李云峰，李振峰，杜 楊，韓瑩琰，劉超杰，郝敬虹

(北京農(nóng)學(xué)院 植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206)

葉用萵苣，俗稱生菜，菊科萵苣屬。根據(jù)聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織的數(shù)據(jù)，2019 年全球生菜和菊苣的產(chǎn)量超過 2 900 萬噸，在所有葉類蔬菜中排名第三。生菜因其品種多樣、口味多樣、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、富含維生素、葉酸和礦物質(zhì)而在全球廣受歡迎。生菜已成為研究菊科及相關(guān)植物的典范。但是葉用萵苣作為一種高溫敏感型葉用蔬菜，在高溫的脅迫下極易向生殖生長(zhǎng)轉(zhuǎn)變[1]。當(dāng)外界環(huán)境溫度超過30 ℃時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致先期抽薹，造成生菜產(chǎn)量和食用價(jià)值的下降。

在外界環(huán)境條件以及植物自身遺傳因素的影響下,常常會(huì)導(dǎo)致花芽分化提前的現(xiàn)象,造成植物的先期抽薹[2]。宋有金等發(fā)現(xiàn)熱脅迫對(duì)開花有促進(jìn)作用[3]。植物對(duì)高溫脅迫的響應(yīng)是一個(gè)極其復(fù)雜過程,當(dāng)外界溫度升高時(shí),細(xì)胞膜上的脅迫感受器膜蛋白通過信號(hào)傳導(dǎo)途徑傳遞至細(xì)胞核，從而影響相關(guān)基因的表達(dá)[4]。由此可知,高溫脅迫應(yīng)答信號(hào)可以引起高溫脅迫應(yīng)答信號(hào)通過傳導(dǎo)神經(jīng)途徑細(xì)胞中的多種抗體基因組的表達(dá),參與抑制調(diào)控萵苣植物多種抗體的高溫脅迫應(yīng)答[5],但是在應(yīng)答調(diào)控過程中許多未知調(diào)控機(jī)制理論反應(yīng)機(jī)制尚不清楚,挖掘和研究探討這些未知調(diào)控機(jī)制對(duì)深入研究葉用萵苣的抗高溫反應(yīng)調(diào)控機(jī)制具有重要理論意義。

核體系酵母文庫(kù)的建立對(duì)研究蛋白間相互作用意義重大。李紫良通過酵母單雜試驗(yàn)證明了TaTMS5是TaERF7的下游靶基因,得出高溫和長(zhǎng)日照條件時(shí),小麥中TaERF7基因表達(dá)量降低,同時(shí)對(duì)TaTMS5的抑制作用減弱結(jié)論[6]。原貴波等通過酵母雙雜交技術(shù)找到了SlMPK1的互作蛋白SlVQ6蛋白,并通過GST pull-down技術(shù)驗(yàn)證SlMPK1與SlVQ6的互作,為研究SlVQ6介導(dǎo)的高溫應(yīng)答信號(hào)通路奠定基礎(chǔ)[7]。Distelfeld等通過酵母三雜交試驗(yàn)證明在植物中,VRN2與三種 NF-YB 蛋白中的兩種之間的相互作用[8]。由此可知,建立一個(gè)高質(zhì)量的葉用萵苣核體系酵母文庫(kù)對(duì)探究高溫脅迫下葉用萵苣機(jī)制起到至關(guān)重要作用。

GB-30是作為高溫條件下極易抽薹品種，可作為模擬夏季高溫脅迫下生菜發(fā)生抽薹現(xiàn)象的代表品種，通過對(duì)其35 ℃高溫處理8 d后，取其莖尖以及葉片采用Geteway方法建立cDNA文庫(kù)，為后續(xù)探究高溫脅迫下葉用萵苣抽薹相關(guān)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

GB-30葉用萵苣材料由北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院園藝學(xué)生菜課題組提供，試驗(yàn)材料種植于人工氣候培養(yǎng)箱。生長(zhǎng)條件可參照生菜最適溫度[9]。待幼苗長(zhǎng)至6葉1心時(shí)對(duì)試驗(yàn)材料進(jìn)行高溫脅迫處理。高溫處理?xiàng)l件為：光強(qiáng)以及光照不變，溫度提升至白天33 ℃，晚上25 ℃。取8 d高溫處理的莖尖和新生葉片1 g等量混合，進(jìn)行液氮速凍，并對(duì)其立刻進(jìn)行RNA提取，此為高溫脅迫下GB-30生菜核體系酵母文庫(kù)構(gòu)建試驗(yàn)材料。

