支氣管哮喘是一種常見(jiàn)的慢性、非傳染性的異質(zhì)性疾病，以慢性氣道炎癥為特點(diǎn)。隨著城市化和生活方式改變，哮喘發(fā)病率逐年上升，應(yīng)用糖皮質(zhì)激素可控制氣道炎癥和高反應(yīng)性，但該治療伴隨多種不良反應(yīng)。哮喘的有效防治，是臨床上亟待解決的難題。

哮喘是基因異質(zhì)性與環(huán)境共同作用的結(jié)果，屋塵螨（HDM）是最常見(jiàn)的致敏原之一。致敏原引起氣道上皮細(xì)胞受損、分泌炎癥因子，營(yíng)造氣道炎癥微環(huán)境，與哮喘的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。關(guān)注氣道上皮細(xì)胞對(duì)于尋找有效、精準(zhǔn)的哮喘治療具有重要意義。

熱休克蛋白90（HSP90）作為一種損傷修復(fù)分子，發(fā)揮分子伴侶功能修飾客戶蛋白底物，包括多種炎癥相關(guān)蛋白。有研究表明HSP90誘導(dǎo)氣道杯狀細(xì)胞化生，在體內(nèi)模型中導(dǎo)致氣道炎癥惡化，說(shuō)明HSP90參與哮喘炎癥，但其機(jī)制尚未清晰闡明。

在Th2型哮喘患者中，氣道上皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激水平增高，與臨床癥狀嚴(yán)重性呈正相關(guān)，在哮喘小鼠模型中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物顯著升高，提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在哮喘炎癥中具有重要作用。HSP90調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白功能，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)，兩者緊密相關(guān)，但其相關(guān)性在哮喘中尚無(wú)報(bào)道。

HSP90的亞型HSP90α調(diào)節(jié)細(xì)胞功能，在多種炎癥中發(fā)揮重要作用，提示HSP90α在上述病理生理過(guò)程中可能扮演核心角色。

課題組前期研究已證實(shí)分泌型HSP90α誘導(dǎo)氣道上皮屏障破壞，本研究聚焦于胞內(nèi)HSP90α分子伴侶功能，首次關(guān)注哮喘中HSP90α與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的相關(guān)性與作用，進(jìn)一步揭示哮喘炎癥的機(jī)制。

1.2.4 Western blot 根據(jù)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量配制相應(yīng)濃度（8%～12%）的PAGE膠，以120 V恒壓電泳至染料到達(dá)膠的底部，以250 mA恒流轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜時(shí)間根據(jù)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量+30 min公式來(lái)計(jì)算，5%的BSA溶液封閉1 h，孵育相應(yīng)的一抗稀釋液8 h（兔抗HSP90α濃度為1∶1000，兔抗GAPDH濃度為1∶5000），孵育對(duì)應(yīng)種屬的二抗（二抗?jié)舛葹?∶10 000）2 h，Licor Odyssey顯影儀顯影，保存圖像。

因此，本研究擬通過(guò)干預(yù)氣道上皮細(xì)胞HSP90α探究在HDM誘導(dǎo)的哮喘模型中HSP90α是否通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)控哮喘氣道炎癥，以期為哮喘的精準(zhǔn)治療提供新的研究方向。

