張麗榮 ，馮 田 ，姚明杰，郭 萍 ，丁 珍 ，孔令保，王 婷

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)，a.生物科學(xué)與工程學(xué)院；b.動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南昌 330045；2.南昌動(dòng)物病毒與基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南昌 330045；3.武漢科前生物股份有限公司，武漢 430206）

病毒性腹瀉嚴(yán)重影響著養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。特別是2010 年以來(lái)由PEDV 變異株所致的仔豬腹瀉及2014 年發(fā)現(xiàn)的致病性PDCoV，使中國(guó)養(yǎng)豬業(yè)面臨新的威脅和挑戰(zhàn)，是關(guān)注的熱點(diǎn)和防控重點(diǎn)［1，2］。PEDV、TGEV、PDCoV 和 GAR 這 4 種病毒是常見典型的豬腸道病毒，均可引起仔豬嘔吐、腹瀉，最后嚴(yán)重脫水甚至死亡，其發(fā)病的臨床癥狀相似，難以區(qū)分［3，4］。豬場(chǎng)普遍存在腹瀉病毒的混合感染，并且呈交叉感染。傳統(tǒng)方法造價(jià)較高、非特異性強(qiáng)、周期較長(zhǎng)難以有效區(qū)分，不適合大規(guī)模的診斷鑒定。因此，建立能夠快速同時(shí)檢測(cè)致豬腹瀉病毒性病原的方法在臨床上對(duì)該病的防控具有重要意義。當(dāng)前，國(guó)內(nèi)外已有學(xué)者建立了一些病毒的多重RTPCR 鑒別檢測(cè)方法。任玉鵬等［5］建立了 PEDV、TGEV、PDCoV 三重 RT-PCR 方法，但迄今未見同時(shí)檢測(cè)并區(qū)分 PEDV、TGEV、PDCoV、GAR 多重 RTPCR 方法的報(bào)道。本試驗(yàn)建立了針對(duì)PEDV、TGEV、PDCoV 和GAR 4 種腹瀉性病毒的多重RTPCR 檢測(cè)方法，并且對(duì)該方法條件優(yōu)化后，進(jìn)行了特異性、敏感性和重復(fù)性分析。同時(shí)利用該方法檢測(cè)了江西省部分地區(qū)養(yǎng)豬場(chǎng)送來(lái)的臨床樣本，驗(yàn)證該方法的可靠性，以期為獸醫(yī)臨床提供快速診斷和治療的方法依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病毒

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、乙型腦炎病毒（JEV）、口蹄疫病毒（FMDV）、豬 δ 冠狀病毒（PDCoV）由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)南昌動(dòng)物病毒與基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。非洲豬瘟病毒（ASFV）為自制滅活疫苗。豬傳染性胃腸炎-豬流行性腹瀉-豬輪狀病毒三聯(lián)弱毒凍干活疫苗購(gòu)自哈爾濱維科生物技術(shù)公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)及合成

利用Primer Premier 5.0 分析軟件，根據(jù)Gene-Bank 中登錄的 PEDV（登錄號(hào) MK841495.1）N基因、TGEV（登錄號(hào) KT696544.1）N基因、PDCoV（登錄號(hào)MN942260.1）N基因和 GAR（登錄號(hào) JX498961.1）VP7基因序列設(shè)計(jì) 4 對(duì)引物（表 1），分別擴(kuò)增 693、557、495 和355 bp 的目的基因片段；引物由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成。

表1 多重RT-PCR 引物信息

1.3 病料處理及病毒核酸提取

用PBS 緩沖液將糞便樣品稀釋10 倍，在渦旋儀上振蕩混勻 10 min 后，7 770 r/min 離心 5 min，取上清液用于核酸提?。回i小腸樣品放于EBSS 緩沖液中（10%）振蕩懸浮，7 770 r/min 離心5 min，取上清用于核酸提取。參照RNA isolater Total RNA Extraction Reagent提取試劑盒說(shuō)明書提取病毒總RNA，并利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒制備反轉(zhuǎn)錄cDNA，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果與分析

2.1 單項(xiàng)RT-PCR 退火溫度的確定

采用不同的退火溫度進(jìn)行PCR 擴(kuò)增（50.8、51.8、53.2、55.0、56.5 ℃），25 μL 擴(kuò)增體系中加入模板 2 μL，上下游引物各 1 μL。如圖 1 所示，PEDV 和TGEV 在5 個(gè)退火溫度下均能擴(kuò)增出較亮條帶，PDCoV 和GAR 在不同退火溫度下擴(kuò)增效率不一，條帶亮度不一。最終確定的退火溫度為51.8 ℃。

圖1 PEDV、TGEV、PDCoV 和GAR 單項(xiàng)RT-PCR 退火溫度的確定

2.2 多重RT-PCR 反應(yīng)條件的確定

在單一RT-PCR 測(cè)試5 個(gè)退火溫度的基礎(chǔ)上，加入4 種病毒混合cDNA 模板2 μL，每種病毒上下游引物各1 μL 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果顯示，與單項(xiàng)PCR 擴(kuò)增結(jié)果一致，在退火溫度51.8 ℃時(shí)擴(kuò)增效果好，同時(shí)在53.2 ℃也可得到較好擴(kuò)增效果（圖2A）。為確定反應(yīng)體系中引物使用量，在篩選出的2 個(gè)退火溫度（51.8 和53.2 ℃）條件下，4 個(gè)病毒的引物上下游各加入0.25、0.50、1.00 μL 進(jìn)行反應(yīng)。經(jīng)方陣試驗(yàn)確定多重RT-PCR 反應(yīng)最佳體系為2 × RapidTaqMaster Mix 12.5 μL、上 下 游 引 物 各 0.25 μL（10 μmol/L）、模板 2 μL、加滅菌 ddH2O 25 μL。當(dāng)退火溫度為51.8 ℃（圖2B），多重PCR 擴(kuò)增效果最好。RT-PCR 反應(yīng)程序：95 ℃ 3 min，95 ℃ 15 s，51.8 ℃15 s，72 ℃ 20 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 5 min。

