劉慶國，周 鵬，趙金玉，宋浩楠，武軍元

（塔里木大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300）

牛支原體可引起乳房炎、肺炎、關(guān)節(jié)炎等疾病，影響牛的眼、耳、腦等其他器官［1］，也是牛呼吸道疾病綜合征（BRD）的主要參與者，對養(yǎng)牛業(yè)造成了重大的損失［2］。盡管牛支原體不是人畜共患病，但可以感染男性并引起睪丸炎、睪丸精囊炎和精液質(zhì)量下降，在世界范圍內(nèi)造成了重大的經(jīng)濟(jì)、健康和福利問題。在2019—2020 年南疆地區(qū)牛支原體流行病學(xué)調(diào)查中顯示，南疆地區(qū)較北疆地區(qū)的牛支原體感染情況更為嚴(yán)重。調(diào)查的10 個南疆規(guī)?；B(yǎng)殖場均存在牛支原體感染，平均感染率為22.86%，現(xiàn)將調(diào)查結(jié)果介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 采集南疆不同地區(qū)疑似因牛支原體病病死牛肺臟5 份及患有呼吸道疾病的牛鼻拭子若干。病牛多見體溫升高、精神萎靡、食欲不振、眼口鼻分泌物增多，有膿性鼻液。病死后剖檢可見肺臟大理石樣變，病變處可見隆起，內(nèi)有干酪樣病灶。

1.1.2 主要試劑及儀器 C1000 Touch?PCR 儀，購自Bio-Rad（中國）有限公司；XMTP 2045 型恒溫水浴鍋、GSP 9080WBE 型隔水式恒溫式培養(yǎng)箱，購自上海博訊實業(yè)有限公司；細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司；PPLO Broth，PPLO Agar，購自BD（中國）；SPF 雞胚，購自北京梅里亞維通實驗動物技術(shù)有限公司（中國）。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集及處理

1）鼻拭子采集及處理。對牛鼻腔周圍進(jìn)行消毒，取無菌棉簽采集鼻腔內(nèi)分泌物，放入提前準(zhǔn)備好的MTB［1］液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12 h。吸取培養(yǎng)物200 μL，通過 0.45 μm 細(xì)菌濾器接種到新的 MTB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d。

2）肺臟采集及處理。對病死牛肺臟盡早采集并避免污染。帶回后在超凈臺下對肺臟病健交界處進(jìn)行燒烙滅菌并做十字切口，取黃豆大小組織，放入離心管中并加入1 mL 生理鹽水進(jìn)行勻漿。再將其進(jìn)行簡短低速離心，吸取上清液200 μL 通過0.45μm細(xì)菌濾器接種到MTB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d。

1.2.2 病原的純化 使用牛支原體特異引物對培養(yǎng)物進(jìn)行PCR 檢測，將陽性培養(yǎng)物盲傳3 代，使其生長穩(wěn)定。將培養(yǎng)物倍比稀釋至10-3～10-6，分別接種到MTA 固體培養(yǎng)基［1］上，培養(yǎng) 2～4 d。當(dāng)菌落出現(xiàn)明顯的牛支原體菌落特征時，使用10 μL 滅菌槍頭將其挑至MTB 液體培養(yǎng)基中，反復(fù)3 次純化后保菌。

1.2.3 形態(tài)學(xué)觀察 菌落生長后使用40 倍光學(xué)顯微鏡觀察。

1.2.4 PCR 鑒定 牛支原體特異引物及支原體通用引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物信息見表1。

表1 引物信息

1）細(xì)菌組DNA 制備。細(xì)菌組DNA 制備參照說明書提取。

2）PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系 10 μL，2×TaqPCR MasterMix 5 μL；Primer F（10 μmol/L）0.3 μL；Primer R（10 μmol/L）0.3 μL；ddH2O 3.4 μL；模板 DNA（約 100 ng/μL）1 μL。反應(yīng)條件見表2。

表2 反應(yīng)條件

3）克隆和測序。使用瓊脂糖回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收純化。并將載體與回收產(chǎn)物進(jìn)行連接后轉(zhuǎn)化到DH5α 中，通過藍(lán)白斑篩選與質(zhì)粒PCR 檢測是否轉(zhuǎn)化成功。將成功轉(zhuǎn)化的菌株送往測序。

1.2.5 序列分析 測序完成后，通過NCBI網(wǎng)站下載牛支原體及其他相關(guān)序列。使用DNAstart 軟件進(jìn)行同源性比對分析（表3），使用MEGA 7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

表3 用于比對分析的支原體16S rRNA 基因序列

1.2.6 菌株和雞胚的處理 取濃度為109CCU/mL牛支原體純培養(yǎng)物，在超凈臺下使用生理鹽水反復(fù)洗滌3 次，備用。將雞胚氣室向上傾斜40°置于37.5 ℃水床，并蓋上棉被保溫。每日翻蛋2 次，并棄去無精蛋、死胚、弱胚，挑選出發(fā)育胚體大小相近的雞胚。

1）接種方法。將雞胚消毒，在超凈臺下向7 日齡雞胚的尿囊腔接種0.2 mL（109CCU/mL）洗滌后的菌液，每組10 只，并設(shè)生理鹽水對照組和空白對照組。接種完成后繼續(xù)孵化，棄掉24 h 內(nèi)死亡的雞胚。

2）雞胚檢測。將24 h 后死亡的雞胚，放入4 ℃冰箱過夜，使其尿囊液析出。無菌抽取尿囊液進(jìn)行PCR 檢測、分離鑒定及記錄數(shù)據(jù)。觀察至15 日齡，未死亡雞胚統(tǒng)一進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原的分離與純化

