蘇 航，周思宇，楊文建，于成文，姜明明，金志民

（1.牡丹江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011；2.黑龍江農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)職業(yè)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157041）

大林姬鼠為哺乳綱嚙齒目鼠科姬鼠屬動物，體型細(xì)長，多棲息于林區(qū)、灌木叢、林區(qū)空地和林區(qū)邊緣的農(nóng)田之中，多以闊葉樹的種子和果實為食[1]。在中國主要分布于西南、西北、華北和東北等地區(qū)，是中國農(nóng)林地區(qū)較為常見的小型嚙齒類哺乳動物［2］。關(guān)于大林姬鼠生態(tài)與生理生化方面的研究較多［3-6］，但對大林姬鼠腸道微生物的研究尚不充足。腸道微生物對宿主的營養(yǎng)消化吸收、免疫、代謝以及維持宿主腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定起著重要的作用［7］。相關(guān)研究證明，腸道菌群是腸道微生物中占比最大的組成部分。影響腸道菌群結(jié)構(gòu)及多樣性的因素較多，如食性、年齡、季節(jié)、飼養(yǎng)方式及海拔等［8］。性別因素對動物的生理和行為有明顯影響，但關(guān)于性別因素對腸道菌群組成的影響難以形成明確的結(jié)論。本研究采用16S rDNA 高通量測序技術(shù)，對采自橫道河子地區(qū)的大林姬鼠進(jìn)行研究，分析其腸道菌群的組成及性別因素對組成的影響。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集與保存

樣品取自黑龍江省牡丹江市橫道河子國家自然保護(hù)區(qū)（海拔460～600 m，44°44′—44°55′N，129°06′—129°15′E）。采用籠捕法，共采集 13 只樣本，選取體型相似、解剖后無明顯患病癥狀的健康成年鼠雌雄各5 只，其中雌鼠均未懷孕。對采集的樣本進(jìn)行編號，如表1 所示。在實驗室無菌條件下，將鼠脫頸處死，并進(jìn)行解剖，取出鼠的盲腸立即放入裝有液氮的研缽中速凍，裝入無菌凍存管，標(biāo)記好放入-80 ℃冰箱。

表1 大林姬鼠個體信息

1.2 腸道微生物DNA 的提取

采用CTAB/SDS 方法，對腸道組織進(jìn)行總DNA的提取，經(jīng)過1.8%瓊脂糖凝膠電泳20 min 檢測有明亮條帶為提取成功。在每個樣本的通用引物兩端加上不同的 barcode。 使用通用引物 515F-806R（515F：5′GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′，806R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）對 16S rDNA 基因V3-V4 區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增。純化產(chǎn)物送至北京百邁克生物科技有限公司用HiSeq2500 PE250 平臺進(jìn)行雙端測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

獲得所有樣本的測序數(shù)據(jù)后，去除引物接頭序列，使用 FLASH v1.2.11 軟件，通過overlap 對每個樣品的reads 進(jìn)行拼接，得到的拼接序列即原始Tags數(shù)據(jù)（Raw Tags），使用Trimmomatic v0.33 軟件，對拼接得到的Raw Tags 進(jìn)行過濾，得到高質(zhì)量的Tags數(shù)據(jù)，使用UCHIME v4.2 軟件，鑒定并去除嵌合體序列，得到各樣本的有效數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品中有效序列和OTUs

通過高通量測序技術(shù)對10 份大林姬鼠的盲腸樣本進(jìn)行16S rDNA 測序。共獲得有效序列633 165條，平均每個樣品中含有63 316 條有效序列，其中雌性含有316 011 條，雄性含有317 154 條。有效序列數(shù)量最高的是DL8，有76 856 條有效序列，最低的是DL6，有54 513 條有效序列，二者相差22 343條。基于相似度＞97%的原則將獲得的有效Tags 序列進(jìn)行聚類，共獲得899 個OTUs。韋恩圖中重疊部分為雌性樣品與雄性樣品共有的OUTs，由圖1 可知雌雄兩組中共有738 個OTUs。

圖1 大林姬鼠雌性和雄性O(shè)TUs

2.2 Alpha 多樣性分析

通過對10 份樣品的Alpha 多樣性分析指數(shù)進(jìn)行豐富度和多樣性比較。從圖2 可以看出，隨著測試深度的不斷加深，稀釋曲線從不斷上升，直至趨于平緩，說明樣品的測序深度比較合理。使用SPSS19.0軟件對大林姬鼠組和黑線姬鼠組的Alpha 多樣性指數(shù)進(jìn)行差異性分析，結(jié)果如表2 所示，兩組的Ace、Chao1、Shannon、Simpon 4 個指數(shù)均差異不顯著（P＞0.05），說明不同性別的大林姬鼠腸道菌群豐富度無顯著差異。

