急性髓系白血病（AML）是一種以原始造血細(xì)胞無序增殖為特征的骨髓惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率隨著年齡的增長(zhǎng)而增加。由于該疾病的遺傳學(xué)復(fù)雜性，世界衛(wèi)生組織（WHO）分類和診斷標(biāo)準(zhǔn)（2016 版）除臨床特征、形態(tài)學(xué)和免疫表型外，還納入了多種重現(xiàn)性細(xì)胞遺傳學(xué)和分子遺傳學(xué)特征，如PML-RARα、RUNX1-RUNX1T1、FLT3-ITD、TP53、DNMT3A 和NPM1 突變等。目前，臨床工作者主要通過年齡、細(xì)胞遺傳學(xué)異常和特定基因突變來評(píng)估AML 患者的預(yù)后。然而，大約有40% AML 患者被歸類為中危患者，其中大多數(shù)未攜帶常見的核型異常或基因改變。隨著醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步，近10年來，AML治療方案也有較大改觀。AML風(fēng)險(xiǎn)分層策略和預(yù)后評(píng)估方案已不能滿足臨床需要。二代測(cè)序技術(shù)的廣泛應(yīng)用，腫瘤公共數(shù)據(jù)庫海量的測(cè)序和臨床信息為基因標(biāo)志物篩選提供了技術(shù)基礎(chǔ)。國內(nèi)外科學(xué)家已經(jīng)進(jìn)行了多項(xiàng)研究來尋找新型預(yù)后生物標(biāo)志物并改善不同AML 亞組的風(fēng)險(xiǎn)分層和預(yù)后評(píng)估。腫瘤發(fā)生、進(jìn)展相關(guān)重要信號(hào)通路，比如免疫微環(huán)境、鐵死亡、脂質(zhì)和能量代謝、DNA修復(fù)和損傷有關(guān)的基因組經(jīng)過生物信息學(xué)模型處理可以作為預(yù)后判斷的工具。HMGA2、FHL1、HOPX 和FAM124B等基因特征被證實(shí)為有效的單個(gè)預(yù)后分子指標(biāo)。但是這些基因標(biāo)志物的臨床應(yīng)用比較局限。由于參與腫瘤發(fā)生的信號(hào)通路基因之間相互調(diào)節(jié)、影響，有必要挖掘潛在的AML新型基因標(biāo)志物，完善腫瘤調(diào)控信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)機(jī)制。我們前期利用公共數(shù)據(jù)庫篩選了TCGA-AML 隊(duì)列中的多個(gè)預(yù)后相關(guān)基因，這些基因大部分未見諸報(bào)道，其預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性和有效性也未經(jīng)過臨床實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。本項(xiàng)研究中，我們通過生物信息學(xué)分析探討了AML腫瘤患者骨髓組織白三烯B4受體（LTB4R）的異常表達(dá)水平、預(yù)后價(jià)值和潛在生物學(xué)功能，并收集臨床標(biāo)本進(jìn)行了初步驗(yàn)證。LTB4R，又稱BLT1，是LTB4的高親和力受體，二者相互作用不僅可募集不同類型的炎癥細(xì)胞、激活炎癥反應(yīng)，也可作用于非免疫細(xì)胞啟動(dòng)和/或放大各種組織中的病理性炎癥，在腫瘤組織中二者作用于不同的靶細(xì)胞呈現(xiàn)出更為復(fù)雜的抑癌或促癌效應(yīng)。已有研究報(bào)道LTB4R與實(shí)體腫瘤預(yù)后的相關(guān)性及作為治療靶點(diǎn)的潛力，如LTB4R在胰腺癌、表皮腫瘤、結(jié)腸癌組織過表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，調(diào)控細(xì)胞周期、誘導(dǎo)凋亡。另外，也可通過MMP-2途徑增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的侵襲性，小鼠皮下腫瘤模型中證實(shí)LTB4R介導(dǎo)CTL 細(xì)胞在腫瘤組織中的浸潤(rùn)。腫瘤免疫微環(huán)境在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移、侵襲過程中發(fā)揮重要作用，因此調(diào)控免疫功能可能是預(yù)防和治療腫瘤的手段之一。針對(duì)AML患者的免疫治療手段也在不斷發(fā)展。目前，LTB4R在AML中的表達(dá)模式，預(yù)后價(jià)值，及其是否或如何影響AML患者的免疫微環(huán)境尚未見報(bào)道。本研究運(yùn)用生物信息學(xué)工具分析了LTB4R在AML患者中的表達(dá)模式、預(yù)后價(jià)值和潛在生物學(xué)功能。

