張 濤， 劉冰倩*， 李君葒， 吳 念， 蘇麗霞

(貴州省合成藥物工程實(shí)驗(yàn)室，貴州大學(xué)藥學(xué)院,貴州貴陽(yáng) 550025)

Cu是人體必需的微量元素，也是多種酶，如細(xì)胞色素氧化酶、硝酸還原酶和超氧化物歧化酶的輔基和結(jié)構(gòu)成分[1]。但Cu2+在人類(lèi)和動(dòng)物肝臟中積累會(huì)產(chǎn)生一定的毒性，導(dǎo)致DNA損傷[2]，從而引發(fā)嚴(yán)重疾病，如：神經(jīng)退行性疾病、肝炎、肺炎、皮膚疾病等[3]。世界衛(wèi)生組織(WHO)、美國(guó)環(huán)境保護(hù)署(EPA)以及中國(guó)衛(wèi)生部規(guī)定飲用水中Cu2+的最大允許量分別為2 mg/L[4]、20 μmol/L[5]和1 mg/L[6]。目前，檢測(cè)Cu2+的方法主要有溶出伏安法[7]、原子吸收光譜法[8]、電化學(xué)方法[9]、光電化學(xué)方法[10]和熒光分析法[11]等。上述方法有較好的選擇性和較高的靈敏度，但儀器昂貴、預(yù)處理復(fù)雜、檢測(cè)成本高。因此，亟待開(kāi)發(fā)一種快速、靈敏且操作簡(jiǎn)單，并能進(jìn)行實(shí)時(shí)高通量篩選的檢測(cè)方法。

比色傳感技術(shù)可以通過(guò)肉眼辨別顏色變化，由于其簡(jiǎn)單、低廉且無(wú)需高昂設(shè)備，已被廣泛應(yīng)用于臨床及環(huán)境檢測(cè)中[12,13]。比色檢測(cè)法常用氧化顯色劑4，3，3，5，5-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)體系，利用過(guò)氧化物酶催化TMB-H2O2體系生成有色產(chǎn)物[14]?；诩{米材料的模擬酶即納米酶，由于其較天然酶相比具有成本低、合成容易、在極端環(huán)境下穩(wěn)定性好、易于調(diào)制等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，已被廣泛應(yīng)用于多個(gè)研究領(lǐng)域，如污染物去除、干細(xì)胞生長(zhǎng)、神經(jīng)保護(hù)、癌癥治療和傳感器/生物傳感器應(yīng)用[15 - 21]。近年來(lái)，MnO2因其低成本、高活性/穩(wěn)定性、無(wú)毒性和豐富的可用性而受到人們的廣泛關(guān)注[22 - 24]。2012年，Zhang等發(fā)現(xiàn)MnO2納米材料具有類(lèi)似氧化酶的活性[25,26]。聚苯胺(PANI)因?yàn)榫哂袑?dǎo)電性、化學(xué)和熱穩(wěn)定性、無(wú)毒和容易獲得等優(yōu)良性能，從而引起了人們廣泛的研究興趣[27]。Au和PANI可以包覆在磁珠表面，以負(fù)載更多的MnO2，目的在于放大信號(hào)。

本研究旨在開(kāi)發(fā)了一種磁性功能化磁珠/金/聚苯胺/MnO2復(fù)合材料(MB/Au/PANI/MnO2)，在不需要額外的氧化劑的情況下就可以直接氧化TMB顯藍(lán)色。在半胱氨酸(L-Cys)的作用下，該磁性復(fù)合材料無(wú)法實(shí)現(xiàn)其氧化性能。但當(dāng)Cu2+存在時(shí)，L-Cys與Cu2+相互作用生成硫醇鹽，從而恢復(fù)磁性復(fù)合材料直接氧化TMB顯色，可間接檢測(cè)Cu2+的濃度。該復(fù)合材料的使用較大程度上減少了反應(yīng)所需的材料用量，如Yang等[26]所用的MnO2的體積為180 μL，而本方法中只需10 μL。發(fā)展的方法提高了反應(yīng)的靈敏度和穩(wěn)定性，對(duì)Cu2+有較好的選擇性，且具有便捷，操作簡(jiǎn)單，抗干擾能力強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)實(shí)際樣品實(shí)時(shí)高通量篩選。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

ΜV-5500PC紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)；ST3100 pH計(jì)(奧豪斯儀器有限公司)；BSA224電子天平(賽利多斯科學(xué)儀器有限公司)。

