胡修忠，向敏，余婕，劉辰暉，夏瑜，陶弼菲，周源，王定發(fā)，程蕾

（武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所，武漢 430208）

熱應(yīng)激是指機體在高溫條件下對熱暴露所做出的非特異性生理反應(yīng)的總和[1]。公牛睪丸溫度比體溫低2～6℃，這對于產(chǎn)生形態(tài)正常、有活力和可育的精子至關(guān)重要[2]。高溫可引起睪丸組織氧化應(yīng)激，導(dǎo)致生精上皮細(xì)胞凋亡和死亡，精子活力和密度降低[3]。當(dāng)睪丸溫度升高到38℃以上時，睪丸的生精機能受到損害，造成畸形精子和死亡精子數(shù)量增多，精子質(zhì)量嚴(yán)重下降[4]。高溫?zé)釕?yīng)激所致的精液品質(zhì)下降需經(jīng)7～9周才能恢復(fù)正常[3]。

核因子E2相關(guān)因子（nuclear factor E2 related factor，Nrf2）是氧化應(yīng)激表達的一種關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，通過抗氧化反應(yīng)原件（antioxidant responsive element，ARE）調(diào)節(jié)下游靶基因完成抗氧化、保護機體的功能，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗衰老、抗細(xì)胞損傷、保護生育等作用[5]。研究表明，精子活力降低的男性精子中的Nrf2基因mRNA表達水平往往較低[6]，而Nrf2啟動子區(qū)單核苷酸多態(tài)性與Nrf2表達降低相關(guān)，并導(dǎo)致少、弱精子癥[7]。Nrf2基因敲除小鼠睪丸組織氧化應(yīng)激增加，細(xì)胞凋亡增加，精子數(shù)量顯著降低，但血清睪酮水平?jīng)]有發(fā)生變化[8]。抗氧化劑（N-乙酰半胱氨酸）可以提高少、弱精子癥患者Nrf2基因表達和抗氧化酶水平，顯著增加精子密度和活力，而異常形態(tài)精子和DNA斷裂率顯著降低[9]?；诖耍敬卧囼炌ㄟ^下調(diào)體外培養(yǎng)牛睪丸細(xì)胞中Nrf2的表達，研究Nrf2對牛睪丸細(xì)胞的增殖、抗氧化基因表達的影響，探索Nrf2蛋白在牛睪丸細(xì)胞中的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑

RNA提取試劑盒（TaKaRa MiniBEST Universal RNAExtraction Kit）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（primeScriptTMRT reagent kit with gDNA Eraser），購自Takara公司；熒光定量試劑盒（SYBR? Green Realtime PCR Master Mix），購自TOYOBO公司；Lipofectamine?3000，購自Invitrogen公司；CCK-8，購自Solarbio公司；DMEM/F12培養(yǎng)基，購自Hyclone公司；胎牛血清，購自Gibco公司；抗體，購自Proteintech公司。

1.2 睪丸細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

睪丸細(xì)胞的分離和培養(yǎng)采用文獻建立的方法[10]。取出睪丸，剝?nèi)ゲG丸白膜及血管，剪碎轉(zhuǎn)入一個裝有玻璃珠并經(jīng)高溫滅菌處理的抽濾瓶中，繼續(xù)向抽濾瓶中加入細(xì)胞消化液直至浸沒全部玻璃珠及放置的睪丸組織，放置于37℃水浴鍋中消化30min。在超凈工作臺內(nèi)慢慢將消化液倒出，再向瓶中加入DMEM/F12工作液進行中和，倒去培養(yǎng)基，強烈振搖，使消化后的睪丸細(xì)胞充分從組織塊上分離出來，再用培養(yǎng)基沖洗玻璃珠，洗液即成為細(xì)胞懸液，倒入細(xì)胞瓶中，置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 siRNA合成

根據(jù)GeneBank中查得Nrf2基因（登錄號：NM_001011678.2）的全基因序列，根據(jù)siRNA基本設(shè)計原則設(shè)計，由上海英駿生物科技有限公司合成靶向Nrf2基因的siRNA（siRNA-1672表示）（表1）。

表1 siRNA序列

1.4 瞬時轉(zhuǎn)染

接種牛睪丸細(xì)胞1×105個/孔于6孔板中，當(dāng)細(xì)胞生長至70%融合度時進行轉(zhuǎn)染，具體操作參照Invitrogen公司Lipofectamine 3000試劑盒說明書進行。試驗分組：對照組和轉(zhuǎn)染NRF2特異性siRNA試驗組(試驗組)。轉(zhuǎn)染24～72h后用于基因表達檢測、蛋白表達和細(xì)胞生物學(xué)實驗。

