呂月鳳，王英英，曾偉偉，王 慶，李瑩瑩，尹紀(jì)元，楊 廣，石存斌，王雅慧，李 波,4

（1.天津農(nóng)學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，天津 300384；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)藥物開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省水產(chǎn)動(dòng)物免疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510385；3.佛山學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院/廣東省動(dòng)物分子設(shè)計(jì)與精密育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 佛山 440605；4.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命科學(xué)學(xué)院，上海 201306）

羅非魚是世界上第2 大淡水養(yǎng)殖魚類[1]，僅次于鯉科魚類，每年全球產(chǎn)量約450萬t，在超過100個(gè)國家養(yǎng)殖[2]。自2009 年開始，由羅非魚湖病毒（TiLV）感染引起的新發(fā)烈性疫病羅非魚湖病毒?。═iLVD）在全球多個(gè)國家相繼暴發(fā)，對(duì)全球的羅非魚養(yǎng)殖業(yè)構(gòu)成了重大威脅[3-4]。截至目前，TiLV 的致病機(jī)理尚未明確，亦缺乏有效的防治措施。

目前的研究表明，TiLV 不僅感染羅非魚及其變種，也可感染其他魚類，如施氏魮、絲足鱸、孔雀鱸、河鯉[5]、爪哇鯉、鯰魚等。目前TiLV 易感宿主都是大型魚類，小型魚類斑馬魚是最常用魚類動(dòng)物模型，有學(xué)者研究表明斑馬魚對(duì)TiLV 不敏感[6]。稀有鮈鯽屬鯉科鮈鯽屬，因其體形小、生命力強(qiáng)、飼養(yǎng)簡單、不易染病，屬于周年連續(xù)產(chǎn)卵魚類，被認(rèn)為是一種優(yōu)良的實(shí)驗(yàn)魚類。筆者前期試驗(yàn)表明，稀有鮈鯽對(duì)TiLV 敏感。本研究以稀有鮈鯽為研究對(duì)象，探索TiLV-2017A 株對(duì)稀有鮈鯽的感染特性，以期為為羅非魚湖病毒病的病原學(xué)研究及防治技術(shù)開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 稀有鮈鯽和病毒

健康的稀有鮈鯽，中國科學(xué)院水生生物研究惠贈(zèng)；羅非魚湖病毒毒株（TiLV-2017A），德國動(dòng)物健康研究所Sven Bergmann博士惠贈(zèng)[7]。

1.2 魚體攻毒和樣品采集

感染組的稀有鮈鯽腹腔注射20 μL 濃度為105.67TCID50·mL-1的TiLV-2017A，對(duì)照組注射20 μL PBS液。分別在注射后第1、2、3、4和5天隨機(jī)取9條稀有鮈鯽麻醉后處死，取鰓、脾臟、腎臟和腸道，檢測(cè)白細(xì)胞介素-8（IL-8）、NK 細(xì)胞增強(qiáng)因子（NF-κB）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、Mx 蛋白（Mx）、Toll 樣 受 體3（TLR3）、髓 樣 分 化 因 子（MyD88）、α-干擾素（IFN-α）和Toll樣受體5（TLR5）等免疫相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量。注射后第1、3、5、7、9、11、13 和15 天隨機(jī)取3 條稀有鮈鯽麻醉后處死，分別取肝脾腎混樣，用于測(cè)TiLV-2017A 在稀有鮈鯽體內(nèi)不同時(shí)間的病毒載量變化。注射后第5 天，取3 條稀有鮈鯽（瀕死魚）進(jìn)行組織切片，將試驗(yàn)魚麻醉后處死，縱切剖開后整條用Bouin’s 固定劑固定，用于組織切片制備。

1.3 RNA提取及病毒載量分析

將組織樣品勻漿，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用熒光定量試劑盒在ABI 7500 熒光定量儀上進(jìn)行qRT-PCR，設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。

1.4 免疫基因表達(dá)分析

研究中測(cè)定免疫相關(guān)基因的引物序列見表1。qRT-PCR 反應(yīng)過程：95 ℃5 min，95 ℃5 s，60 ℃30 s，40個(gè)循環(huán)。