使用牛支原體特異引物進(jìn)行PCR 檢測陽性的培養(yǎng)物經(jīng)過MTB 液體培養(yǎng)基盲傳3 代、MTA 固體培養(yǎng)基純化3 次后，從5 份病死牛肺臟及若干鼻拭子中獲得3 份純培養(yǎng)物。在低倍鏡下可觀察到煎蛋樣的菌落（圖1）。

圖1 分離株形態(tài)觀察（40×）

2.2 PCR 檢測結(jié)果

牛支原體通用引物及牛支原體特異引物分別在1 021 及1 626 bp 處可見明亮清晰的目的條帶，確定為牛支原體（圖2）。

圖2 PCR 檢測結(jié)果

2.3 序列分析

2.3.1 同源性分析 將克隆測序所得的3 株16S rRNA 序列與NCBI 中的參考序列進(jìn)行比對。結(jié)果顯示，本研究中的3 株牛支原體之間同源性為98.2%～98.5%，分離株 1 與 KG4397 同源性最近；分離株 2 與CQ-W70、KG4397 同源性最近；分離株3與NM2012等同源性最近（圖3）。

圖3 牛支原體分離株16S rRNA 基因序列與參考序列核苷酸同源性對比

2.3.2 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 試驗中的分離株與牛支原體分離株P(guān)G45、KG4397、MYC82、NM2012、Ningxia-1、FJ-HJ、HB0801-P150、08M、CQ-W70 聚成一個類群，親緣關(guān)系較近。試驗分離株1 與牛支原體分離株FJ-HJ 親緣關(guān)系最近，分離株2 與牛支原體分離株NM2012、MYC82 親緣關(guān)系最近，分離株3 與牛支原體分離株MYC82 親緣關(guān)系最近（圖4）。

圖4 基于支原體的16S rRNA 基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.4 雞胚感染后變化

由圖5 可知，正常發(fā)育雞胚發(fā)育較快，有尿酸鹽析出，胚體體積占雞胚體積比重較大；而經(jīng)牛支原體感染后存活的雞胚發(fā)育較慢，大部分無尿酸鹽析出，胚體體積占雞胚體積比重較?。慌Ｖгw感染后可以造成部分雞胚死亡［3］，胚體表面有明顯充血、出血（圖5）。

圖5 雞胚感染后變化

2.5 不同菌株感染結(jié)果

由表4 可知，試驗分離株1 在對雞胚的致死率（20%）、尿酸鹽沉積率（30%）、活胚平均重（9.50 g）所表現(xiàn)出的毒力，均高于試驗分離株2 及分離株3。

表4 雞胚感染試驗結(jié)果

3 討論

牛支原體自發(fā)現(xiàn)至今各主要養(yǎng)牛國均有該病原體的存在［4］，南疆地區(qū)養(yǎng)牛數(shù)量較多，其感染率也較高（22.86%）［1］。牛感染該病原體后往往不會表現(xiàn)出臨床癥狀，會間歇性排毒且傳播方式多樣［5］。這使得引種［6］、使用外來精液［7］等都存在被感染的風(fēng)險。一旦該病原體進(jìn)入牛場后非常容易進(jìn)一步傳播，如擠奶時造成的傳播［7］、犢牛食用被污染的乳汁造成的傳播、牛接觸被污染的墊草等造成的傳播［8］、牛與牛直接接觸造成的傳播，甚至吸入污染的空氣造成的傳播［9］。當(dāng)該病原體廣泛存在于牛場后，部分免疫力低的牛會出現(xiàn)非特異性的臨床癥狀，如乳腺炎、呼吸道癥狀、關(guān)節(jié)炎、增重下降等。造成的經(jīng)濟(jì)損失難以估計。

當(dāng)牛場被感染后，因其非特異性的癥狀及隱性感染的存在，很難確定哪些牛被感染過，即使通過檢測確定了，對其進(jìn)行針對性的治療并不能完全消滅場內(nèi)的牛支原體。完全淘汰后堅持自繁自養(yǎng)看似可行，但從經(jīng)濟(jì)方面及實施難度上考慮不劃算。

疫苗是解決該問題的較好途徑［10］，當(dāng)然疫苗的研發(fā)也存在著諸多挑戰(zhàn)，比如牛支原體具有可變表面脂蛋白（Vsps），在體外和體內(nèi)經(jīng)歷高頻的變化，使得牛支原體具有強(qiáng)大的抗原變異能力［11］，使牛支原體疫苗在大部分情況下預(yù)防效果不佳［12］。

牛支原體疫苗的開發(fā)及相關(guān)研究離不開分離鑒定和致病力檢測，但由于試驗成本較高，且試驗繁瑣僅能對一部分分離株進(jìn)行致病性檢測，不利于后續(xù)研究的進(jìn)行。而范媛［3］、吳翠蘭等［13］通過 SPF 雞胚對牛支原體進(jìn)行致病性檢測后發(fā)現(xiàn)牛支原體對雞胚具有一定致病性，且試驗成本低，但牛支原體對雞胚的致病性與對牛的致病性是否一致仍需進(jìn)一步研究。本試驗參照其方法進(jìn)行了致病性檢測，為后續(xù)研究提供數(shù)據(jù)支持。結(jié)果表明，分離株1 的致病性比分離株 2、分離株 3 強(qiáng)。但參照范媛［3］、吳翠蘭等［13］的試驗結(jié)果來看，均為弱毒株。