1 資料和方法

1.1 資料

1.1.1 樣本及試劑 本研究分析的數(shù)據(jù)集由美國國家癌癥研究所（NCI）TCGA 癌癥（TCGA-LAML）https://portal.gdc.cancer.gov/、GTEx（正常組織）https://gtexportal.org/home/datasets 和 Gene Expression Omnibus（GEO:GSE12417）https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo下載。數(shù)據(jù)集TCGA-LAML于2020 年1月更新，納入173例AML患者，包含高通量測(cè)序（RNASeq）數(shù)據(jù)，其中151例含詳細(xì)的臨床信息（140例含預(yù)后信息）、細(xì)胞遺傳學(xué)和分子突變信息，以上數(shù)據(jù)集執(zhí)行R studio數(shù)據(jù)清洗“dplyr”包刪失信息不全的病例后納入生存分析和Cox回歸分析。

AML患者（=30）及健康對(duì)照者（=21）外周血樣本2020年2月～2022年1月于山東第一醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院收集，EDTA-K2 抗凝血用于分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，促凝血1500 r/min離心5 min后分離血清保存至-80 ℃?zhèn)溆?。AML外周血樣本經(jīng)人工鏡檢分類篩選，白血病原始細(xì)胞比例≥20%或＞2000/μL的樣本（=19）納入本研究。實(shí)驗(yàn)前均獲得患者知情同意。本研究經(jīng)山東第一醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批號(hào)為：2021[倫審字（S092號(hào)）]。

Ficoll 淋巴細(xì)胞分離液（天津?yàn)螅琓rizol（Invitrogen），ReverTra Ace qPCR RT kit（Toyobo），SYBR Green Realtime PCR Master Mix 試劑盒（Toyobo），實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀ABI QuantStudio 5（ABI）。β-actin、LTB4R、HAVCR2、PDCD1引物由上海生工合成，序列如下：β-actin_180 bp：F：5'-CTCAC GAAACTGGAATAAGC-3'；R：5'-AAGCCACACGTA CTAAAGGT-3'；LTB4R_162 bp：F：5'-AGCTTTGTG GTGTGGAGTATCC-3'，R：5'-GCAACCAGCCAGTC CAAAAC-3'；HAV-CR2_75 bp：F：5'-CTGCTGCTAC TACTTACAAGGTC-3'，R：5'-GCAGGGCAGATAGG CATTCT-3'；PDCD1_137 bp：F：5'-CCAGGATGGTTC TTAGACTCCC-3'，R：5'-TTTAGCACGAAGCTCTCC GAT-3'。人LTB4R酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）試劑盒購自上海凡科維公司，檢測(cè)范圍1～55 pg/mL。酶標(biāo)儀為Thermo Multiskan Go。

1.1.2 數(shù)據(jù)庫 利用基于網(wǎng)絡(luò)生物信息學(xué)平臺(tái)，如PrognoScan、Linkedomics、UALCAN和WebGestalt和STRING（https://string-db.org/）進(jìn)行生存分析、相關(guān)性分析、共表達(dá)基因篩選、功能富集分析和蛋白相互作用PPI（protein-protein interaction）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。利用R包“UpSetR”繪制Upset圖可視化共表達(dá)基因與免疫浸潤(rùn)、DNA損傷修復(fù)、能量代謝、EMT相關(guān)基因的交集情況。采用R包“GSVA”內(nèi)置ssGSEA算法分析TCGA-LAML數(shù)據(jù)集中LTB4R與24種免疫細(xì)胞標(biāo)志、免疫檢查點(diǎn)基因相關(guān)性。

