谷書杰，錢禛鋒，婁永明,2，沈慶慶，普鳳雅，曾 丹，馬 豪，何麗蓮，李富生,3

（1云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，昆明 650201；2耿馬縣地方產(chǎn)業(yè)發(fā)展服務(wù)中心，云南耿馬 677500；3云南省作物生產(chǎn)與智慧農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650201）

0 引言

甘蔗(Saccharumofficinarum)是高光效的C4作物，無論是生物產(chǎn)量還是經(jīng)濟(jì)產(chǎn)量，相對于其他作物都更高，并且與淀粉糖等相比，蔗糖更容易利用，因此甘蔗一直是最重要的糖料作物和能源作物[1]。中國是世界第三大甘蔗種植國，而廣西、云南、廣東和海南是國內(nèi)甘蔗的主產(chǎn)區(qū)，但從地形地貌上看，這些省份又多山多坡耕地，普遍灌溉條件較差，并且近些年甘蔗的種植逐漸轉(zhuǎn)向干旱缺水的山區(qū)、坡地[2]。甘蔗苗期、分蘗期和整個營養(yǎng)生長階段對水分都非常敏感，在一些雨熱同季的地區(qū)干旱甚至可以降低甘蔗60%的產(chǎn)量[3]。干旱脅迫誘導(dǎo)破環(huán)植株體內(nèi)的生理生化反應(yīng)，導(dǎo)致代謝紊亂，嚴(yán)重阻礙作物生產(chǎn)[4-5]。干旱脅迫限制著全世界70%以上耕地的生產(chǎn)力[6-7]，探索作物抗旱機(jī)理和如何提高其抗旱能力一直都是各種作物的研究熱點(diǎn)[8-9]。植物內(nèi)生菌的概念于1866年首次被De Bary提出[10]。隨著社會的發(fā)展，植物內(nèi)生菌以內(nèi)生、用途廣、資源豐富、環(huán)境友好等特點(diǎn)成為近些年的研究熱點(diǎn)，也被廣泛應(yīng)用于不同領(lǐng)域[11-13]。植物內(nèi)生菌不僅具備良好的定殖能力，還可以通過產(chǎn)生植物激素、ACC（乙烯合成的直接前體，1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸）脫氨酶、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和胞外多糖等促進(jìn)植物生長和幫助植物抵御逆境[14-17]。植物內(nèi)生菌的研究利用主要集中在小麥[17-18]、玉米[19]、水稻[20-21]等作物上，并且以促進(jìn)生長、防御病蟲害和抵御鹽脅迫為主，探究內(nèi)生菌對甘蔗抗旱能力方面的影響還鮮有報道。隨著近幾年全球氣候的不斷變化，各地干旱狀況日益加劇，預(yù)計(jì)到2050年，干旱將對全世界50%以上的耕地造成嚴(yán)重的影響[22]。并且隨著全球氣溫升高和土壤濕度的變化，極有可能出現(xiàn)全球性的長期干旱[23]，尤其是在非洲和亞洲，干旱情況惡化的可能性會更高[24]。在這種大環(huán)境下，人們已經(jīng)通過雜交育種和分子育種選育抗旱作物品種來應(yīng)對干旱脅迫，但是育種進(jìn)程緩慢。前人研究表明，利用內(nèi)生菌提高作物耐旱能力是具備可行性的，并且這類內(nèi)生菌可以很快應(yīng)用到生產(chǎn)中[25-31]。如何在日益加重的干旱條件下保證農(nóng)業(yè)生產(chǎn)是一項(xiàng)重大的挑戰(zhàn)，保證有限供水條件下的作物產(chǎn)量對保障社會穩(wěn)定和安全至關(guān)重要[32]。本研究利用6株甘蔗內(nèi)生菌為目的菌株，從生理生化的角度探索甘蔗內(nèi)生菌在重度干旱脅迫下對苗期‘ROC22’的影響，以期揭示甘蔗內(nèi)生菌對‘ROC22’抗旱能力的影響途徑，為甘蔗內(nèi)生菌的開發(fā)和廣泛利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

甘蔗內(nèi)生菌C9（醋酸鈣不動桿菌）、C12（枯草芽孢桿菌）、YC89（貝萊斯芽孢桿菌）、E3（阿氏腸桿菌）、C6（陰溝腸桿菌）和O9（粘質(zhì)沙雷氏菌）等6株甘蔗內(nèi)生菌均由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)甘蔗研究所提供。