圖2 多重RT-PCR 退火溫度及引物濃度的確定

2.3 多重RT-PCR 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

構(gòu)建4 種病毒目的片段的重組質(zhì)粒。根據(jù)質(zhì)?？截悢?shù)（拷貝/μL）=［6.02×1023×質(zhì)粒濃度（ng/μL）×109］/（660×質(zhì)粒堿基數(shù)），換算為拷貝數(shù)。通過(guò)換算，PEDV、TGEV、PDCoV 和GAR 質(zhì)?？截悢?shù)分別為8.7×1010、9.8×1010、1.25×1010、1.21×1010拷貝/μL。按照最佳反應(yīng)條件和體系，將上述質(zhì)粒10 倍倍比稀釋液混合后作為模板進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果（圖3）顯示，本試驗(yàn)建立的多重RT-PCR 方法檢測(cè)PEDV、TGEV、PDCoV 和GAR 4 種病毒的最低檢出量分別為8.7、9.8、1 250 和 12.1 拷貝/μL。

圖3 多重RT-PCR 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 多重RT-PCR 特異性試驗(yàn)結(jié)果

采用優(yōu)化后的多重RT-PCR 反應(yīng)條件對(duì)PEDV、TGEV、PDCoV 和 GAR 混合模板，以及 4 種病毒單一模板進(jìn)行擴(kuò)增，同時(shí)以常見豬病毒PRRSV、JEV、FMDV、ASFV 的 cDNA 為模板，以及 HCV 的 cDNA 和水為模板設(shè)為對(duì)照進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。結(jié)果如圖4 所示，PRRSV、JEV、FMDV、ASFV 和 HCV 模板擴(kuò)增后均未見到擴(kuò)增產(chǎn)物，只有PEDV、TGEV、PDCoV 和GAR 擴(kuò)增出了相應(yīng)的目的條帶。

圖4 多重RT-PCR 特異性試驗(yàn)結(jié)果

2.5 多重RT-PCR 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

以PEDV、TGEV、PDCoV 和GAR 混合模板，以及3 種病毒不同組合混合模板、2 種病毒不同組合混合模板、單一病毒模板進(jìn)行PCR 重復(fù)檢測(cè)，結(jié)果（圖5）顯示，不同組合模板均能擴(kuò)增得到與預(yù)期大小相符的目的條帶，表明建立的多重RT-PCR方法重復(fù)性好。

圖5 多重RT-PCR 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.6 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果

利用建立的多重RT-PCR 以及單一RT-PCR 方法對(duì)采自江西某地豬場(chǎng)的30 份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，圖6 顯示部分臨床樣本的檢測(cè)結(jié)果，其中包括5 份小腸樣本和6 份糞便樣本。有2 份小腸樣本和2 份糞便樣本檢測(cè)到PEDV。30 份樣本中PEDV、TGEV 和GAR 的陽(yáng)性檢出率為66.7%、3.3%、6.7%（表2）。多重檢測(cè)與單一檢測(cè)符合率為100%。表明本研究建立的多重RT-PCR 方法準(zhǔn)確率較高，可以應(yīng)用于臨床樣品的檢測(cè)。

圖6 部分臨床樣品多重RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果

表2 30 份多重RT-PCR 與單一RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果比較

3 小結(jié)與討論

病毒性疾病給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，對(duì)于病毒核酸的檢測(cè)主要是利用PCR 或者RT-PCR 方法。設(shè)計(jì)引物時(shí)，除了保證引物中的G+C 含量和Tm值符合常規(guī)PCR 的要求外，還要求多條引物的G+C含量盡量保持一致。引物設(shè)計(jì)完成后，要在同種病毒的不同毒株之間進(jìn)行同源性比對(duì)，保守性評(píng)估，另外還需與其他病毒進(jìn)行比對(duì)以確定設(shè)計(jì)的引物是否具有良好的特異性［6，7］。逄鳳嬌等［8］建立的 RT-PCR方法對(duì)PDCoV 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的最低檢測(cè)限為4.05×103拷貝/μL；而本研究中PEDV 最低檢出量為8.7 拷貝/μL。利用建立的多重RT-PCR 方法對(duì)來(lái)自江西某地豬場(chǎng)的30 份臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)與單一PCR 方法以及商品化ELISA 試劑盒檢測(cè)方法比較，發(fā)現(xiàn)檢測(cè)符合率很高。

本研究建立的多重RT-PCR 方法特異性較強(qiáng)、敏感性較高且檢測(cè)快速便捷，可對(duì)PEDV、TGEV、PDCoV 和GAR 4 種致豬腹瀉病毒進(jìn)行鑒別檢測(cè)，對(duì)豬場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查及相應(yīng)疾病防控具有重要實(shí)踐意義，可應(yīng)用于臨床大規(guī)模檢測(cè)。