1 材料和方法

1.1 材料

人氣道上皮細(xì)胞株（HBE細(xì)胞，ATCC）；角質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)基（KM培養(yǎng)基，ScienCell）；胎牛血清（GIBCO）；脂質(zhì)體（Lipofectamine3000，Invitrogen）；Opti-MEM 減血清培養(yǎng)基（Invitrogen）；屋塵螨制劑（HDM，ALK-Abello）；坦螺旋霉素（17-AAG，Selleckchem）；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)紅色熒光探針（ER-Tracker Red），Hoechst 33342活細(xì)胞染色液（碧云天）；蘇木素染液，伊紅染液，瑞氏-姬薩姆復(fù)合染液（索萊寶）；白介素4（IL-4）、白介素5（IL-5）、白介素13（IL-13）Elisa試劑盒（Proteintech）；免疫組化兔二步法檢測(cè)試劑盒（中國(guó)北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；兔抗HSP90α多克隆抗體），兔抗磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）多克隆抗體（CST）；兔抗X盒結(jié)合蛋白1（XBP-1s）多克隆抗體，兔抗活化轉(zhuǎn)錄因子6α（ATF-6α）多克隆抗體，兔抗葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP-78）多克隆抗體（Proteintech）；驢抗兔紅外二抗（Licor）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HBE 細(xì)胞在KM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。HDM濃度梯度刺激分組如下：正常對(duì)照組；200 U/mL組：用HDM（200 U/mL）處理24 h；400 U/mL 組：用HDM（400 U/mL）處理24 h；800 U/mL 組：用HDM（800 U/mL）處理24 h。SiHSP90α干擾序列與17-AAG處理分組如下：正常對(duì)照組；HDM組：用HDM（800 U/mL）處理24 h，誘導(dǎo)哮喘體外模型；HDM+siHSP90α組：在HDM（800 U/mL）處理前用siHSP90α序列轉(zhuǎn)染12 h；HDM+17-AAG組：在HDM（800 U/mL）處理前用17-AAG（900 nmol/L）預(yù)處理6 h；2 d/次更換培養(yǎng)基。

1.2.7.1 致敏 HDM及HDM+17-AAG組每只小鼠在Day0、Day7腹腔注射100μL的HDM混合液（4000 U/只，HDM40μL+PBS60μL）；正常對(duì)照組及17-AAG組對(duì)應(yīng)注射100μL的PBS。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 HBE細(xì)胞轉(zhuǎn)染前1 d傳代至6孔板，第2天細(xì)胞生長(zhǎng)密度約50%～60%，用Lipofectamin3000進(jìn)行siHSP90α序列（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）轉(zhuǎn)染，加入體積與siRNA為1∶1，轉(zhuǎn)染終濃度為50 nmol。轉(zhuǎn)染12 h后更換培養(yǎng)基，進(jìn)行相關(guān)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將購(gòu)買(mǎi)的人前列腺癌細(xì)胞PC3解凍復(fù)蘇，接種于含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2的潮濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底85%左右時(shí)，棄去培養(yǎng)液，加入胰蛋白酶消化處理后，進(jìn)行傳代培養(yǎng)和細(xì)胞凍存。

1.2.3 細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)染色 HBE細(xì)胞傳代鋪于中皿中，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)處理后每皿加入200μL ER-Tracker Red工作液（1∶1000）孵育30 min，PBS清洗后每皿加入50μL Hoechst 33342活細(xì)胞染色液工作液（1∶100）孵育10 min后熒光顯微鏡拍照記錄。

由于螺旋管圈水冷壁的焊口都集中在角部，焊口位置不利，給施焊帶來(lái)很大難度。而且由于該種爐型沒(méi)有汽包，為保證介質(zhì)的循環(huán)暢通，必須保證螺旋水冷壁的升角，保證機(jī)組的安裝質(zhì)量，保證機(jī)組在以后的投產(chǎn)運(yùn)行中的正常性及穩(wěn)定性。因此，在實(shí)際的安裝過(guò)程中，有許多的難點(diǎn)、要點(diǎn)。

天時(shí)——近年來(lái)電商和新能源的不斷發(fā)展，催生很多老舊倉(cāng)儲(chǔ)中心升級(jí)改造和新興倉(cāng)儲(chǔ)中心規(guī)劃建設(shè)，其對(duì)于內(nèi)部倉(cāng)儲(chǔ)設(shè)備的要求更加緊貼社會(huì)、科技發(fā)展，而中鼎在過(guò)去積累的定制化解決方案經(jīng)驗(yàn)和核心設(shè)備的自主研發(fā)制造成為其獨(dú)到的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)；地利——民族品牌建設(shè)更加接地氣，更加快速應(yīng)對(duì)中國(guó)物流行業(yè)發(fā)展新需求，許多客戶都贊許說(shuō)：“中鼎倉(cāng)儲(chǔ)管理軟件和自動(dòng)化倉(cāng)儲(chǔ)設(shè)備，能夠有效做到因需而變、快速反應(yīng)”；人和——與諾力集團(tuán)的合作，讓中鼎的研發(fā)實(shí)力更加雄厚，產(chǎn)品線更加豐富，可為客戶提供更加完善的倉(cāng)儲(chǔ)一體式解決方案。張總說(shuō)：“當(dāng)坐擁如此的“天時(shí)地利人和”，中鼎又豈能不收獲成功呢？”

