張悅婷,杜 揚(yáng),李云峰,李振峰,韓瑩琰,劉超杰,郝敬虹

(農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/北京農(nóng)學(xué)院 植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京102206)

葉用萵苣，可供食用的重要多葉類蔬菜之一[1]。質(zhì)脆微甜，口感獨(dú)特，廣受人們喜愛。其適宜生長的環(huán)境溫度為15～20 ℃，高于30 ℃易于抽薹，致使食用價(jià)值降低，帶來減產(chǎn)乃至絕收的嚴(yán)重危害；在周年生產(chǎn)中生菜的高溫易抽薹問題非常嚴(yán)峻，目前急需解決。在眾多影響抽薹的因子中，植物激素如GA、IAA對(duì)抽薹開花起著重要作用[2]。其中被最早發(fā)現(xiàn)的生長素,參與調(diào)控植物生長發(fā)育中的各個(gè)過程[3]。

生長素的感知和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)依賴于多種成分的協(xié)同作用，其中生長素應(yīng)答基因受三種類型的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子控制，分別是生長素應(yīng)答因子(ARFs)、Aux/IAAs以及Topless(TPLs)[4]。其中生長素/吲哚-3-乙酸(Aux/IAA)蛋白起著關(guān)鍵作用[5]。典型的ARF蛋白，其N端有一類似于B3 DNA的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，而在C端則有類似于Aux/IAA蛋白的結(jié)構(gòu)域III區(qū)和 IV區(qū)；ARF蛋白可以通過其DNA結(jié)合域與生長素的應(yīng)答基因啟動(dòng)子區(qū)域即生長素應(yīng)答元件(AuxREs)結(jié)合，包括Aux/IAAs亦可；ARF蛋白作為轉(zhuǎn)錄激活因子或是轉(zhuǎn)錄抑制因子是由它們中間區(qū)域的氨基酸組成所決定[6]。有研究表明：在擬南芥中，兩個(gè)相對(duì)應(yīng)的生長素響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子ARF6和ARF8協(xié)同調(diào)控雄蕊和雌蕊的成熟[7]。

就目前研究結(jié)果可知，ARF6蛋白是植物體內(nèi)一種非常重要的轉(zhuǎn)錄因子，其參與多種激素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，對(duì)植物的生長發(fā)育有著重要的作用及意義。然而LsARF6基因與葉用萵苣抽薹性的相關(guān)關(guān)系尚不明確，此次試驗(yàn)通過克隆LsARF6基因，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，同時(shí)運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(Quantitative Real-time PCR)分析葉用萵苣LsARF6基因在不同溫度處理下各個(gè)時(shí)期的相對(duì)表達(dá)量的情況，為進(jìn)一步研究ARF6蛋白在葉用萵苣抽薹過程中的作用機(jī)制奠定良好的基礎(chǔ)。

1 材料及方法

1.1 育苗材料及處理方法

材料是農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室編號(hào)保存的易抽薹葉用萵苣品種(GB-30)。200粒種子催芽，長出胚根，將芽播種于穴盤中。待幼苗長至4葉1心時(shí)定植于營養(yǎng)缽內(nèi)，放入植物生長箱內(nèi)生長。待緩苗2～3 d，對(duì)幼苗進(jìn)行處理：相對(duì)濕度均為60%，光周期均為14 h/10 h。對(duì)照組：20 ℃(日)/13 ℃(夜)；高溫組：33 ℃(日)/25 ℃(夜)；于處理的第0、2、4、8、16、24天取植株的莖及成熟葉片，置于-80 ℃保存?zhèn)溆茫?次重復(fù)。

1.2 總RNA提取和cDNA第一鏈的合成

使用總RNA快速提取試劑盒提取樣品總RNA；再使用cDNA第一鏈合成試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，所制cDNA于-20 ℃儲(chǔ)存，為后續(xù)LsARF6基因克隆做準(zhǔn)備以及為實(shí)時(shí)熒光定量PCR做模板。

1.3 LsARF6基因克隆及實(shí)時(shí)熒光定量PCR

1.3.1LsARF6基因克隆 以轉(zhuǎn)錄組測序中的LsARF6序列為模板，使用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)克隆引物(LsARF6-F和LsARF6-R)和qRT-PCR引物(LsARF6-qF和LsARF6-qR)，選用葉用萵苣18S作為內(nèi)參基因(表1)。由生工生物工程股份有限公司提供引物。

表1 試驗(yàn)所用引物Tab.1 Primers used in the study

克隆LsARF6基因，經(jīng)PCR反應(yīng)所得產(chǎn)物于4 ℃保存。

上述PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)紫外照射儀確定目的條帶位置，使用DNA凝膠回收試劑盒回收目的條帶，將回收獲得的目的條帶連接到pClone007 Versatile Simple Vector Kit克隆載體上，隨后導(dǎo)入到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中培養(yǎng)，最后將菌液送至北京博邁德基因技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 以對(duì)照組和高溫組各個(gè)時(shí)期的莖cDNA為模板，進(jìn)行qRT-PCR。反應(yīng)程序如下：95 ℃、30 s(預(yù)變性)，95 ℃、10 s(變性)，60 ℃、30 s(退火)，39次循環(huán)。采用2-ΔΔCt相對(duì)定量分析方法進(jìn)行計(jì)算LsARF6基因的相對(duì)表達(dá)量，試驗(yàn)數(shù)據(jù)的方差及顯著性分析處理采用SPSS 20.0軟件，表達(dá)量作圖使用Excel 2019。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉用萵苣ARF6基因克隆