1.2 方法

為進(jìn)一步在臨床樣本中驗(yàn)證LTB4R在AML中的表達(dá)水平及其與相關(guān)免疫檢查點(diǎn)基因表達(dá)的相關(guān)性，我們收集了白血病原始細(xì)胞比例≥20%或＞2000/μL 的AML患者外周血樣本，分離PBMC進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)各基因mRNA 表達(dá)水平，ELISA 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)血清LTB4R蛋白表達(dá)水平。圖8顯示在19例AML患者樣本中，LTB4R mRNA表達(dá)量高于對(duì)照樣本（=21），同時(shí)LTB4R mRNA 表達(dá)量與HAVCR2 呈顯著正相關(guān)（＜0.05），與PDCD1正相關(guān)，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。AML患者血清LTB4R表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照樣本[（15.93±3.28）pg/mL（6.71±1.05）pg/mL，=0.0083]。

為了進(jìn)一步探索LTB4R基因在AML中的潛在功能和分子途徑，我們利用LinkedOmics 數(shù)據(jù)庫分析了TCGA-LAML數(shù)據(jù)集中173例患者的mRNA 測(cè)序數(shù)據(jù)，共篩選出與LTB4R相關(guān)的10 477個(gè)基因（＜0.01）。共表達(dá)熱圖顯示了與LTB4R表達(dá)呈正相關(guān)或負(fù)相關(guān)的Top10基因（圖4），參與炎癥反應(yīng)、代謝、胞膜運(yùn)輸、細(xì)胞凋亡等一系列生物學(xué)功能。我們通過GO和KEGG分析在TCGA-LAML 數(shù)據(jù)集中富集了LTB4R共表達(dá)基因簇的功能和信號(hào)途徑。氣泡圖顯示基因簇富集于生物學(xué)進(jìn)程（BP）免疫反應(yīng)相關(guān)的中性粒細(xì)胞活化、T細(xì)胞活化、細(xì)胞活性正向調(diào)節(jié)、白細(xì)胞粘附正向調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程中（圖5A）；這些基因簇在細(xì)胞成分（CC）方面是分泌性顆粒膜、溶酶體和細(xì)胞粘附蛋白復(fù)合體的推定結(jié)構(gòu)成分（圖5B）；在分子功能（MF）方面，它們涉及肌動(dòng)蛋白及骨架綁定、SH2結(jié)構(gòu)域綁定和NADPH氧化酶活性等（圖5C）。KEGG分析富集了與共表達(dá)基因簇相關(guān)的7條通路（＜0.05），如B細(xì)胞受體信號(hào)途徑、FcγR介導(dǎo)的吞噬作用、腫瘤中心碳代謝（圖5D）。另一方面，腫瘤發(fā)生涉及免疫微環(huán)境、能量代謝、缺氧、鐵死亡、N6-甲基腺苷（m6A）等關(guān)鍵信號(hào)通路，UPSET 交集圖顯示，LTB4R共表達(dá)基因簇中132個(gè)為免疫相關(guān)基因，34個(gè)脂代謝相關(guān)基因，34個(gè)EMT相關(guān)基因，22個(gè)代謝調(diào)控分子和8個(gè)DNA損傷、修復(fù)調(diào)控分子（圖5E）。腫瘤在發(fā)生發(fā)展過程中可逃避免疫監(jiān)視、誘導(dǎo)免疫耐受，因此我們繼續(xù)分析了LTB4R與免疫浸潤(rùn)細(xì)胞和免疫檢查點(diǎn)分子的相關(guān)性。圖6A 顯示，LTB4R 與免疫抑制細(xì)胞Treg、Th17、iDC、Tem 細(xì)胞呈正相關(guān)，而與T helper、CD8+T、Tcm、NK細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)；圖6B顯示LTB4R與HAVCR2、PDCD1呈顯著正相關(guān)。PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示在AML中與LTB4R信號(hào)通路關(guān)聯(lián)密切前15位的蛋白包括LTB4R2、ALOX5、APALOX5、GPK6、GNAQ等，分別涉及腫瘤相關(guān)T細(xì)胞活化、炎癥反應(yīng)、Wnt信號(hào)通路、腫瘤相關(guān)跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、G蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合體和能量代謝。

探究前的知識(shí)儲(chǔ)備：教師引導(dǎo)學(xué)生復(fù)習(xí)綠色植物在光合作用中的物質(zhì)變化和能量變化的實(shí)質(zhì)，重點(diǎn)回顧化學(xué)能貯存在有機(jī)物中的要點(diǎn)，點(diǎn)亮學(xué)生思維中關(guān)于能量和物質(zhì)之間的關(guān)聯(lián)，也為后面的探究埋下伏筆。