1.2.12 免疫組織化學(xué)染色 取小鼠左側(cè)肺臟，多聚甲醛固定、石蠟包埋、連續(xù)切片，經(jīng)脫蠟、水化后封閉，孵育一抗8 h（XBP-1 1∶50,GRP-78 1∶50），在37 ℃下二抗孵育1 h，DAB顯色、蘇木素復(fù)染，透明后封片。

這種感覺(jué)終于迎來(lái)了驗(yàn)證的一天。在雙方父母的一再催促下，我跟葉靄玲去領(lǐng)了結(jié)婚證。我明白這是一個(gè)極不靠譜的舉措，但我實(shí)在找不出理由來(lái)拒絕葉靄玲。事實(shí)上，這個(gè)日子被我往后推了又推，以各種各樣的理由，有些是完全站不住腳的。然后，它忽然呈現(xiàn)出不可動(dòng)搖的面目，被選定在下一個(gè)吉日良辰。真是千挑萬(wàn)揀，實(shí)在沒(méi)有辦法再搪塞到下一次了。于是，我倆站在了結(jié)婚登記處的柜臺(tái)前，面對(duì)一個(gè)胖胖的面目慈祥的女登記員，聽(tīng)她問(wèn)，你愿意娶她為妻嗎？我答，我愿。她又問(wèn)，你愿意嫁給他嗎？葉靄玲答，我愿意。然后登記員向我們收取了9元錢(qián)的登記費(fèi)，給我們發(fā)了兩份大紅的結(jié)婚證書(shū)，打發(fā)我們走到陽(yáng)光底下來(lái)。

1.2.6 瓊脂糖凝膠電泳 配置2%的瓊脂糖凝膠，上樣后調(diào)電壓至150 V，電泳20～30 min后停止電泳，取出凝膠后在BIO-RAD紅外凝膠成像儀中顯影。

1.2.7 動(dòng)物造模 SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠36只，6～8周齡，體質(zhì)量20～24 g，飼養(yǎng)于南方醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院清潔級(jí)動(dòng)物房，隨機(jī)分為4組，9只/組：正常對(duì)照組；17-AAG組；HDM組；HDM+17-AAG組。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)南方醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（NFYY-2021-1205）。

關(guān)于讀者對(duì)圖書(shū)館的閱讀推廣活動(dòng)整體評(píng)價(jià)：非常滿意占21%；基本滿意占40%；一般占35%，不太滿意占4%；非常不滿意為零。說(shuō)明讀者對(duì)公共圖書(shū)館的閱讀推廣比較認(rèn)可，但還是需要不斷改進(jìn)完善。

1.2.7.2 激發(fā) Day8在異氟烷吸入麻醉下，HDM處理組的小鼠每2 d 經(jīng)氣道滴注給藥10μL HDM 混合液（400 U/只，HDM4 μL+PBS6 μL），總共激發(fā)10 次。HDM+17-AAG 組激發(fā)前進(jìn)行17-AAG 混合液滴鼻（1μg/10μL），最后一次激發(fā)后的24 h內(nèi)處死小鼠進(jìn)行收樣。

移動(dòng)三維激光掃描儀（IMS 3D）（如圖1所示）是基于激光掃描（LiDAR）和同步定位與制圖（SLAM）技術(shù)同步進(jìn)行高精度定位，在沒(méi)有GPS和復(fù)雜慣性導(dǎo)航系統(tǒng)的環(huán)境下，僅依靠技術(shù)設(shè)備自身配置的簡(jiǎn)單慣性測(cè)量裝置，實(shí)現(xiàn)城市地下綜合管道數(shù)據(jù)的快速、便捷、低成本采集。