1.5 實時熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)染后對基因mRNA表達的影響

1.5.1 引物設(shè)計

根據(jù)GenBank中牛Nrf2基因mRNA（登錄號：NM_001011678.2）、HO-1基因mRNA（登錄號：NM_001014912.1）、NQO1基因mRNA（登錄號：NM_001034535.1）和β-Actin基因mRNA（登錄號：AY141970.1）序列，利用Primer premier 5.0軟件設(shè)計引物，引物序列及產(chǎn)物大小見表2。引物由武漢擎科生物技術(shù)有限公司合成，用滅菌三蒸水溶解稀釋成10μmol/L，-20℃保存。

表2 引物序列

1.5.2 總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

按照RNA提取試劑盒說明書提取各處理組細(xì)胞中的總RNA，測定RNA濃度及純度。按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明方法反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.5.3 實時定量PCR

以反轉(zhuǎn)錄所得cDNA為模板，利用BIO-RAD IQ5實時定量PCR儀進行試驗，PCR反應(yīng)體系：SYBR GREEN 12.5μL，上下游引物各0.75μL，模板RNA 2μL，ddH2O 9μL。反應(yīng)參數(shù)：94℃預(yù)變性10s，94℃變性5s，60℃ 10s，40個循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后獲得熔解曲線。

1.5.4 Western boltting檢測

取不同處理組培養(yǎng)的牛睪丸細(xì)胞，分別提取總蛋白，采用BCA法測蛋白濃度，依此調(diào)整上樣量，100V電泳轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，封閉后加入兔抗人多克隆抗體（1:500），4℃過夜，二抗孵育1h；用小鼠抗β-Actin單克隆抗體作為內(nèi)參。用Thermo ECL試劑盒進行底物顯色，操作按照說明書，顯影、定影、沖洗膠片、掃描膠片，用BandScan分析膠片灰度值。

1.5.5 CCK-8檢測細(xì)胞增殖

收集轉(zhuǎn)染24h后及未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，制備成單細(xì)胞懸液。以5×103個/孔接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100μL，并設(shè)置5個復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞1、2、3、4、5d后，向每孔加入10μ L CCK-8溶液于37℃培養(yǎng)1h，然后用酶標(biāo)儀檢測450nm的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 原代細(xì)胞體外培養(yǎng)形態(tài)及特點

經(jīng)培養(yǎng)12h后，細(xì)胞貼壁良好，部分細(xì)胞已開始拉伸變長。細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞樣生長，當(dāng)細(xì)胞長滿單層時透光性好，見圖1。

圖1 牛原代睪丸細(xì)胞光鏡照片（X100）

2.2 siRNA對細(xì)胞Nrf2基因mRNA表達的影響

通過RT-PCR檢測siRNA-1672轉(zhuǎn)染牛睪丸細(xì)胞24h后Nrf2 mRNA表達水平。試驗檢測了終濃度為50nmol/L時對牛睪丸細(xì)胞Nrf2基因mRNA表達水平的影響。結(jié)果顯示試驗組中轉(zhuǎn)染siRNA-1672的Nrf2基因mRNA表達水平明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01，圖2），提示試驗組中Nrf2基因被有效沉默。終濃度為50nmol/L時具有較好干擾效果，后續(xù)試驗處理濃度均為該濃度。

圖2 siRNA-1672處理細(xì)胞24h后Nrf2基因mRNA的相對表達量

2.3 siRNA干擾對Nrf2基因在蛋白質(zhì)水平的影響

通過Western boltting及灰度值分析，檢測了Nrf2基因被干擾72h后Nrf2蛋白質(zhì)表達量的變化，結(jié)果見圖3。siRNA-1672干擾72h后Nrf2蛋白質(zhì)表達明顯下降，與對照組差異達到顯著水平（P＜0.05）。

圖3 細(xì)胞中Nrf2表達情況

2.4 siRNA對細(xì)胞增殖的影響

cck-8法檢測發(fā)現(xiàn)，經(jīng)siRNA-1672作用后的試驗組細(xì)胞增殖能力明顯減弱，4d后兩組細(xì)胞增殖能力均開始減弱。試驗組與對照組之間存在差異（圖4）。

圖4 siRNA對細(xì)胞增殖的影響

2.5 siRNA干擾對HO-1和NQO1基因mRNA表達的影響

siRNA-1672轉(zhuǎn)染牛睪丸細(xì)胞24h后HO-1和NQO1基因mRNA表達情況見圖5。從圖中可以看出HO-1和NQO1基因mRNA表達明顯降低，HO-1基因的mRNA表達量約為對照組的60%（圖5A），NQO1基因的mRNA表達量低于對照組的80%（圖5B）。因此，隨著Nrf2基因表達被抑制，HO-1和NQO1基因的表達量也隨之降低。