1.2 葉片總 RNA 提取與 mRNA分離純化

對(duì)高溫處理的樣品混樣，進(jìn)行總RNA提取，采用CTAB法。接著對(duì) mRNA進(jìn)行分離純化(具體可參考Oligotex mRNA Midi Kit說明書)。總RNA用DEPC水溶解至體積為500μL；500 μL buffer OBB和55 μL Oligotex suspension；70 ℃，5 min；25 ℃，30 min；12 000 r/min,2 min；去除上清;加入400 μL 洗脫液(OW2)；混勻后轉(zhuǎn)到吸附柱,12 000 r/min,1 min；重復(fù)1次；加入70 μL buffer OEB (70 ℃)；12 000 r/min,1min；重復(fù)mRNA。向分離后的mRNA加入NH4OAC，無水乙醇以及糖原，-80 ℃,25 min；4 ℃，13 000 r/min,20 min；加1 mL 70%乙醇25 ℃，離心，去除上清；空氣中晾干，7 μL水，即為純化后的mRNA。

1.3 葉用萵苣酵母雙雜交初級(jí)cDNA文庫(kù)構(gòu)建

1.3.1 cDNA第一鏈的合成 取適量純化后mRNA，按照試劑盒加入biotin-attB2-Oligo(dT) Primer 1 μL,dNTPs 1 μL，70 ℃ 5 min，45 ℃ 2 min。之后加5×First Strand Buffer，4 μL；DTT(0.1 M)2 μL；SuperScript III RT 適量,45 ℃ 20 min；50 ℃ 20 min；55 ℃ 20 min。

1.3.2 cDNA第二鏈的合成 在上述反應(yīng)液中加入DEPC-treated water 91 μL,5 X Second Strand Buffer,30 μL,10 mM(each)dNTPs 3 μL,E.coli.DNA Ligase(10 U/μL) 1 μL,E.coli.DNA Polymerase I(10 U/μL) 4 μL,E.coli.RNaseH(2 U/μL) 1 μL, 補(bǔ)水至150 μL。16 ℃，2 h； 加入T4 DNA Polymerase 2 μL，16 ℃，10 min；加入0.5 M EDTA (pH=8.0)10 μL，補(bǔ)水至300 μL；加入酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1) 300 μL，混勻，靜置1 min；14 000 r/min離心5 min，取上清液于新的離心管中，加入Glycogen (20 μg/μL) 1 μL，5 M 醋酸胺150 μL,100% ethano,1 125 μL，-80 ℃，15 min；14 000 r/min，4 ℃，25 min；去上清；加入1 mL 70%乙醇；14 000 r/min，4 ℃，離心3 min，去上清；重復(fù)1次； 室溫25 ℃晾干cDNA；用104 μL DEPC溶解cDNA。

1.3.3 cDNA與三框attB1重組接頭連接(3種接頭分別各連接1份) 先將attB1 Adapter (1 μg/μL) F，4.5 μL，attB1 Adapter (1 μg/μL) R 4.5 μL，10×NEB Buffer 2 1 μL，95 ℃，5 min, 25 ℃，45 min。加入cDNA 34 μL，10×Ligation Buffer 5 μL，T4 DNA Ligase(1 U/μL) NEB 1 μL，16 ℃，24 h。

1.3.4 cDNA分級(jí)分離及收集 向分級(jí)柱中加入0.8 mLTEN Buffer清洗柱子，重復(fù)3次；將上訴制備好的3份50 μL的cDNA產(chǎn)物混勻加入柱子中，TEN Buffer 100 μL，收集濾液，向其中加入Glycogen (20 μg/μL) 1 μL, NH4OAc 0.5 μL，100% ethanol 2.5 μL，-80 ℃，15 min；14 000 r/min，4 ℃，25 min，去上清；70%乙醇 1 mL；14 000 r/min，4 ℃，3 min；去上清；重復(fù)1次；室溫5 min ；DEPC 13 μL溶解cDNA，即cDNA分級(jí)分離及收集。