1.2.3 基因本體論（GO）和京都基因和基因組百科全書（KEGG）富集分析 我們利用(http://www.webgestalt.org/option.php)平臺(tái)對(duì)LTB4R及Top200共表達(dá)基因進(jìn)行功能富集分析。選擇內(nèi)置的參考人類蛋白質(zhì)編碼基因組作為背景參數(shù)。通過“ggplot”和“dplyr”R包生成氣泡圖。（-log10）值＞1.3被認(rèn)為富集到有意義的信號(hào)通路。

原因何在？我們可以從平頂山環(huán)境污染防治攻堅(jiān)戰(zhàn)領(lǐng)導(dǎo)小組辦公室印發(fā)的一份通知中得到答案。該通知針對(duì)改善空氣質(zhì)量共提出了25項(xiàng)重點(diǎn)任務(wù)，其中涉及“科學(xué)規(guī)劃營(yíng)運(yùn)加油站點(diǎn)”：要求6月底前，市內(nèi)四個(gè)國控空氣質(zhì)量自動(dòng)監(jiān)測(cè)站點(diǎn)周邊2公里范圍內(nèi)營(yíng)運(yùn)加油站完成選址搬遷……搬遷前，即日起范圍內(nèi)加油站營(yíng)業(yè)時(shí)間改為每日19時(shí)至次日8時(shí)。

腫瘤大標(biāo)本實(shí)質(zhì)部分切面形態(tài)為魚肉狀，顏色呈灰白色，質(zhì)地脆弱，瘤內(nèi)存在壞死囊變、出血等表現(xiàn)。腫瘤與網(wǎng)膜、腸系膜、腹壁、膀胱發(fā)生粘連的患者有3例；壞死腫塊與腸道相通伴發(fā)感染的有1例。爛魚肉狀是患者腫瘤組織主要形態(tài)，腫瘤內(nèi)壞死除可抽出暗紅色血液。延遲掃描表現(xiàn)為大部分強(qiáng)化的1例患者腫瘤動(dòng)脈期周邊見不規(guī)則環(huán)形與結(jié)節(jié)狀強(qiáng)化。CT診斷提示腫瘤壞死，病理標(biāo)本顯示未發(fā)生腫瘤壞死。

1.2.4 基因集富集分析（GSEA）分析 TCGA-LAML數(shù)據(jù)集基于LTB4R 表達(dá)中位數(shù)分為兩組，采用R 包“DESeq2”篩選差異基因。對(duì)所有差異基因進(jìn)行GSEA功能富集分析，＜0.05，F(xiàn)DR＜0.25認(rèn)為富集到有意義的信號(hào)通路。

目前AML患者的風(fēng)險(xiǎn)分層策略包括臨床病理特征、染色體和基因異常。我們利用R studio和UALCAN平臺(tái)研究了LTB4R表達(dá)水平與AML臨床資料之間的關(guān)系，結(jié)果顯示在M0、M1、M4、M5亞組中，LTB4R表達(dá)水平增強(qiáng)，在M2、M3或t（15;17）、t（8;21）組LTB4R表達(dá)水平降低，這與基于風(fēng)險(xiǎn)分層的預(yù)后結(jié)果一致。LTB4R表達(dá)水平與FLT3突變、IDH、RAS突變未呈現(xiàn)顯著相關(guān)性，可能與樣本量過小有關(guān)。以上結(jié)果提示LTB4R可以作為特定AML亞組，尤其是M0、M1、M4、M5的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估指標(biāo)，并顯示出與當(dāng)前風(fēng)險(xiǎn)分層策略的協(xié)同性。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR Ficoll淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，Trizol法提取總RNA，使用ReverTra Ace qPCR RT kit 獲得互補(bǔ)cDNA。使用SYBR Green Realtime PCR Master Mix試劑盒在ABI QuantStudio 5PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。設(shè)陰性對(duì)照2復(fù)孔，每個(gè)樣本設(shè)2個(gè)復(fù)孔，內(nèi)對(duì)照為1×ROX，PCR循環(huán)條件如下：預(yù)變性95 ℃60 s，40個(gè)循環(huán)95 ℃15 s，60 ℃15 s，72 ℃45 s。mRNA表達(dá)水平半定量計(jì)算公式為2。