1.2 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為‘新臺糖22’(‘ROC22’)，由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)甘蔗研究所提供。通過盆栽的方式種植在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)甘蔗研究所的大棚內(nèi)。塑料盆口徑75 cm、高50 cm，盆底有3個孔，土壤取自云南農(nóng)業(yè)大學(xué)甘蔗研究所的紅壤土和腐殖土按1:1比例混合。設(shè)置6個處理（分別接種6株甘蔗內(nèi)生菌）、1個對照，每個處理和對照設(shè)置3個重復(fù)，共21盆。

1.3 材料處理

材料生長至第3片葉完全展開（苗期）時開始接種甘蔗內(nèi)生菌。接種方式采用灌根法。將6株甘蔗內(nèi)生菌接種到LB(Luria-Bertan)液體培養(yǎng)基（胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g，pH 7.0。固體加15 g/L瓊脂）培養(yǎng)48 h后，于8000 r/min離心10 min收集菌體，用無菌水重懸，采用稀釋涂布平板法計(jì)數(shù)，菌液于4℃保存?zhèn)溆谩＝臃N濃度為1×107cfu/g。對照灌溉等體積的無菌水。接菌7天后進(jìn)行干旱脅迫處理，處理至第10天于當(dāng)天19:00取土樣，采用烘干稱重法測定土壤含水量，確定土壤含水量在20%左右，達(dá)到重度干旱脅迫[33]。于次日7:00取每盆甘蔗幼苗+1葉（完全展開的第一葉）4℃保存?zhèn)溆?，用于進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 數(shù)據(jù)測定方法

菌株ACC脫氨酶活性用Penrose等[34]的方法測定。

土壤含水量的測定采用環(huán)刀（鋁盒）取樣烘干稱重的方法，先將鋁盒編號，烘干至恒重W0，然后取土稱重W1，烘干至恒重W2，計(jì)算如式(1)。

葉片含水量測量也采用烘干稱重的方法；植物葉片組織逆境膜傷害程度的測定用電導(dǎo)儀法；植物葉片組織中可溶性蛋白含量的測定用考馬斯亮藍(lán)G-250法；葉綠體色素含量測定用分光光度法；植物葉片組織中可溶性糖、丙二醛(MDA)含量、游離脯氨酸(Pro)含量、過氧化物酶(POD)活性、超氧物歧化酶(SOD)活性用購自北京索萊寶科技有限公司的試劑盒測定。

1.5 數(shù)據(jù)處理方法

使用SPSS 25.0和Microsoft Excel 2019處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘蔗內(nèi)生菌菌株的ACC脫氨酶活性

如表1所示，E3、O9和YC89有較高的ACC脫氨酶活性。方差分析表明，E3菌株的ACC脫氨酶活性極顯著高于YC89，O9菌株的ACC脫氨酶活性極顯著高于YC89。C12、C9和C6株菌ACC脫氨酶活性極顯著低于E3、O9和YC89。

表1 不同菌株ACC脫氨酶活性

2.2 干旱脅迫后的土壤含水量

如表2所示，各處理之間土壤含水量均在20%左右。方差分析表明，各處理之間差異不顯著。

表2 干旱脅迫10天后的土壤含水量

2.3 ‘ROC22’苗期葉片的生理狀態(tài)

2.3.1 ‘ROC22’苗期葉片含水量 如表3所示，葉片含水量最高的是YC89處理，最低的是O9，兩者相差6.99個百分點(diǎn)。方差分析結(jié)果表明。接種YC89的植株葉片含水量極顯著高于CK和其他處理。接種C6和C9菌的葉片含水量極顯著高于E3、O9、C12。E3、O9、C12處理和CK之間差異不顯著。

2.3.2 ‘ROC22’苗期葉片的電導(dǎo)率 如表3所示，細(xì)胞膜受損最嚴(yán)重的是CK，電導(dǎo)率達(dá)到7.25%，受損程度較小的是E3、O9和YC89。方差分析結(jié)果表明，CK和C9電導(dǎo)率極顯著高于其他處理。處理之間比較，E3和O9之間差異不顯著，但是極顯著低于C12、C9、C6、YC89。YC89極顯著低于C6和C16，C6和C12之間差異不顯著。

2.3.3 ‘ROC22’苗期葉片的葉綠素含量 重度干旱脅迫下，接種不同菌株對甘蔗植株葉片葉綠素含量影響差異不大（表3）。方差分析表明，各處理之間差異不顯著，與CK相比差異也不顯著。

表3 不同處理對葉片生理狀態(tài)的影響

2.4 ‘ROC22’苗期滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)