表1 免疫相關(guān)基因的引物序

SYBR Green 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的檢測(cè)結(jié)果由ABI 7500 Real-Time PCR System 自帶軟件進(jìn)行分析，相對(duì)表達(dá)量用ΔΔCT法進(jìn)行計(jì)算。

1.5 組織切片觀察

將Bouin’s 固定劑固定的稀有鮈鯽，在梯度濃度乙醇水溶液中脫水，然后與二甲苯混合，進(jìn)行組織包埋、切片、染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

所有的統(tǒng)計(jì)分析都是用SPSS 22.0 版軟件進(jìn)行的。試驗(yàn)魚與對(duì)照魚之間基因表達(dá)水平的差異用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，P<0.05 表示差異顯著，P<0.01 表示差異極顯著。圖表用GraphPad Prism 6 軟件生成，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床癥狀和死亡率

對(duì)照組稀有鮈鯽在試驗(yàn)期間無任何癥狀，健康無死亡魚。感染組稀有鮈鯽在感染后第7天開始出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、腹下點(diǎn)狀和片狀出血、腹脹和眼球混濁等癥狀（見圖1），與感染TiLV-2017A 的羅非魚癥狀一致。感染組稀有鮈鯽的死亡率為10%。

圖1 稀有鮈鯽感染TiLV-2017A后的臨床癥狀

2.2 病毒載量檢測(cè)

感染組稀有鮈鯽肝脾腎混樣中病毒載量見圖2。該病毒在第4天開始緩慢增殖，然后在第13天達(dá)到峰值，病毒拷貝數(shù)為1.582×108拷貝數(shù)·μL-1。

圖2 稀有鮈鯽感染TiLV-2017A后肝脾腎混樣組織中病毒載量

2.3 免疫相關(guān)表達(dá)基因檢測(cè)

為了研究TiLV-2017A 株感染后稀有鮈鯽組織內(nèi)免疫相關(guān)基因的變化，以稀有鮈鯽的脾臟、腎臟、腸和鰓組織為樣本，測(cè)定其IFN-α、IL-1β、IL-8、Mx、MyD88、NF-κB、TLR3和TLR5基因的相對(duì)表達(dá)量，結(jié)果見圖3。

圖3 稀有鮈鯽TiLV-2017A株感染后脾臟、腎臟、鰓、腸道組織中免疫相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量

由圖3可知，脾臟、鰓、腎臟和腸組織中IL-8基因的表達(dá)水平均上調(diào)，在腸組織中上調(diào)顯著，相對(duì)表達(dá)水平達(dá)到74.790倍。鰓、腸和腎臟中NF-κB基因的表達(dá)水平上調(diào)。IL-1β的基因表達(dá)在脾臟、鰓、腎臟和腸組織中均上調(diào)。腸組織中Mx 的表達(dá)水平顯著增加，在第4天增加了165.897倍。脾臟、鰓和腸中TLR3的mRNA 表達(dá)上調(diào)，在鰓中顯著上調(diào)54.538 倍，在腸組織中顯著上調(diào)61.133 倍。MyD88的表達(dá)水平在腸中顯著上調(diào)。腎和鰓中IFNα的mRNA水平顯著降低，并且在腸中顯著上調(diào)。腸中TLR5基因的表達(dá)在第2天顯著增加140.611倍。

2.4 組織病理切片觀察

為觀察TiLV-2017A 感染稀有鮈鯽后的組織病理變化，取感染后第5 天稀有鮈鯽的肝臟、脾臟、腎臟、頭腎和鰓組織，經(jīng)過固定、脫水、包埋、切片和蘇木素-伊紅染色后置于光學(xué)顯微鏡下觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)稀有鮈鯽肝臟、脾臟、腎臟、鰓和頭腎均出現(xiàn)明顯的病理變化，見圖4。