1.2.6 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)樣品孔。每孔加50 μL樣本（血清1∶5稀釋）。用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度（），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中人白三烯B4 受體(LTB4R)濃度。每孔讀取3次取平均值。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 基因表達(dá)TPM（每千堿基百萬讀數(shù)的轉(zhuǎn)錄本）格式的RNAseq 數(shù)據(jù)通過UCSC XENA（https://xenabrowser.net/datapages/）中的Toil 流程進(jìn)行處理。定量數(shù)據(jù)經(jīng)過正態(tài)檢驗(yàn)，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)用中位數(shù)和四分位距表示（mean±IQR）。Mann-Whitney U檢驗(yàn)用于評(píng)估兩個(gè)獨(dú)立樣本中l(wèi)og2（TPM+1）水平的差異。散點(diǎn)圖是通過R studio（3.6.3）中的“ggplot2”R 包繪制。生存分析值和風(fēng)險(xiǎn)系數(shù)（HR）由單因素Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸和對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)生成。臨床資料基線分析將數(shù)據(jù)集TCGA-LAML（=140）基于LTB4R表達(dá)水平的中值作為臨界值分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，基因表達(dá)與臨床特征之間的關(guān)系采用Chi-square 檢驗(yàn)，Wilcoxon rank sum檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)。正態(tài)分布數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用Student檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Spearman檢驗(yàn)。使用R studio 3.6.3和Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和可視化。＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LTB4R mRNA在AML患者中的表達(dá)水平及預(yù)后價(jià)值

TCGA-LAML數(shù)據(jù)集基于LTB4R表達(dá)水平分為兩組，應(yīng)用R語言篩選出313個(gè)差異基因（或lncRNA）（|log2FoldChange|＞2，＜0.05），火山圖（圖7A）顯示其中58個(gè)紅色散點(diǎn)為表達(dá)上調(diào)基因，255個(gè)藍(lán)色散點(diǎn)為表達(dá)下調(diào)基因，Top5代表基因?yàn)椋篠LC10A2、HMX3、KCNN2、LINC00482、LAMP5-AS1、PDPN、AL117190.1、MEG9、RASL12、MEG8，其余基因以灰色散點(diǎn)表示。繼而針對(duì)總差異基因進(jìn)行GSEA功能富集分析，結(jié)果如圖7B顯示，基于LTB4R的差異基因富集于CD4+αβT細(xì)胞分化、αβT細(xì)胞活化，免疫相關(guān)的T細(xì)胞活化、II型免疫反應(yīng)、免疫遞呈突觸、TNF受體綁定、IL-2/STAT5、TGF-β信號(hào)途徑。

2.2 LTB4R可作為AML 的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)

1970～80 年代沿用的急性髓系白血病FAB 分型（M0-M7）主要基于形態(tài)學(xué)和細(xì)胞化學(xué)染色。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，世界衛(wèi)生組織（WHO）分類標(biāo)準(zhǔn)納入了一系列與癌基因、抑癌基因、細(xì)胞功能相關(guān)的重現(xiàn)性遺傳學(xué)異常，如t（15;17）（q22;q12）、PML-RARα、t（8;21）（q22;q22）、RUNX1-RUNX1T1、FLT3-ITD突變和NPM1突變。目前臨床上采用這些細(xì)胞遺傳學(xué)異常與臨床特征做為風(fēng)險(xiǎn)分層指標(biāo)。為研究LTB4R是否能輔助AML疾病風(fēng)險(xiǎn)分層，取LTB4R表達(dá)水平中位數(shù)為介值，結(jié)合各項(xiàng)臨床指標(biāo)將TCGA-LAML 隊(duì)列分組進(jìn)行相關(guān)性分析，表1顯示LTB4R過表達(dá)水平與細(xì)胞遺傳學(xué)風(fēng)險(xiǎn)（＜0.001）、FAB分型（＜0.001）、染色體異常（＜0.001）和NPM1突變（=0.023）相關(guān)。LTB4R低表達(dá)組的重現(xiàn)性細(xì)胞遺傳學(xué)異常具有更好的臨床預(yù)后，例如全部t（15;17）（11/11，100%）和t（8;21）（7/7，100%）患者均為L(zhǎng)TB4R低表達(dá)。LTB4R 表達(dá)水平在FAB 各亞型中顯示出不同的分布特征，M1（22/35,62.9%）、M4（18/29，62.1%）和M5（13/15，86.7%）患者LTB4R表達(dá)更高，相反，大多數(shù)M2（60.5%）和M3（急性早幼粒細(xì)胞白血病，APL，80.0%）呈LTB4R低表達(dá)。另一方面，利用UALCAN 平臺(tái)分析了不同F(xiàn)AB 分型、年齡、性別、FLT3 突變、PML/RAR 融合和RAS 激活狀態(tài)亞組的LTB4R表達(dá)水平（圖3）。柱狀圖顯示，M3 占AML 的9%～12%，與M3 相比，M0、M1、M2、M4 和M5 中LTB4R表達(dá)水平升高（＜0.001，圖3A）。LTB4R在其他亞組之間未顯示明顯差異（圖3B～F）。