1.2.8 肺泡灌洗液計(jì)數(shù) 將收集的肺泡灌洗液充分混勻，吸取10μL滴加到自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)板中，放入細(xì)胞計(jì)數(shù)儀內(nèi)，調(diào)整相關(guān)參數(shù)，測(cè)得細(xì)胞總數(shù)后保存數(shù)據(jù)。

1.2.9 H&E染色 取小鼠左側(cè)肺臟，多聚甲醛固定、石蠟包埋、連續(xù)切片，經(jīng)脫蠟、水化后予蘇木素+伊紅染色后封片。

1.2.10 瑞氏-姬薩姆染色 收集小鼠肺泡灌洗液，重懸后滴于載玻片上，固定后使用瑞氏-姬薩姆染液染色后封片。

1.2.11 ELISA法 收集小鼠肺泡灌洗液，加樣品到Elisa反應(yīng)孔中，室溫孵育2 h，洗板后加入酶標(biāo)抗體，室溫避光孵育2 h，洗板后加入顯色底物，避光孵育30 min，終止反應(yīng)后酶標(biāo)儀上機(jī)檢測(cè)發(fā)光度。

1.2.5 PCR 擴(kuò)增 使用Trizol 法提取HBE 細(xì)胞的總RNA，取500 ng總RNA，使用TAKARA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA（10μL體系），根據(jù)Premix Taq?10μL+上游引物4μL+下游引物4μL+cDNA1.6μL+DEPC水7.6μL的體系進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)后保存，引物序列參考表1。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，以＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所有實(shí)驗(yàn)都是獨(dú)立重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 在HDM 誘導(dǎo)的哮喘體外模型中，HBE 細(xì)胞的HSP90α與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物表達(dá)水平上調(diào)

在濃度梯度的HDM刺激下，與對(duì)照組相比，HDM濃度到200 U/mL 的濃度時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)探針即出現(xiàn)明顯的強(qiáng)紅色熒光（圖1A）。HDM濃度達(dá)到400 U/mL及800 U/mL的濃度組中，HSP90α的mRNA表達(dá)水平變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（=0.218，圖1B）；HDM 濃度達(dá)到800 U/mL時(shí)，HSP90α的蛋白表達(dá)水平出現(xiàn)顯著上調(diào)（=0.011，圖1B）。在HDM的刺激下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物XBP-1（=0.044）、ATF-6α（=0.030）與GRP-78（=0.027）均出現(xiàn)表達(dá)水平顯著上調(diào)（圖1C）。

2.2 敲低HSP90α和使用HSP90 抑制劑17-AAG 抑制HBE細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物的表達(dá)水平

相較于對(duì)照組，HDM 組的HSP90α、XBP-1、ATF-6α與GRP-78 出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)（圖2），與HDM 組相比，HDM+siHSP90α組中，HSP90α的表達(dá)顯著下調(diào)，表明HSP90α被敲低（=0.048，圖2A）。在HDM+siHSP90α組中，XBP-1（=0.008）表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)，GRP-78（=0.077）表達(dá)變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而ATF-6α在17-AAG處理下才出現(xiàn)下調(diào)（圖2B）。

2.3 在HDM誘導(dǎo)的哮喘小鼠模型中，17-AAG抑制氣道炎癥水平

HDM滴鼻致敏及激發(fā)建立了炎癥細(xì)胞聚集的哮喘模型，而17-AAG處理后，可以減少氣道上皮細(xì)胞周?chē)难装Y細(xì)胞聚集（圖3A），同時(shí)減少肺泡灌洗液中的炎癥細(xì)胞數(shù)（=0.014，圖3B）。同樣Elisa 提示在17-AAG處理后哮喘小鼠肺泡灌洗液中Th2炎癥因子IL-4（=0.030）、IL-5（=0.035）顯著下調(diào)，IL-13（=0.099）變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖3C）。

2.4 在HDM誘導(dǎo)的哮喘小鼠模型中，17-AAG抑制氣道上皮細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物表達(dá)水平

在哮喘小鼠模型中，免疫組織化學(xué)染色結(jié)果提示，相較于對(duì)照組與17-AAG組，HDM組的氣道上皮細(xì)胞中XBP-1與GRP-78的免疫組化染色明顯加深，而在17-AAG處理后，XBP-1與GRP-78的免疫組化染色明顯變淺（圖4A）。