2.4.1 ‘ROC22’苗期葉片可溶性糖含量 植株受到干旱脅迫信號的誘導(dǎo)，可溶性糖被大量積累用于抵御滲透脅迫。如表4所示，可溶性糖含量最高的是YC89，其次是E3，最低的是CK。方差分析表明，接種YC89菌的‘ROC22’苗期葉片中積累的可溶性糖極顯著高于CK和其他處理；接種E3的‘ROC22’苗期葉片積累的可溶性糖極顯著高于CK和除YC89外的其他處理；O9、C12和C6處理之間差異不顯著，但極顯著高于C9和CK；C9極顯著高于CK。整體來看，接種甘蔗內(nèi)生菌的‘ROC22’植株較CK都積累了更多的可溶性糖來抵御干旱脅迫。

2.4.2 ‘ROC22’苗期葉片可溶性蛋白含量 如表4所示，可溶性蛋白含量最低的是CK，最高的是E3，兩者相差5.73%。方差分析表明，重度干旱脅迫下，接種E3菌株的‘ROC22’苗期葉片可溶性蛋白含量極顯著高于CK和其他處理；接種YC89和C12菌株的‘ROC22’苗期葉片可溶性蛋白含量與YC89之間差異不顯著，但是極顯著高于C6、C9和CK，C6、C9和CK之間差異不顯著。

2.4.3 ‘ROC22’苗期葉片Pro含量 Pro不僅參與滲透調(diào)節(jié)，還參與降低細(xì)胞酸性等生化反應(yīng)。如表4所示，‘ROC22’苗期葉片Pro積累量最高的是YC89，達(dá)到了110.21 μg/g，最低的為C12，僅為68.09 μg/g。方差分析表明，在重度干旱脅迫下，接種YC89的‘ROC22’苗期葉片中積累的Pro含量，極顯著高于CK和其他處理；其次是E3和O9，極顯著高于CK、C12、C9和C6；C9極顯著高于CK、C12和C6；C6和CK之間差異不顯著。

表4 不同處理對葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

2.5 ‘ROC22’苗期葉片膜脂過氧化程度

MDA是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一，它的產(chǎn)生還能加劇膜的損傷，因此在植物衰老生理和抗性生理研究中MDA含量是一個常用指標(biāo)，可通過MDA了解膜脂過氧化的程度，以間接測定膜系統(tǒng)受損程度。接種不同甘蔗內(nèi)生菌對重度干旱脅迫下的‘ROC22’苗期葉片膜脂過氧化程度的影響如表5所示，膜脂過氧化程度最高的是CK，MDA含量達(dá)到了19.82 nmol/g，最低的是O9和E3。方差分析表明，在重度干旱脅迫下，接種E3和O9菌株的‘ROC22’葉片中MDA積累量極顯著低于CK和除YC89外的其他處理；YC89極顯著低于CK和C12；C9顯著低于C6和C12，極顯著低于CK；C6和C12顯著低于CK。

表5 不同處理對葉片MDA含量的影響

2.6 ‘ROC22’苗期葉片保護(hù)酶活力

2.6.1 ‘ROC22’苗期葉片POD活性 表6表明，POD活性最高的是YC89，達(dá)到了3828.04 U/g，其次是E3，最低的是C9。重度干旱脅迫下，接種YC89菌株的‘ROC22’葉片中POD活性極顯著高于CK和其他處理；E3極顯著高于CK和除YC89外的其他處理；O9、C6、C12和CK之間差異不顯著，但是極顯著高于C9。

2.6.2 ‘ROC22’苗期葉片超氧化物歧化酶(SOD)活性 如表6所示，SOD活性最高的是E3和YC89，最低的是CK。方差分析表明，接種E3、O9、YC89和C6菌株的‘ROC22’苗期葉片SOD活性之間差異不顯著，但顯著高于CK；C12、C9、C6和CK之間差異不顯著。

表6 不同處理對葉片POD和SOD活性的影響

3 結(jié)論

本研究以6株甘蔗內(nèi)生菌為供試菌株，測定其ACC脫氨酶活性，于‘ROC22’苗期接種，在重度干旱脅迫條件下測定苗期植株+1葉抗旱相關(guān)生理生化指標(biāo)和酶活性，發(fā)現(xiàn)這6株甘蔗內(nèi)生菌對‘ROC22’抗旱能力有一定的促進(jìn)作用。其中產(chǎn)ACC脫氨酶的E3、O9和YC89菌在降低干旱脅迫對‘ROC22’苗期葉片組織的損傷效果極顯著，在減少葉片細(xì)胞膜的損傷和細(xì)胞失水、增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累、提高保護(hù)酶活性中發(fā)揮重要作用，本試驗(yàn)表明，產(chǎn)ACC脫氨酶的甘蔗內(nèi)生菌能有效提高甘蔗抗旱能力，拓寬了提高甘蔗抗旱能力的途徑，為合理利用甘蔗內(nèi)生菌提高甘蔗抗旱能力提供了理論依據(jù)。

