辛 娜，鄧露芳*，郭 亮*，宗文麗，班文杰，黃玉海

（1.北京三元種業(yè)科技股份有限公司飼料分公司，北京 101105；2.北京首農(nóng)畜牧發(fā)展有限公司，北京 100076）

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis,BS）具有耐高溫高壓、耐酸堿、耐膽鹽等抗逆性，是一種理想的微生物飼料添加劑。其作用機理是可消耗腸道內(nèi)的氧氣，促進腸道有益菌生長、拮抗有害菌的生長，維持腸道環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，同時可產(chǎn)生多種代謝產(chǎn)物，在動物養(yǎng)殖上應用可提高動物生長性能，改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，增強免疫力，同時具有凈化養(yǎng)殖環(huán)境的功效[1-3]。牛至是一種多年生灌木或草本植物，屬唇形科牛至屬。牛至主要成分取決于產(chǎn)地和其他因素，主要分為揮發(fā)性和非揮發(fā)性兩類成分，有效成分為香芹酚、百里香酚、迷迭香酸等。牛至提取物（Oregano extract，OE）具有提高動物采食量、抗菌、抗炎、抗氧化等功能[4-5]。目前，國內(nèi)尚缺乏牛至提取物、枯草芽孢桿菌的國家標準，且生產(chǎn)廠家眾多，生產(chǎn)工藝及產(chǎn)品品質(zhì)、使用效果等方面也都存在差異。本試驗選取6個不同廠家生產(chǎn)的牛至提取物和枯草芽孢桿菌產(chǎn)品，采用牛津杯體外抑菌方法，研究牛至提取物、枯草芽孢桿菌及其組合的抑菌效果，為篩選出較優(yōu)的抑菌產(chǎn)品及組合提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材 料

1.1 指示菌株

大腸埃希氏菌（ATCC25922）、鼠傷寒沙門氏菌（ATCC14028），購于廣東環(huán)凱生物科技有限公司。產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素A 型（BNCC125404）,購于北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司。

1.2 牛至提取物（OE）和枯草芽孢桿菌（BS）

6個不同廠家生產(chǎn)的牛至提取物（OE）和枯草芽孢桿菌（BS），均為市售產(chǎn)品，由北京三元種業(yè)科技股份有限公司飼料分公司收集。6個牛至提取物和枯草芽孢桿菌分別標記為OE-1、OE-2、OE-3、OE-4、OE-5、OE-6 及BS-1、BS-2、BS-3、BS-4、BS-5、BS-6。

1.3 培養(yǎng)基

營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，購自北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

2 方 法

2.1 不同牛至提取物和枯草芽孢桿菌產(chǎn)品對致病菌的抑制試驗

參照劉冬梅等[6]研究中的牛津杯擴散法進行試驗。取滅菌營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，待溫度降至50 ℃左右時倒平板，每個平皿約15 mL。待瓊脂凝固后用滅菌的鑷子夾牛津杯置于營養(yǎng)瓊脂平板中。每個平板放置4個牛津杯。分別取大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌0.1 mL（108cfu·mL-1）加入到已滅菌的100 mL 營養(yǎng)瓊脂中（冷卻至50 ℃左右），搖勻后傾倒，注意不要起泡。待瓊脂凝固后，用鑷子將牛津杯夾出來（牛津杯外徑8 mm），分別標記為孔1、孔2、孔3、孔4。枯草芽孢桿菌用純化水稀釋，牛至提取物用無水乙醇稀釋備用?？?中加入相對應的稀釋液100 μL作對照，取不同廠家的牛至提取物和枯草芽孢桿菌稀釋液100 μL加入孔2、孔3、孔4 中，3 個重復。置于4 ℃冰箱中放置1 h 后，37 ℃培養(yǎng)24 h，用游標卡尺測量抑菌圈直徑大小。

2.2 牛至提取物和枯草芽孢桿菌不同配比對致病菌的抑制試驗

根據(jù)抑菌試驗結(jié)果，篩選出抑菌效果好的牛至提取物和枯草芽孢桿菌產(chǎn)品各4個，然后進行兩兩聯(lián)合抑菌試驗。具體試驗方法同2.1。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同廠家牛至提取物體外抑菌試驗

不同廠家牛至提取物對致病菌的抑制作用效果見表1。從表1 可知，所有廠家生產(chǎn)的牛至提取物均對大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門氏菌及產(chǎn)氣莢膜梭菌具有抑制作用，不同產(chǎn)品體外抑菌效果不同。OE-5 對大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門氏菌抑菌效果最好，抑菌圈直徑分別是14.51 mm、13.08 mm；OE-2 對產(chǎn)氣莢膜梭菌的抑菌圈直徑為15.80 mm，抑菌效果最好。綜上，體外抑菌效果較好的3個產(chǎn)品分別是OE-2、OE-4、OE-5，其次是OE-6 和OE-1，OE-3體外抑菌效果最差。