3 討論

本研究通過(guò)HDM誘導(dǎo)的哮喘體外實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)HBE細(xì)胞分子HSP90α表達(dá)上調(diào)，證實(shí)HSP90α參與哮喘發(fā)生發(fā)展，與國(guó)外相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致。已有報(bào)道表明HSP90α可修飾多種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白，但在哮喘炎癥中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究圍繞HSP90α對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白修飾作用展開(kāi)，我們發(fā)現(xiàn)，在HDM刺激下，HBE細(xì)胞出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物表達(dá)上調(diào)，這進(jìn)一步提示了兩者之間的關(guān)聯(lián)性。

已在印刷行業(yè)服務(wù)30多年的楊斌把加盟陽(yáng)光印網(wǎng)稱(chēng)為自己職業(yè)生涯的重要轉(zhuǎn)型。從傳統(tǒng)行業(yè)進(jìn)入互聯(lián)網(wǎng)，與一個(gè)年輕奮進(jìn)的團(tuán)隊(duì)一起打拼，共同描繪充滿無(wú)限可能的未來(lái)，楊斌說(shuō)，很享受這樣的快節(jié)奏。他向我們介紹，陽(yáng)光印網(wǎng)的運(yùn)營(yíng)模式跟以往大不相同，它是一個(gè)互聯(lián)網(wǎng)平臺(tái)，一邊對(duì)接印刷的采購(gòu)方即印刷服務(wù)的需求方，另一邊對(duì)接供應(yīng)方即印刷企業(yè)。這個(gè)平臺(tái)創(chuàng)造的價(jià)值就是，在需求方和供應(yīng)方之間建立一個(gè)最佳的匹配。

根據(jù)香菇醬的獨(dú)特風(fēng)味，以香菇風(fēng)味醬的形態(tài)色澤、香味、口感、風(fēng)味、雜質(zhì)的有無(wú)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，設(shè)計(jì)香菇醬感官評(píng)分表。由100名食品專(zhuān)業(yè)人士對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

在本研究的體外實(shí)驗(yàn)中，敲低HSP90α基因及使用HSP90抑制劑17-AAG均可降低多種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白的表達(dá)；而在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，氣道滴注17-AAG可改善氣道炎癥水平，并降低氣道上皮細(xì)胞的多種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白水平。由此可見(jiàn)，HSP90與細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激存在緊密的相關(guān)性，且HSP90α可能發(fā)揮角色作用。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是一種特殊的細(xì)胞器，協(xié)調(diào)真核細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成、折疊和運(yùn)輸。當(dāng)外界因素影響下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正確折疊蛋白質(zhì)的功能受到干擾，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，進(jìn)一步激活細(xì)胞未折疊蛋白反應(yīng)（UPR），若內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激持續(xù)存在或加重，UPR會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。有研究報(bào)道，在過(guò)敏原刺激下，氣道上皮細(xì)胞會(huì)發(fā)生UPR 誘導(dǎo)的凋亡，從而導(dǎo)致上皮屏障破壞，促進(jìn)炎癥因子釋放，加重氣道炎癥，引起哮喘發(fā)作。而在本研究中首次發(fā)現(xiàn)，在哮喘中HSP90α是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白重要的分子伴侶，當(dāng)其受到抑制時(shí)可以緩解氣道上皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，改善氣道炎癥。同時(shí)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，哮喘患者外周血HSP90表達(dá)高于健康人群，提示HSP90α是一種有潛力的生物標(biāo)志物。然而HSP90α是否直接影響，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激從而減少UPR引起的氣道上皮細(xì)胞細(xì)胞凋亡，進(jìn)而改善氣道炎癥、延緩哮喘進(jìn)程仍有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究通過(guò)體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)證明了HSP90α參與HDM誘導(dǎo)的哮喘氣道炎癥，并可能通過(guò)調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激這一通路實(shí)現(xiàn)；抑制HSP90α可改善上皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和氣道炎癥。因此，干預(yù)HSP90α可能成為治療哮喘的新手段。