FeCl3(分析純，國(guó)藥集團(tuán)有限公司)；聚乙烯吡咯烷酮K-30(PVP)(分析純，上海強(qiáng)順公司)；(NH4)2S2O8(分析純，天津科密歐公司)；聚苯胺(PANI)(分析純，成都金山公司)；HAuCl4(凱馬生化有限公司)。其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 MB/Au/PANI/MnO2的合成Fe3O4磁珠(MB)合成方法參照本課題組以往研究[27]。取1 mL MB加入PVP溶液中(0.1 g PVP+10 mL去離子水)，孵育1 h；再加入2 mL 1%HAuCl4溶液，超聲5 min；隨后加入0.3 mL苯胺和10 mL 1 mol/L HCl(1 mol/L)的混合液，同時(shí)加入0.18 g (NH4)2S2O8，在室溫條件下反應(yīng)2 h。最后用乙醇清洗2次進(jìn)行磁性分離，得到的產(chǎn)物在60 ℃的條件下烘干，稱(chēng)量備用。

取5 mg上述制品分散于5 mL去離子水中，超聲均勻，加入5 mg KMnO4，室溫條件下振蕩反應(yīng)1 h，用去離子水洗滌2次后進(jìn)行磁性分離，即得磁性復(fù)合材料MB/Au/PANI/MnO2。

1.2.2 比色法檢測(cè)Cu2+室溫下，在520 μL的NaAc-HAc緩沖溶液(pH=4)中加入100 μL不同濃度Cu2+，90 μL 400 μmol/L L-Cys和10 μL MB/Au/PANI/MnO2，反應(yīng)10 min后，加入100 μL 6 mmol/L TMB，混勻后立即檢測(cè)其200～800 nm波長(zhǎng)之間的吸光度值。所有相關(guān)測(cè)試均在室溫下進(jìn)行，且所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果均為3次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測(cè)原理

本實(shí)驗(yàn)采用比色法，以TMB溶液為顯色體系，MB/Au/PANI/MnO2為直接氧化材料，在L-Cys介導(dǎo)下實(shí)現(xiàn)對(duì)Cu2+的快速檢測(cè)。如圖1所示，MB/Au/PANI/MnO2可以直接氧化TMB生成藍(lán)色陽(yáng)離子自由基(oxTMB)，而L-Cys可有效抑制oxTMB的生成，抑制TMB被氧化顯色。但L-Cys與Cu2+可形成不溶性的硫醇鹽，即R-S -M′、R-S -M″-S -R(M′、M″為1價(jià)、2價(jià)金屬離子)。在Cu2+存在時(shí)，L-Cys與Cu2+反應(yīng)，導(dǎo)致TMB反應(yīng)體系中L-Cys減少，使MB/Au/PANI/MnO2材料氧化的oxTMB離子增多，反應(yīng)體系發(fā)生從淺到深的顏色變化。在652 nm的波長(zhǎng)下，反應(yīng)體系的吸光度值隨著Cu2+濃度的增加而逐漸增大，且呈線性變化。

圖1 基于磁性功能復(fù)合材料的比色法檢測(cè)Cu2+的示意圖

2.2 MB/Au/PANI/MnO2的表征

MB/Au/PANI/MnO2復(fù)合材料的合成是本實(shí)驗(yàn)方案順利進(jìn)行的先決條件。如圖2A和2B所示，合成的MB/Au/PANI/MnO2復(fù)合材料為類(lèi)球形，分散較好。我們進(jìn)一步利用紫外-可見(jiàn)吸收光譜(圖2C)和紅外光譜(圖2D)對(duì)材料進(jìn)行表征。由圖2C中可見(jiàn)，MB無(wú)明顯的吸收峰[27]，合成的MB/Au/PANI在350 nm、700 nm處有明顯的PANI的吸收峰[28]。如圖2D，MB/Au/PANI在804 cm-1、1 310 cm-1、1 480 cm-1和1 580 cm-1處有PANI的特征峰[29]，而MB/Au/PANI/MnO2在578 cm-1、1 126 cm-1、1 636 cm-1和3 415 cm-1處有MnO2的特征峰，這與文獻(xiàn)報(bào)道[30]一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，MB/Au/PANI/MnO2復(fù)合材料成功合成。

圖2 (A)MB/Au/PANI/MnO2掃描電鏡圖(2 μm)；(B)MB/Au/PANI/MnO2掃描電鏡圖(500 nm)；(C)不同樣品的紫外-可見(jiàn)吸收光譜圖；(D)不同樣品的傅里葉紅外光譜圖