2.3 LTB4R表達(dá)水平與臨床指標(biāo)相關(guān)性分析

多種臨床特征如年齡、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、原始細(xì)胞百分比和細(xì)胞遺傳學(xué)異常，都可能會(huì)影響AML 患者的預(yù)后。既往有多項(xiàng)基于全基因測(cè)序的AML預(yù)后相關(guān)變量的篩選研究，F(xiàn)HL1、HOPX、HMGA2 和FAM124B被證實(shí)為預(yù)后候選基因。本研究在此基礎(chǔ)上運(yùn)用單因素和多因素Cox 風(fēng)險(xiǎn)回歸分析，以確定LTB4R是否可作為AML OS 獨(dú)立預(yù)后因子。聯(lián)合LTB4R納入分析的變量包括年齡（≥60 歲）、外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)和原始細(xì)胞百分比、常見細(xì)胞遺傳學(xué)異?；蛑委煱悬c(diǎn)（FLT3 突變、DNMT3A 突變和TP53 突變）、預(yù)后基因指標(biāo)（HMGA2、FHL1、HOPX 和FAM124B）（圖2）。圖2A森林圖顯示年齡、FAB分型、細(xì)胞遺傳學(xué)風(fēng)險(xiǎn)、LTB4R（HR=1.825；95%：1.188-2.802；=0.006）、FHL1、HOPX、FAM124B均表現(xiàn)出風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)價(jià)值，多因素分析則證實(shí)LTB4R、年齡和FAM124B 為獨(dú)立預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)因子，其中LTB4R 顯示出較強(qiáng)的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)價(jià)值（=0.019，HR=1.864，95%：1.107-3.136，圖2B）。

2.4 LTB4R共表達(dá)基因篩選及功能富集分析

1.2.2 單因素和多因素Cox 回歸分析 采用Cox 回歸分析來篩選TCGA-LAML 隊(duì)列（=140）中的預(yù)后候選基因。使用“survival”、“survminer”、“forestplot”R 包繪制森林圖。年齡、細(xì)胞遺傳風(fēng)險(xiǎn)和基因突變被視為分類變量，而白細(xì)胞計(jì)數(shù)和原始細(xì)胞百分比視為連續(xù)變量。采用每個(gè)基因的表達(dá)水平中位數(shù)為介值分組。