PCR擴(kuò)增得到一條長2 436 bp的特異性條帶(圖1)，測序結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組序列具有絕對(duì)一致性(100%)。

圖1 擴(kuò)增的LsARF6基因Fig.1 AmplifiedLsARF6 gene

運(yùn)用NCBI ORF finder分析知曉，此閱讀框編碼了811個(gè)氨基酸。

2.2 葉用萵苣LSARF6氨基酸序列及結(jié)構(gòu)域分析

2.2.1 預(yù)測LsARF6氨基酸二級(jí)結(jié)構(gòu) 運(yùn)用NPS的SOPMA分析，該蛋白由無規(guī)則卷曲(含56.23%)、α螺旋(含25.15%)、延伸鏈(含15.04%)和β轉(zhuǎn)角(3.58%)組成。

2.2.2 LsARF6氨基酸序列比對(duì) 對(duì)葉用萵苣、洋薊及青蒿的LsARF6氨基酸進(jìn)行序列比對(duì)(DNAMAN 9.0軟件)，結(jié)果表明ARF6蛋白與其他物種(洋薊及青蒿)的蛋白具有較高的相似性。其中LSARF6蛋白具有FSQQPPAQELI、RDLHDNEWKFRHIFRGQPKRHLLTTGWSVFVSAKRL VAGDSVLFIWNEKN、EFVIPLAK、RSVKVGWDESTAGERQPRVSLWEIEPLTTFPMYPSQFP LRLKRPWPPGLP等保守結(jié)構(gòu)(圖2)。

圖2 LsARF6氨基酸序列比對(duì)分析Fig.2 Alignment and analysis of amino acid of LsARF6

2.2.3 LsARF6蛋白的保守結(jié)構(gòu)分析 利用NCBI CD-search分析，該蛋白具有三種結(jié)構(gòu)域(B3、Auxin_resp、AUX_IAA)(圖3)，他們分別是ARF家族蛋白與DNA結(jié)合的區(qū)域，ARF家族的保守結(jié)構(gòu)域，ARF家族蛋白二聚體化的結(jié)合位點(diǎn)。這三個(gè)結(jié)構(gòu)域?yàn)榇蟛糠值腁RF家族蛋白所共有，由此推斷LsARF6蛋白可能具有ARF家族蛋白的功能。

圖3 LsARF6蛋白的保守結(jié)構(gòu)域Fig.3 Conserved domain of LsARF6 protein

2.2.4 LsARF6氨基酸序列分析 利用ProtParam 軟件得知，該蛋白分子量為89 004.40，理論等電點(diǎn)為5.91；其含較多的亮氨酸(含10.5%)、絲氨酸(含10.4%)、而甘氨酸(含8.3%)；色氨酸(含1.8%)、酪氨酸(含1.7%)、半胱氨酸(含1.1%)含量較少，為不穩(wěn)定蛋白(不穩(wěn)定指數(shù)60.34)；親水性平均值為-0.357，預(yù)測為親水性蛋白。

2.2.5 分析LsARF6蛋白信號(hào)肽 運(yùn)用SignalP 5.0所得數(shù)據(jù)分析，可知其不屬于分泌蛋白(不具信號(hào)肽，無跨膜結(jié)構(gòu))。

2.2.6 LsARF6蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位 使用Psort軟件進(jìn)行預(yù)測，預(yù)測結(jié)果表明其亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)主要定位于細(xì)胞核。由此可知LsARF6蛋白可能在細(xì)胞核內(nèi)與生長素原初響應(yīng)基因的啟動(dòng)子上的(AuxREs)TGTCTC元件特異性結(jié)合，進(jìn)而激活或抑制基因的表達(dá)，調(diào)控生長素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

2.2.7 LsARF6保守序列分析 利用MEME軟件對(duì)LsARF6的保守基因序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白有位于B3、Auxin_resp、AUX_IAA保守結(jié)構(gòu)域內(nèi)的3個(gè)高度保守的基因序列(圖4)。

圖4 LsARF6的保守基因序列組成分析Fig.4 Sequence composition analysis of conserved genes LsARF6

2.2.8 LsARF6蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測 進(jìn)一步利用SWISS-MODEL推測LsARF6蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)，其匹配上多個(gè)ARF蛋白的模型，且含有ARF家族特有的保守結(jié)構(gòu)，這一結(jié)果與NCBI CD-search分析的結(jié)果相吻合(圖5)。