圖2 雌性和雄性樣品稀釋曲線

2.3 物種分類分析

2.3.1 門水平菌群組成差異 由圖3 可知，在門水平上，雌性和雄性大林姬鼠含量最高的5 個菌門是相同的，分別為厚壁菌門( Firmicutes) 、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）、Epsilonbacteraeota、脫鐵桿菌門（Deferribacteres）。其中，各菌門的含量分別為厚壁菌門（雌52.70%，雄44.94%）、擬桿菌門（雌30.24%，雄27.47%）、變形菌門（雌 7.07%，雄 17.51%）、Epsilonbacteraeota（雌7.01%，雄6.98%）、脫鐵桿菌門（雌2.23%，雄1.35%）

圖3 大林姬鼠門水平下雌性和雄性菌群相對豐度

2.3.2 屬水平菌群組成差異 由圖4 可知，在屬水平上，雌、雄大林姬鼠腸道內(nèi)各菌群存在比例略有差異，雌性大林姬鼠腸道內(nèi)占比最高的5 個優(yōu)勢菌屬依次為 Unidentified-Muribaculaceae（25.42%）、Unidentified-Lachnospiraceae(20.79%)、螺桿菌屬（Helicobacter）（7.01%）、乳桿菌屬（Lactobacillus）（6.55%）、螺 菌 科 NK4A136 組Lachnospiraceae-NK4A136-group（4.42%）。雄性大林姬鼠腸道內(nèi)占比最高的5個優(yōu)勢菌屬依次為Unidentified-Muribaculaceae（18.31%）、Unidentified-Lachnospiraceae(15.94%)、假單胞菌屬（Pseudomonas）（10.57%）、螺桿菌屬（Helicobacter）（6.98%）、螺菌科 NK4A136 組Lachnospiraceae-NK4A136-group（6.89%）。

2.4 Anosim 分析

Anosim 分析是非參數(shù)檢驗，基于Bray-Curtis 距離值的秩次進(jìn)行每兩組間差異顯著性檢驗，用來判斷組間差異是否大于組內(nèi)差異。R-value 在（-1，1）之間，R-value ＞0 說明組間差異大于組內(nèi)差異；R-value ＜ 0 說明組內(nèi)差異大于組間差異；P＞0.05 說明組間差異不顯著，0.01＜P＜0.05 說明組間差異顯著，P＜0.01 說明組間差異極顯著。大林姬鼠雌雄兩組間R＝0.068，說明組間差異大于組內(nèi)差異，P＝0.338（P＞0.05），說明大林姬鼠雌雄兩組腸道菌群差異不顯著。

3 小結(jié)與討論

通過16S rDNA 高通量測序技術(shù)對橫道河子地區(qū)大林姬鼠腸道菌群的性別差異進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，不同性別的大林姬鼠腸道菌群組成沒有顯著差異。關(guān)于性別對鼠類腸道菌群組成的影響研究結(jié)果并不一致。楊靜等［9］對甘肅鼢鼠腸道菌群進(jìn)行研究后發(fā)現(xiàn)，腸道菌群組成和結(jié)構(gòu)在雌雄間差異不顯著。Org 等［10］對具有特定遺傳背景的小鼠進(jìn)行檢測時發(fā)現(xiàn)性別差異對腸道菌群的組成有明顯影響。也有學(xué)者認(rèn)為性別差異對腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響不顯著，原因可能是性別差異被其他因素，如宿主遺傳和環(huán)境因素所掩蓋［11］。本研究的樣品雖然是在同一地點，同一時期采集的，但不能控制其遺傳背景。因此可以推測本研究中大林姬鼠的腸道菌群雌雄差異并不顯著，可能是由于無法準(zhǔn)確的控制變量因素。動物腸道菌群受性別影響的機理還尚未明確。Yurkovetskiy 等［12］對小鼠研究表明，小鼠腸道菌群組成的性別差異直到青春期后才出現(xiàn)，且在雄性小鼠閹割后這一差異消失。所以性別因素造成腸道菌群的差異有可能是由于性激素對機體作用所造成的影響。

總的來說，性別可能是影響動物腸道菌群的因素，但由于野生大林姬鼠的其他變量無法控制，導(dǎo)致大林姬鼠雌雄個體腸道菌群的差異不顯著。性激素水平也可能是影響微生物組成的部分因素，但機制尚未明確，需要進(jìn)一步分析。