2.3 可行性分析

如圖3A所示，MB/Au/PANI/MnO2和TMB無(wú)明顯特征吸收峰。其中，TMB與H2O2無(wú)催化顯色反應(yīng)(652 nm波長(zhǎng)處無(wú)特征吸收峰)，且MB/Au/PANI/MnO2與H2O2亦無(wú)催化顯色反應(yīng)。由圖3B可見(jiàn)，MB/Au/PANI/MnO2與TMB和H2O2反應(yīng)后，在652 nm波長(zhǎng)處有明顯特征吸收峰，但較MB/Au/PANI/MnO2與TMB的反應(yīng)特征吸收峰小。結(jié)果表明MB/Au/PANI/MnO2復(fù)合納米材料可單獨(dú)直接氧化TMB顯色。為進(jìn)一步證明MB/Au/PANI/MnO2復(fù)合材料的不可替代性，我們將MB、MB/Au和MB/Au/PANI這3種材料分別與TMB反應(yīng)。如圖3C所示，MB和MB/Au/PANI都無(wú)法氧化TMB顯色，而MB/Au能催化TMB顯色。表明MB/Au亦能直接氧化TMB顯色，但較MB/Au/PANI/MnO2的氧化性能弱。

復(fù)合材料合成過(guò)程中用到Mn2+，但Mn2+無(wú)法直接氧化TMB顯色。由圖3D可見(jiàn)，當(dāng)L-Cys單獨(dú)存在時(shí)，MB/Au/PANI/MnO2氧化性能明顯減弱。而Cu2+(100 nmol/L)和L-Cys同時(shí)存在，MB/Au/PANI/MnO2催化性能恢復(fù)。如果增加Cu2+濃度到1 mmol/L,在652 nm波長(zhǎng)處的吸光度值明顯較低濃度Cu2+(100 nmol/L)時(shí)增大。結(jié)果說(shuō)明本方案可用于Cu2+的檢測(cè)。

圖3 (A)MB/Au/PANI/MnO2+TMB+H2O2、MB/Au/PANI/MnO2+TMB紫外-可見(jiàn)吸收光譜圖；(B)MB/Au/PANI/MnO2、TMB、TMB+H2O2、MB/Au/PANI/MnO2+TMB+H2O2、MB/Au/PANI/MnO2+H2O2紫外-可見(jiàn)吸收光譜圖;(C)MB+TMB、MB/Au+TMB、MB/PANI/Au+TMB、MB/Au/PANI/MnO2+TMB紫外-可見(jiàn)吸收光譜圖;(D)TMB、Mn2++TMB、MB/Au/PANI/MnO2+L-Cys+TMB、MB/Au/PANI/MnO2+L-Cys+TMB+100 nmol/L Cu2+、MB/Au/PANI/MnO2+L-Cys+TMB+1 mmol/L Cu2+紫外-可見(jiàn)吸收光譜圖

2.4 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.4.1 NaAc-HAc緩沖溶液pH值緩沖液pH值可影響反應(yīng)體系吸光度值的大小，因此考察了不同pH值(pH=2、3、4、5、6、7)緩沖液對(duì)吸光度的影響，如圖4(A)所示，當(dāng)緩沖液pH為5時(shí)體系吸光度值最大。

2.4.2 MB/Au/PANI/MnO2與TMB反應(yīng)時(shí)間MB/Au/PANI/MnO2與TMB反應(yīng)顯色時(shí)間長(zhǎng)短會(huì)影響吸光度值大小。如圖4A，MB/Au/PANI/MnO2與TMB反應(yīng)2 min后吸光度值不再明顯增加，趨于平穩(wěn)。因此，本實(shí)驗(yàn)選用2 min為MB/Au/PANI/MnO2與TMB最佳反應(yīng)時(shí)間。

2.4.3 MB/Au/PANI/MnO2與L-Cys反應(yīng)時(shí)間MB/Au/PANI/MnO2與L-Cys反應(yīng)使得復(fù)合材料氧化顯色性能減弱，充足的反應(yīng)時(shí)間保障檢測(cè)條件的同一性。如圖4B所示，MB/Au/PANI/MnO2與L-Cys反應(yīng)20 min后吸光度值(652 nm)趨向平穩(wěn)。因此，選用20 min為MB/Au/PANI/MnO2與L-Cys的反應(yīng)時(shí)間。

2.4.4 Cu2+與L-Cys反應(yīng)時(shí)間Cu2+與L-Cys反應(yīng)生成不溶性硫醇鹽，從而釋放復(fù)合材料的氧化顯色性能。如圖4B，L-Cys與Cu2+反應(yīng)10 min時(shí)吸光度值最高。因此本實(shí)驗(yàn)選擇10 min作為Cu2+與L-Cys最優(yōu)反應(yīng)時(shí)間。