1.3.5 BP重組反應(yīng) 取cDNA 13 μL,加入pDONR222(200 ng/μL)2 μL,BP Clonase? II enzyme mix 5 μL,補(bǔ)水至20 μL,25 ℃,20 h。在上述溶液中加入dd-water 80 μL,Glycogen (20 μg/μL)1 μL,5 M NH4OAc 50 μL,100% ethanol 375 μL,-80 ℃,15 min；13 000 r/min,4 ℃,25 min,去上清;70%乙醇1 mL,14 000 r/min,4 ℃,3 min，去上清；重復(fù)1次,室溫晾干cDNA；TE Buffer 10 μL溶解cDNA；加入50 μL電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞,冰上10 min,加入電轉(zhuǎn)杯,冰上5 min;迅速加入SOC培養(yǎng)基4 mL;將電轉(zhuǎn)物取入到新的15 mL離心管,37 ℃,2 250 r/min,1 h;之后涂布平板用于庫(kù)容量鑒定;剩余培養(yǎng)物加入甘油至終濃度20%存于-80 ℃,此即為初級(jí)文庫(kù)菌液。

1.4 高溫脅迫下GB-30葉用萵苣酵母雙雜交次級(jí)cDNA文庫(kù)構(gòu)建

將驗(yàn)證合格的Uncut文庫(kù),搖菌,30 ℃過夜培養(yǎng),提取質(zhì)粒建立LR重組反應(yīng):Uncut 文庫(kù)質(zhì)(300 ng/uL)1 μL, pGADT7-DEST (300 ng/μL)1 μL,LR Clonase II Mix 4 μL,ddH2O 14 μL,25 ℃,16 h。電轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH10B,同初級(jí)cDNA文庫(kù)構(gòu)建步驟一樣,得到的即為次級(jí)文庫(kù)菌液。

1.5 cDNA文庫(kù)(Uncut型)文庫(kù)質(zhì)量鑒定

1.5.1 初級(jí)及次級(jí)文庫(kù)庫(kù)容量的鑒定 取轉(zhuǎn)化后細(xì)菌原液10 μL稀釋100倍后,從中取出50 μL涂布LB平板(初級(jí)文庫(kù)抗性卡那霉素,次級(jí)文庫(kù)抗性為氨芐青霉素),第2天計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)方法:CFU/mL=平板上的克隆數(shù)/50 μL ×100倍×1×103μL,文庫(kù)總CFU= CFU/mL ×文庫(kù)菌液總體積(mL)。

1.5.2 重組率和插入片段長(zhǎng)度鑒定 隨機(jī)挑取24個(gè)克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，反應(yīng)體系為dd H2O 16.2 μL，10×PCR Buffer 2.0 μL，dNTP(10 mM)0.5 μL，pDONR222F(20 μM)0.5 μL，pDONR222R(20 μM)0.5 μL，DNA Polymerase(5 U/μL)0.3 μL。PCR反應(yīng)條件為94 ℃，5 min；94 ℃，30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min；25循環(huán)，72 ℃ 5 min。1 % Agarose凝膠電泳鑒定。

1.5.3 酵母文庫(kù)質(zhì)量鑒定 用5 μg作為酵母文庫(kù)質(zhì)粒中的一個(gè)轉(zhuǎn)化子和Y187酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化菌株,在每個(gè)直徑為150 mm的平板上均勻橫向鋪展300 μL,共計(jì)100塊平板。30 ℃倒置溫育平板，從當(dāng)天開始起一直到每個(gè)細(xì)胞克隆后的結(jié)果開始出現(xiàn)(3～6 d),4 ℃需要冷卻倒置平板3～4 h,每個(gè)倒置平板每天需要連續(xù)加入5 mL已經(jīng)冷凍后的細(xì)胞培養(yǎng)基,混勻,匯集所有細(xì)胞中的液體,計(jì)算每個(gè)細(xì)胞的密度,確定文庫(kù)滴度。在溫育平鋪100 μL按照1∶100,1∶1 000,1∶10 000稀釋液在酵母缺陷型培養(yǎng)基(SD-Leu)平板上,在30 ℃條件下，倒置溫育平板直到每個(gè)細(xì)胞克隆結(jié)果開始出現(xiàn)。挑克隆,30 ℃,250 r/min,12 h；10 000 r/min,2 min,去上清。0.2% SDS,200 μL重懸菌液,25 ℃,15 min,離心；取1 μL上清液作為PCR模板,依次加入ddH2O 19.5 μL,10×Advantage 2 PCR Buffer 2.5 μL,50×dNTP Mix 0.5 μL,T7SP Primer 0.5 μL,3′ AD Primer 0.5 μL,50×Advantage 2 Polymerase Mix 0.5 μL,94 ℃,3 min,94 ℃，30 sec,55 ℃ 30 sec,72 ℃，2 min,35個(gè)循環(huán),72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物取5 μL用于電泳檢測(cè)。

