細(xì)胞，細(xì)胞類型及亞型也有所缺失等［53-54］。但隨著共培養(yǎng)體系等科研手段的不斷突破，類腦器官的功能與性狀正不斷趨向于人類大腦，可更好的模擬神經(jīng)退行性疾病。總之，多能干細(xì)胞在組織替代治療，疾病形成的機(jī)制、藥物實(shí)驗(yàn)等方面具有極大的探究與應(yīng)用價(jià)值。