圖5 LsARF6蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.5 The tertiary structure prediction of LsARF6

2.3 葉用萵苣ARF6蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

將得到的LsARF6的氨基酸序列，在NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)它與仙人掌、月季、向日葵等10種植物中ARF6蛋白具有較高的同源性。利用軟件MEGA 7.0構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。由圖6可以看出，這11條氨基酸序列明顯地分為三類，刺苞菜薊和向日葵等為第一類，兩者都是菊科作物，親緣關(guān)系最近；油菜等為第二類；蕪菁為第三類。

圖6 LsARF6蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.6 Phylogenetic analysis of LsARF6

2.4 葉用萵苣ARF6基因高溫處理后表達(dá)分析

由圖7可以看出，LsARF6基因在高溫組中的表達(dá)量均呈上升趨勢，并且其數(shù)值均高于常溫組。其中第8、16及24天的表達(dá)量差異明顯，均為極顯著差異。

綜合上述分析，得出結(jié)論：高溫促進(jìn)易抽薹品種GB-30中LsARF6基因的表達(dá)，由此推測LsARF6基因可能在葉用萵苣抽薹過程中發(fā)揮功能。

*代表顯著，P<0.05;**代表極顯著，P<0.01* stands for significant, P<0.05; ** stands for extremely significant, P<0.01圖7 葉用萵苣GB-30在20/13 ℃、33/25 ℃下ARF6基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.7 Relative expression analysis of ARF6 under 20/13 ℃,33/25 ℃ of lettuce GB-30

3 討 論

在ARF家族成員的研究中，Guilfoyle等[8]對(duì)擬南芥的ARF家族進(jìn)行了鑒定，共鑒定出23個(gè)AtARFs，其中 AtARF6在氨基酸序列的中間區(qū)富含谷氨酰胺(Q)，絲氨酸(S)和亮氨酸(L)殘基，形成了一個(gè)激活結(jié)構(gòu)域(AD)，能夠激活下游生長素響應(yīng)基因的表達(dá)。這極有可能是SlARF6基因發(fā)揮抽薹作用的一種機(jī)制。相關(guān)研究表明：在莖及花器官中SlARF6表達(dá)水平最高,在果實(shí)中也有少量表達(dá)，此結(jié)果可以證明SlARF6基因參與果實(shí)的形成和發(fā)育過程，在一定程度上可以表明ARF家族基因在番茄發(fā)育過程中具有基因功能的多樣性[9]。而王飛燕等研究發(fā)現(xiàn)，葉片內(nèi)ARF6幾乎不表達(dá)，在果實(shí)中有較高的表達(dá)量；試驗(yàn)結(jié)果顯示番茄中的SLARF6、SLARF8-1經(jīng)過2,4-D處理后表達(dá)量下調(diào)，其中經(jīng)GA處理后SlARF6表達(dá)量也下調(diào)；這說明內(nèi)源生長素信號(hào)在植物體內(nèi)的傳導(dǎo)過程對(duì)花及幼果的生長發(fā)育極為重要，而外源激素(如赤霉素、生長素)在一定程度上能夠影響某些生長素相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)而對(duì)果實(shí)的發(fā)育進(jìn)行誘導(dǎo)調(diào)節(jié)[10]。這與此次試驗(yàn)結(jié)果有一定相似性，與高溫上調(diào)SlARF6基因表達(dá)促進(jìn)抽薹是相一致的。Nagpal等研究發(fā)現(xiàn)：整朵花生長素水平在花的成熟過程中沒有發(fā)生變化，可推測生長素可能僅在特定的環(huán)境條件下或者是在花的局部器官或組織中調(diào)控花的成熟；ARF6和ARF8單突變體和倍半突變體(一個(gè)突變?yōu)榧兒希硪粋€(gè)突變?yōu)殡s合)延緩了雄蕊發(fā)育，降低了植株的繁殖能力，由此可知ARF6和ARF8基因可能影響了花的成熟時(shí)間[11]。這同時(shí)也佐證了為什么SlARF6基因是在高溫條件下促進(jìn)葉用萵苣抽薹。隨著各物種全基因組的研究開展，ARF家族的成員在擬南芥、煙草、甘草和小麥等植物中陸續(xù)得到鑒定[12-14]。這為研究ARF轉(zhuǎn)錄因子家族在植物生長發(fā)育過程中的功能和作用機(jī)制，以及如何參與生長素和其他植物激素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑等研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

此次試驗(yàn)通過對(duì)易抽薹品種中LsARF6基因在不同溫度下表達(dá)量的分析發(fā)現(xiàn)，高溫組和對(duì)照組在處理過后的第2天出現(xiàn)差異,第8天開始及之后處理天數(shù)差異極顯著，LsARF6基因的表達(dá)水平受到高溫的促進(jìn)而顯著上調(diào)，說明了LsARF6基因可能在葉用萵苣抽薹過程中發(fā)揮著重要的作用。后續(xù)可開展LsARF6調(diào)節(jié)葉用萵苣高溫抽薹的作用機(jī)制研究。