表1 不同廠家牛至提取物對致病菌的抑制作用

3.2 不同廠家枯草芽孢桿菌的體外抑菌試驗

不同廠家枯草芽孢桿菌對致病菌的抑制作用效果見表2。

表2數(shù)據(jù)顯示，不同廠家的枯草芽孢桿菌對致病菌的抑制作用不同，其中，BS-1和BS-5對大腸埃希氏菌具有抑制作用，BS-1 抑菌性優(yōu)于BS-5；BS-1、BS-4 和BS-6 對產(chǎn)氣莢膜梭菌有抑制作用，抑菌強弱順序依次為BS-1>BS-6>BS-4；所有產(chǎn)品對鼠傷寒沙門氏菌均沒有抑制作用。綜上，體外抑菌效果較好的4個產(chǎn)品分別是BS-1、BS-4、BS-5、BS-6。

表2 不同廠家枯草芽孢桿菌對致病菌的抑制作用

2.3 牛至提取物和枯草芽孢桿菌組合抑菌作用

牛至提取物和枯草芽孢桿菌組合抑菌作用見表3。

表3 續(xù)

表3 牛至提取物和枯草芽孢桿菌組合對致病菌的抑制作用

由表3可知，牛至提取物和枯草芽孢桿菌組合對致病菌的抑制作用效果不同，OE-2與BS-5復配對大腸埃希氏菌抑菌效果較好，抑菌圈直徑為11.74 mm；OE-2與BS-6復配對鼠傷寒沙門氏菌抑菌效果最好，抑菌圈直徑為10.45 mm；OE-2 與BS-4 對產(chǎn)氣莢膜梭菌的體外抑菌效果最好，抑菌圈直徑為12.01 mm。

4 討 論

隨著抗生素的禁用，微生態(tài)制劑和植物提取物成為研究的焦點。眾多學者研究證實，枯草芽孢桿菌對致病菌具有一定的抑制作用。張亞茹等[7]研究證實，枯草芽孢桿菌菌株N2-10對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均表現(xiàn)出黏附抑制作用，尤其是金黃色葡萄球菌，菌株細胞表面疏水性可達31.9%。本試驗條件下，不同廠家枯草芽孢桿菌抑菌作用不同，僅個別廠家枯草芽孢桿菌對大腸埃希氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌表現(xiàn)出一定的抑制作用。枯草芽孢桿菌抑菌主要是通過產(chǎn)生代謝產(chǎn)物以及與致病菌競爭營養(yǎng)空間兩個途徑來實現(xiàn)對病原菌的抑制作用。枯草芽孢桿菌代謝產(chǎn)生的細菌素對致病菌L.monocytogens（ATCC19114）及M.luleus2016表現(xiàn)出較強的殺菌及抑菌活性[8]。翟召靜[9]提取枯草芽孢桿菌的代謝物，經(jīng)蛋白質(zhì)組學分析發(fā)現(xiàn)在10 個差異上調(diào)蛋白中，大部分有降解RNA、抑制蛋白質(zhì)表達的功能，特別是mRNA干擾酶，可引起細胞凋亡。

牛至油、香芹酚、百里香酚對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌具有顯著體外抑菌作用[10]。李定剛等[11]研究證實，不同工藝來源的牛至提取物都能在一定程度上降低大腸桿菌所致十二指腸腸道損傷，改善小鼠腸道組織結(jié)構(gòu)。本試驗條件下，牛至提取物對大腸埃希氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌均表現(xiàn)出較好的抑菌效果。牛至提取物所含酚類、萜類、非揮發(fā)性物質(zhì)均具有一定的抑菌作用。酚類物質(zhì)抗微生物的原理是作用于細菌的細胞膜，使細菌細胞膜的蛋白質(zhì)變性，改變細胞膜的通透性，或與細胞膜中的磷脂反應，破壞蛋白質(zhì)的合成，使微生物細胞的生長受抑制。萜類物質(zhì)能影響細菌中DNA 的自我復制過程，從而抑制細菌的繁殖和生長過程，進而抑制菌體的生長[12]。牛至非揮發(fā)性物質(zhì)對金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌具有較好的抗菌活性[13]。目前未見牛至提取物和枯草芽孢桿菌聯(lián)合抑菌的報道，但是從聯(lián)合試驗結(jié)果也可以看出，OE-2 和BS-5 對大腸埃希氏菌、OE-2 和BS-6 對鼠傷寒沙門氏菌、OE-2 和BS-4對產(chǎn)氣莢膜梭菌均具有較好的體外抑菌效果。

抑菌試驗的影響因素眾多，試驗方法[14]、試驗條件[15]、質(zhì)控菌株[16]等因素都會影響抑菌試驗的結(jié)果及敏感性，本試驗控制在同一試驗條件下，研究對同一株質(zhì)控菌株的影響，不同廠家的產(chǎn)品抑菌結(jié)果存在差異的原因主要由產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝、主成分及含量的差異等因素造成。

5 結(jié) 論

體外抑菌結(jié)果表明，牛至提取物和枯草芽孢桿菌均表現(xiàn)出一定的體外抑菌效果。OE-5，BS-1體外抑菌效果最好。聯(lián)合抑菌試驗中OE-2和BS-5對大腸埃希氏菌、OE-2 和BS-6 對鼠傷寒沙門氏菌、0E-2和BS-4對產(chǎn)氣莢膜梭菌也表現(xiàn)出一定的抑菌效果，可進一步研究其在飼料配方及動物試驗中的應用效果。