4 討論

本研究首次探究甘蔗內(nèi)生菌對甘蔗抗旱能力的影響，研究結(jié)果表明，接種甘蔗內(nèi)生菌后的‘ROC22’苗期在遭受重度干旱脅迫的時候葉片損傷程度相較于CK更低，一方面體現(xiàn)在保護(hù)了細(xì)胞膜使其更完整，電導(dǎo)率更低，另一方面降低了葉片水分的散失，這與Vardharajula等[35]的研究結(jié)果基本一致。但是本研究中6株甘蔗內(nèi)生菌對甘蔗葉綠素含量影響并不顯著，猜測可能是細(xì)胞膨壓保持較好，葉綠素分解較少。干旱脅迫下，作物會積累大量滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)維持滲透勢減少水分損失，從而抵御干旱脅迫[36]。Govindasamy等[37]研究發(fā)現(xiàn)，盆栽試驗(yàn)中高粱內(nèi)生菌能通過增加植物葉片內(nèi)脯氨酸積累量來增加高粱的抗旱性；Ois等[38]的研究表明，接種枯草芽孢桿菌B26能顯著提高干旱脅迫條件下梯牧草根和芽中的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，從而提高梯牧草的抗旱性，在本研究中，甘蔗內(nèi)生菌YC89顯著提高了甘蔗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累量，這與前人研究結(jié)果基本一致，也進(jìn)一步說明甘蔗內(nèi)生菌在促進(jìn)甘蔗積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)中起到重要作用。脯氨酸(Pro)除作為植物細(xì)胞質(zhì)內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)外，還在穩(wěn)定生物大分子結(jié)構(gòu)、降低細(xì)胞酸性、解除氨毒以及作為能量庫調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原勢等方面起重要作用，本研究中E3、C6和YC89甘蔗內(nèi)生菌極顯著提高了‘ROC22’干旱脅迫下的Pro積累量。丙二醛(MDA)直接反映細(xì)胞膜質(zhì)過氧化程度的高低，本研究中甘蔗內(nèi)生菌E3、O9和YC89處理的MDA含量極顯著低于CK，表明其在降低膜質(zhì)過氧化中的作用，與嚴(yán)美玲等[39]的研究結(jié)果基本一致。不僅如此，植物內(nèi)生菌還會通過提高作物過氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性來降低或消除干旱脅迫對細(xì)胞的損傷[40-41]，在本研究中，E3和YC89對‘ROC22’干旱脅迫下苗期葉片SOD和POD活性具有顯著的促進(jìn)作用。

1-氨基環(huán)丙烷-1羧酸(ACC)是乙烯合成的直接前體，ACC脫氨酶在減輕干旱脅迫給作物帶來的不利影響方面起著至關(guān)重要的作用[42-43]。本研究測定了6株甘蔗內(nèi)生菌的ACC脫氨酶活性，發(fā)現(xiàn)E3、O9和YC89均有較高的酶活性，結(jié)果表明，重度干旱脅迫下，這3株甘蔗內(nèi)生菌對減少葉片失水、增加滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累和提高氧化酶活性有顯著效果，這與前人研究結(jié)果[15,44]基本一致。E3、O9和YC89對干旱脅迫產(chǎn)生的負(fù)面影響有很大的抑制作用，因此膜質(zhì)過氧化程度較低，積累的Pro也相對較少。前人研究[42,45-46]表明,產(chǎn)ACC脫氨酶的菌株會提高作物的葉綠素水平，但是本研究中只有E3菌能顯著提高葉綠素含量，另外2株產(chǎn)ACC脫氨酶的甘蔗內(nèi)生菌（O9和YC89）對葉綠素含量影響并不顯著，這可能是由于這2株產(chǎn)ACC脫氨酶的甘蔗內(nèi)生菌促進(jìn)甘蔗生長效果不強(qiáng)。并且在本研究中，不是所有內(nèi)生菌對甘蔗生理指標(biāo)的影響都是正向的，主要表現(xiàn)為與CK相比，C9顯著降低了‘ROC22’葉片中的POD活性，C12降低了葉片Pro含量。從生理生化的角度，本研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)ACC脫氨酶的甘蔗內(nèi)生菌能提高甘蔗的抗旱性，今后的研究可以從分子的角度進(jìn)一步探究，產(chǎn)ACC脫氨酶的內(nèi)生菌對甘蔗體內(nèi)代謝通路影響情況、基因被誘導(dǎo)高表達(dá)或者抑制表達(dá)的情況。