2 結(jié)論與分析

2.1 葉用萵苣mRNA與ds cDNA質(zhì)量檢測(cè)

mRNA結(jié)果顯示條帶在500～2 000 bp的范圍內(nèi)呈均勻性的彌散彈性分布,證明有效cDNA文庫(kù)mRNA條帶質(zhì)量保持較好,未發(fā)生化學(xué)降解。ds cDNA條帶在較大長(zhǎng)度范圍內(nèi)結(jié)構(gòu)呈彌散性均勻縱向分布,因此得出其cDNA條帶結(jié)構(gòu)完整性較好,質(zhì)量性能較高,可用于構(gòu)建高溫脅迫下GB-30葉用萵苣酵母雙雜交cDNA文庫(kù)。

2.2 初級(jí)cDNA文庫(kù)構(gòu)建與鑒定

經(jīng)生物學(xué)重復(fù)計(jì)算GB-30葉用萵苣核體系cDNA酵母文庫(kù)平板上共長(zhǎng)出1700個(gè)有效克隆,得到的初級(jí)cDNA文庫(kù)平板滴度大約1.36×107cfu/mL。隨機(jī)重組選取的4個(gè)插入克隆進(jìn)行PCR檢測(cè),24個(gè)插入克隆結(jié)果顯示均超出克隆條帶,重組成功率平均為100%,該檢測(cè)結(jié)果從一定很大程度上有效降低了該克隆假說的陽性。24個(gè)插入克隆全部擴(kuò)增為5 00 bp以上,且每個(gè)插入克隆片段平均插入長(zhǎng)度最大>1 000 bp(圖1)。由此可 知,以上分析數(shù)據(jù)已經(jīng)達(dá)到用于構(gòu)建高溫脅迫下GB-30葉用萵苣cDNA數(shù)據(jù)文庫(kù)的標(biāo)準(zhǔn)。

圖1 初級(jí)文庫(kù)重組率鑒定Fig.1 Identification of recombination rate of Primary Library

2.3 核體系次級(jí)文庫(kù)鑒定

經(jīng)分析計(jì)算GB-30葉用萵苣次級(jí)酵母cDNA文庫(kù)平板上共長(zhǎng)出1300個(gè)單克隆,次級(jí)酵母cDNA用的文庫(kù)平板滴度大約為1.04×107cfu/mL。從次級(jí)cDNA等文庫(kù)克隆培養(yǎng)基中隨機(jī)選擇的24個(gè)新型克隆經(jīng)過PCR等檢測(cè),凝膠電泳克隆圖譜中的條帶結(jié)果顯示24個(gè)新型克隆全部經(jīng)過擴(kuò)增后均有條帶,重組成功率平均為100%且克隆插入每個(gè)片段平均時(shí)間長(zhǎng)度>1 000 bp(圖2)。由此可知,以上統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)已經(jīng)達(dá)到如何構(gòu)建能在高溫環(huán)境脅迫下GB-30葉用綠葉萵苣作為酵母雙雜交的cDNA文庫(kù)的標(biāo)準(zhǔn)。

圖2 插入片段大小及重組率鑒定Fig.2 Identification of insert fragment size and recombination rate

2.4 cDNA文庫(kù)質(zhì)量鑒定

該cDNA酵母文庫(kù)平板上共產(chǎn)出1 000個(gè)核體系克隆子,文庫(kù)平板滴度平均為1.0×108cells/mL。利用PCR來檢測(cè)葉用萵苣桿菌cDNA體系酵母化學(xué)文庫(kù)平板重組率與克隆插入每個(gè)片段平均長(zhǎng)度,在本試驗(yàn)的核體系酵母cDNA文庫(kù)平板培養(yǎng)基中隨機(jī)選擇24個(gè)核體克隆進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)凝膠電泳克隆圖譜儀的檢測(cè)數(shù)據(jù)結(jié)果顯示,24個(gè)核體克隆全部經(jīng)過擴(kuò)增后均有條帶,重組的效率平均為100%,且克隆插入每個(gè)片段平均插入長(zhǎng)度為> 1 000 bp(圖3)。由此可知,以上檢測(cè)數(shù)據(jù)已經(jīng)達(dá)到了對(duì)構(gòu)建細(xì)胞高溫層的脅迫下GB-30葉用萵苣核體系酵母cDNA文庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)。