圖5 siRNA處理細(xì)胞24h后HO-1和NQO1基因mRNA的相對表達量

2.6 siRNA干擾對HO-1和NQO1基因蛋白表達水平的影響

通過Western blot法分別檢測siRNA-1672轉(zhuǎn)染牛睪丸細(xì)胞72h后HO-1和NQO1基因的蛋白相對表達水平，結(jié)果見圖6。結(jié)果顯示在Nrf2基因被有效沉默后，HO-1基因和NQO1基因的蛋白表達明顯下降。

圖6 HO-1和NQO1蛋白質(zhì)表達檢測

3 討論

Nrf2是調(diào)控細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的重要轉(zhuǎn)錄因子，在抗氧化應(yīng)激中起到關(guān)鍵作用，通過誘導(dǎo)調(diào)控一系列基因的表達，使細(xì)胞處于穩(wěn)定狀態(tài)，維持機體氧化還原動態(tài)平衡。目前，多達上百種的基因被認(rèn)為跟Nrf2的調(diào)控相關(guān)，其中很多都是氧化還原敏感的轉(zhuǎn)錄因子[11]。熱應(yīng)激對雄性生殖影響的研究發(fā)現(xiàn)，Nrf2抗氧化信號通路被激活以抵抗環(huán)境高溫應(yīng)激，降低睪丸細(xì)胞和睪丸支持細(xì)胞的凋亡[12,13]。而且Nrf2能降低重金屬對雄性生殖細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷[14]。此外，Nrf2基因缺失也會導(dǎo)致睪丸和附睪氧化應(yīng)激，從而干擾精子發(fā)生、降低生育能力；而且隨著年齡的增長，生精小管損傷不斷累積[15]，生育能力進一步下降。Nrf2基因缺失也會導(dǎo)致胎盤功能降低，氧化應(yīng)激水平增加，胎兒體重明顯降低[16]。隨著Nrf2功能的深度挖掘，其在生殖上面的作用也被重視起來。

HO-1和NQO1均是受Nrf2調(diào)控的下游基因，HO-1具有抗炎、抗細(xì)胞凋亡、抗氧化和抗增殖作用，在許多條件下起到保護作用。HO-1酶是Nrf2的主要靶點之一，也是Nrf2依賴的細(xì)胞對氧化應(yīng)激和外源性物質(zhì)反應(yīng)的主要效應(yīng)物[17]。當(dāng)環(huán)境高溫或外源性物質(zhì)引起睪丸組織損傷或發(fā)生氧化應(yīng)激時，Nrf2上調(diào)HO-1的表達，增強抵抗氧化損傷能力，發(fā)揮細(xì)胞保護作用[12,18]。而NQO1在氧化應(yīng)激狀態(tài)下可以維持關(guān)鍵蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性[19]，減少氧化損傷。前人研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激時雄性睪丸組織的HO-1和NQO1在Nrf2的調(diào)控下表達上升，以降低氧化應(yīng)激帶來的傷害[12,14,18]。

本試驗通過設(shè)計干擾siRNA，降低Nrf2在牛睪丸細(xì)胞中的表達，觀察其對氧化應(yīng)激相關(guān)的基因HO-1和NQO1表達情況。結(jié)果顯示，siRNA-1672在終濃度為50nmol/L時具有較好干擾效果。Nrf2表達下降時，HO-1和NQO1在mRNA水平上顯著下降，說明Nrf2對這兩個基因的表達存在一定的影響，而且HO-1和NQO1蛋白質(zhì)水平上表達也降低。Li等人通過RNA干擾技術(shù)降低143B和MG63細(xì)胞中Nrf2的表達，發(fā)現(xiàn)在Nrf2被抑制后，HO-1和NOQ1的表達也明顯降低，細(xì)胞內(nèi)活性氧水平升高[19]。本試驗中，睪丸細(xì)胞中Nrf2表達被抑制后，HO-1和NQO1的表達也隨之降低，該結(jié)果與前人研究結(jié)果相符合。但Nrf2在睪丸細(xì)胞中的功能及其作用機制需要進一步的明確。

4 結(jié)論

設(shè)計的siRNA-1672能顯著降低Nrf2的mRNA表達水平。同時，HO-1和NQO1在mRNA水平上顯著下降，顯示Nrf2對HO-1和NQO1存在一定的調(diào)控作用。而且在Nrf2被抑制后HO-1和NQO1的蛋白表達也隨之降低。Nrf2對睪丸細(xì)胞的作用，以及對HO-1和NQO1調(diào)控機制需要進一步的研究。