2.4.5 MB/Au/PANI/MnO2和L-Cys反應(yīng)用量基于本實(shí)驗(yàn)，MB/Au/PANI/MnO2直接氧化顯色響應(yīng)值達(dá)到較高水平，而L-Cys與MB/Au/PANI/MnO2反應(yīng)后使得響應(yīng)值回到較低水平，這有利于目標(biāo)物檢測(cè)。如圖4C、4D所示，10 μL MB/Au/PANI/MnO2的吸光度值適中；而90 μL L-Cys與10 μL MB/Au/PANI/MnO2反應(yīng)后吸光度值最小。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇10 μL MB/Au/PANI/MnO2和90 μL L-Cys進(jìn)行Cu2+的檢測(cè)。

圖4 (A) NaAc-HAc緩沖溶液pH值的優(yōu)化和MB/Au/PANI/MnO2與TMB反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化(粉色)；(B)MB/Au/PANI/MnO2與L-Cys反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化(a)和Cu2+與L-Cys反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化(b)；(C)L-Cys反應(yīng)體積優(yōu)化；(D)MB/Au/PANI/MnO2反應(yīng)體積優(yōu)化

2.5 比色法檢測(cè)Cu2+的分析性能

在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下，利用L-Cys介導(dǎo)MB/Au/PANI/MnO2氧化TMB顯色體系，測(cè)定不同濃度Cu2+的響應(yīng)信號(hào)。如圖5A所示，隨著Cu2+濃度的遞增，吸光度值亦逐漸增大，吸光度值與Cu2+濃度在1.0×102～1.0×107nmol/L范圍內(nèi)，其濃度的對(duì)數(shù)和對(duì)應(yīng)的吸光度值呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，線性方程為：y=0.0714x-0.1096，相關(guān)系數(shù)R2=0.9980，檢出限(3σ)為1.54 nmol/L。與文獻(xiàn)報(bào)道的Cu2+檢測(cè)方法相比，本方法具有操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)靈敏迅速等優(yōu)點(diǎn)(表1)。

表1 不同Cu2+傳感器檢測(cè)性能比較

2.6 檢測(cè)Cu2+的選擇性和重現(xiàn)性

我們選擇自來(lái)水中8種常見(jiàn)離子(K+、Mg2+、Ca2+、Na+、Fe3+、Mn2+、Cd2+、Zn2+)作為干擾物，考察本方法對(duì)Cu2+檢測(cè)的選擇性，干擾離子濃度與Cu2+濃度比為10∶1。如圖5B所示，唯有Cu2+能引起較明顯吸光度值增大，表明此比色傳感器對(duì)Cu2+有較好的選擇性。為了進(jìn)一步考察本方法對(duì)Cu2+檢測(cè)的重現(xiàn)性，選擇了102nmol/L、104nmol/L、106nmol/L 3個(gè)不同水平的Cu2+進(jìn)行檢測(cè)。其批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為4.9%、4.5%、3.5%；批間RSD分別為3.5%、2.7%、0.9%。結(jié)果表明本方法對(duì)Cu2+的檢測(cè)具有較好的重現(xiàn)性。

圖5 (A)檢測(cè)Cu2+濃度的校正曲線;(B)特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(Cu2+濃度為1 mmol/L，K+、Mg2+、Ca2+、Na+、Fe3+、Mn2+、Cd2+、Zn2+濃度為10 mmol/L)

MB/Au/PANI/MnO2催化材料于相同溫度條件(4 ℃)放置不同時(shí)間(7 d、14 d、30 d)后，分別對(duì)同一濃度Cu2+(0.1 mmol/L)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示7 d、14 d、30 d后，吸光度值分別為初始值的85.04%、75.36%、75.49%。因此，MB/Au/PANI/MnO2復(fù)合材料具有一定的穩(wěn)定性。

2.7 基于比色法對(duì)自來(lái)水樣品中Cu2+的檢測(cè)

為考察本方法用于實(shí)際樣品中Cu2+的檢測(cè)性能，選取自來(lái)水樣品進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，加入Cu2+濃度分別為0.1、1.0和10 mmol/L。如表2所示，自來(lái)水樣中Cu2+的加入回收率在85.03%～106.90%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.07%～5.04%。

表2 自來(lái)水樣中Cu2+的測(cè)定(n=3)

3 結(jié)論

利用Cu2+與L-Cys反應(yīng)生成不溶性硫醇鹽，進(jìn)而削弱L-Cys抑制MB/Au/PANI/MnO2氧化TMB生成藍(lán)色陽(yáng)離子自由基(oxTMB)的過(guò)程，構(gòu)建一種比色檢測(cè)Cu2+的方法。本方法操作簡(jiǎn)便，成本低廉，具有較好靈敏度和特異性，且能滿足實(shí)際樣品中Cu2+的檢測(cè)。此外，利用磁性復(fù)合材料作為反應(yīng)載體，利于分離和純化檢測(cè)環(huán)境，便于進(jìn)行樣品的高通量初步篩選。