圖3 酵母克隆鑒定Fig.3 Yeast cloning and identification

3 討論與結(jié)論

高質(zhì)量的cDNA文庫(kù)是篩選蛋白互作的前提。核體系酵母文庫(kù)的質(zhì)量主要是通過文庫(kù)的庫(kù)容量判定。對(duì)于一個(gè)含有104個(gè)轉(zhuǎn)錄本的物種來說，106庫(kù)容的cDNA文庫(kù)是對(duì)該物種所有的轉(zhuǎn)錄本的100倍覆蓋。本試驗(yàn)初級(jí)文庫(kù)的庫(kù)容量為1.36×107，次級(jí)文庫(kù)的庫(kù)容量為1.04×107，由此可知本試驗(yàn)構(gòu)建的核體系酵母文庫(kù)已達(dá)到質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。王玉姣, 陳姍姍等構(gòu)建的cDNA文庫(kù)庫(kù)容量為1.13×106[10]；許向陽等人構(gòu)建的干旱脅迫下‘Micro-Tom’番茄酵母雙雜交cDNA文庫(kù)庫(kù)容量為3.4×106[11],相比本試驗(yàn)構(gòu)建的cDNA文庫(kù)基因信息更全面。cDNA文庫(kù)質(zhì)量是否達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)的另一個(gè)鑒定方法是插入片段及重組率。本試驗(yàn)初級(jí)、次級(jí)文庫(kù)的插入片段平均長(zhǎng)度均>1 000 bp，重組率為100%，是達(dá)到文庫(kù)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求的。許向陽等構(gòu)建的文庫(kù)插入片段平均長(zhǎng)度皆為 1 000 bp,重組率是100%[11]，與本試驗(yàn)結(jié)果一致；劉露露等構(gòu)建的文庫(kù)插入片段平均長(zhǎng)度皆為 1 000 bp,重組率是96%[12]。由此可見本試驗(yàn)構(gòu)建的核體系酵母cDNA文庫(kù)假陽性更低，質(zhì)量更符合標(biāo)準(zhǔn)。

核體系酵母文庫(kù)非常適用于一個(gè)誘餌內(nèi)的基因直接定位保存在一個(gè)核細(xì)胞系統(tǒng)內(nèi)的各類蛋白。已知一個(gè)誘餌內(nèi)的基因定位有一些跨細(xì)胞膜內(nèi)的區(qū)，也那么可以直接考慮把這些跨細(xì)胞膜內(nèi)的區(qū)基因切除以后直接用來找核系統(tǒng)體系酵母文庫(kù)蛋白篩庫(kù)[13]。酵母雙雜交結(jié)合技術(shù)目前作為一項(xiàng)較成熟的生物技術(shù)，已可用于藥物臨床試驗(yàn)研究多種抗原單體蛋白質(zhì)間相互作用,具有同時(shí)不斷發(fā)現(xiàn)新的多種抗原單體蛋白質(zhì)和其他抗原蛋白質(zhì)的相互作用功能、在一個(gè)抗原細(xì)胞體內(nèi)同時(shí)發(fā)現(xiàn)研究多種單體抗原和其他多種抗體的相互作用、篩選多種抗原藥物的相互作用源和對(duì)應(yīng)位點(diǎn)、建立多個(gè)抗原基因分子組織與抗原蛋白質(zhì)的相互連鎖作用光譜結(jié)構(gòu)圖等重要技術(shù)功能,其應(yīng)用也會(huì)越來越重要[14]。劉愛麗在進(jìn)行研究一種熱激肽肽反應(yīng)酶與相關(guān)分子剪接蛋白因子的互補(bǔ)操作剪接蛋白時(shí)通過雙雜交剪接技術(shù),從擬南芥cDNA文庫(kù)中共篩選到了43個(gè)單克隆體,通過驗(yàn)證最終確定18個(gè)待選基因與目的基因在體外相互作用。而大部分基因在植物體內(nèi)與目的基因也是相互作用的[15]。

本試驗(yàn)以高溫脅迫GB-30葉用萵苣莖尖及葉片混合物為材料，通過Geteway技術(shù)構(gòu)建核體系酵母cDNA文庫(kù)。結(jié)果表明：構(gòu)建的核體系酵母文庫(kù)已達(dá)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，總克隆數(shù) 1.36×107CFU/mL，重組率為 100%，平均插入片段長(zhǎng)度>1 000 bp。