圖4 稀有鮈鯽感染TiLV-2017A后第5天組織病理學(xué)研究

由圖4 可知，肝臟中肝細(xì)胞腫大和空泡化，細(xì)胞間隙增大，肝竇萎縮；脾臟中淋巴細(xì)胞增多，噬鐵血黃素明顯增多；腎小管細(xì)胞間隙變大且腎組織中噬鐵血黃素增多；感染魚頭腎可見大量嗜堿性的腫大細(xì)胞，且組織結(jié)構(gòu)松散，大量細(xì)胞發(fā)生核固縮，紅細(xì)胞浸潤；鰓組織中鰓絲部分?jǐn)嗔?，鰓絲潰爛不成形和上皮細(xì)胞脫落。

3 討論與結(jié)論

稀有鮈鯽是一種小型的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，具有生長速度快、易繁殖、遺傳背景清晰的特點(diǎn)，可感染草魚呼腸孤病毒等水生動(dòng)物病毒。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)稀有鮈鯽可感染TiLV。本研究的目的是通過測(cè)定稀有鮈鯽感染TiLV 后的臨床癥狀、病毒載量和免疫相關(guān)因子相對(duì)表達(dá)量的變化情況，進(jìn)而研究稀有鮈鯽感染TiLV的致病機(jī)制。

稀有鮈鯽感染TiLV-2017A 第7 天，魚體開始出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，腹側(cè)及腹下皮膚點(diǎn)狀和片狀出血，內(nèi)臟出血，腹部鼓脹有腹水，眼部出現(xiàn)眼睛突出、晶狀體渾濁，游動(dòng)不規(guī)則伴有神經(jīng)癥狀。測(cè)定稀有鮈鯽感染TiLV-2017A 毒株后肝臟、脾臟和腎臟混樣組織第1、3、5、7、9、11、13和15天時(shí)的病毒載量，結(jié)果表明稀有鮈鯽在感染TiLV-2017A 后的第13 天病毒載量達(dá)到峰值，為1.582×108拷貝數(shù)·μL-1。該結(jié)果與胡虎子[8]在羅非魚感染TiLV的研究結(jié)果基本一致。

K.K.Mugimba 等[9]研究了兩種促炎細(xì)胞因IL-1β和TNF-α在TiLV 感染的紅羅非魚和灰羅非魚腦、頭腎和肝臟中的表達(dá)，均在各組織中有不同程度的上調(diào)。在斑馬魚腹腔注射TiLV試驗(yàn)中啟動(dòng)IL-1β、TNF-α、TLR3、IL-8、TFNγ1-2 和Mx 等相關(guān)免疫基因的表達(dá)[6]。在本研究中以稀有鮈鯽的肝臟、脾臟、腸和鰓組織為樣本，測(cè)定其感染TiLV-2017A 后 體 內(nèi)IL-8、NF-kB、IL-1β、TNF-α、Mx、TLR3、MyD88、IFNα 和TLR5 基因的相對(duì)表達(dá)量。脾臟、鰓、腎臟和腸組織中各基因的表達(dá)水平均有不同幅度的上調(diào)。因此說稀有鮈鯽可以作為研究TiLV 與宿主相互作用的病毒免疫逃逸模式魚。病理切片結(jié)果與李嘉波等[10]的這5 個(gè)組織H.E染色結(jié)果一致。肝細(xì)胞腫大和空泡化，肝竇萎縮；脾臟中淋巴細(xì)胞增多，噬鐵血黃素明顯增多；腎組織中噬鐵血黃素增多；鰓組織中鰓絲部分?jǐn)嗔?，鰓絲潰爛不成形和上皮細(xì)胞脫落；頭腎可見大量嗜堿性的腫大細(xì)胞，且組織結(jié)構(gòu)松散，大量細(xì)胞發(fā)生核固縮，紅細(xì)胞浸潤。

筆者前期研究[11]表明，感染了TiLV-2017A 的羅非魚的死亡率高達(dá)100%。然而，在本研究中，TiLV-2017A 感染稀有鮈鯽死亡率為10%左右，而大多數(shù)魚能抵抗病毒而存活，稀有鮈鯽在感染TiLV后如何發(fā)揮其抗病毒作用需要進(jìn)一步研究。