2.5 基于LTB4R的差異基因篩選及GSEA分析

利用R studio 分析TCGA數(shù)據(jù)庫來源的泛癌組織中LTB4R 基因的轉(zhuǎn)錄水平（圖1A）。散點(diǎn)圖顯示AML患者骨髓樣本（TCGA-LAML，=173）中LTB4R轉(zhuǎn)錄水平顯著高于正常組織（GTEx，=70）（4.898±1.2202.252±0.215，＜0.001）。我們對(duì)基因表達(dá)數(shù)據(jù)和生存期進(jìn)行了單變量Cox 比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析篩選出TCGALAML 數(shù)據(jù)集（=140）中2563 個(gè)預(yù)后相關(guān)基因（Cox＜0.01），其中LTB4R mRNA高表達(dá)與總生存期（OS）顯著相關(guān)（HR=1.42，95%：1.13-1.79；Cox=0.003）。隨后利用R studio（圖1B）和PrognoScan平臺(tái)（圖1C）不同數(shù)據(jù)處理算法評(píng)估LTB4R基因在AML患者中的預(yù)后價(jià)值。Kaplan-Meier（KM）曲線圖顯示在TCGALAML數(shù)據(jù)集（數(shù)據(jù)清洗后=140）中LTB4R 異常表達(dá)與總生存期（OS）相關(guān)（HR=1.74，95%：1.14-2.67；=0.011），LTB4R高表達(dá)組的中位生存時(shí)間為11.2月，低表達(dá)組為27.4月。LTB4R 的預(yù)后價(jià)值用PrognoScan平臺(tái)進(jìn)行了驗(yàn)證，Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸分析顯示在細(xì)胞遺傳學(xué)正常的AML 數(shù)據(jù)集GSE12417[（AMLCG（2004），=79，HR=1.72，95%：1.06-2.77；=0.027，圖1C]中LTB4R過表達(dá)是OS 的危險(xiǎn)因素。利用時(shí)間操作特征(TimeROC)分析確定預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性。曲線下面積（AUC）分別為1 年AUC=0.613、3 年AUC=0.675、5 年AUC=0.748（圖1D）。

2.6 臨床實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證LTB4R、免疫檢查點(diǎn)基因表達(dá)水平及相關(guān)性

1.2.1 生存分析 通過數(shù)據(jù)清洗納入了TCGA-LAML數(shù)據(jù)集中140名具有高通量測(cè)序（RNA-Seq）和完整預(yù)后信息的AML 患者。生存分析結(jié)果由Kaplan-Meier曲線顯示。TimeROC（v 0.4）分析用以比較單個(gè)基因或基因組的預(yù)測(cè)特異性及靈敏性。以上利用R 包“survival”、“survminer”、“pROC”和“ggplot2”分析繪圖。

3 討論

我國白血病發(fā)病率約為3～4/10萬，其中AML占1.62/10萬，目前病因尚不完全清楚，已知的有病毒感染、免疫功能異常、物理、化學(xué)、遺傳因素等。除M3外，其他類型的AML治療手段以化療和造血干細(xì)胞移植為主，5年死亡率達(dá)50%。以腫瘤疫苗、細(xì)胞治療和細(xì)胞信號(hào)通路調(diào)節(jié)劑為代表的選擇性免疫治療和分子靶向治療是新興的治療措施，而個(gè)體化的治療方案要求全面檢查各種預(yù)后分層相關(guān)的預(yù)后指標(biāo)。迄今，臨床和科研工作者篩選了大量新型的AML生物標(biāo)志物和預(yù)后指標(biāo)。在此基礎(chǔ)上，本研究利用多種生物信息學(xué)分析工具，借助公共數(shù)據(jù)庫平臺(tái)，試圖篩選更簡(jiǎn)單、有效的預(yù)后指標(biāo)。前期我們已通過Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸分析篩選出多個(gè)預(yù)后基因，如RHOBTB2、FHL1、HIVEP3、ARHGAP9和PSMB8，這些基因的潛在功能和預(yù)后價(jià)值有待驗(yàn)證。本項(xiàng)研究中，我們探討了LTB4R基因在AML中的表達(dá)譜和預(yù)后意義。

TCGA泛癌數(shù)據(jù)集基因表達(dá)分析顯示AML患者骨髓組織中LTB4R轉(zhuǎn)錄水平顯著升高，并且在泛癌組織中表達(dá)水平差異明顯，呈現(xiàn)出器官特異性。急性髓系白血病患者骨髓樣本中白血病細(xì)胞的比例為20%～100%，這可能決定基因表達(dá)水平的分布情況。急性髓系白血病患者骨髓中LTB4R異常表達(dá)促使我們進(jìn)一步探索其是否具有預(yù)后價(jià)值。

我們利用R studio 和PrognoScan 在兩個(gè)不同的AML數(shù)據(jù)集中分析并驗(yàn)證了LTB4R基因?qū)ML患者預(yù)后的影響，結(jié)果顯示LTB4R過表達(dá)與AML患者的不良預(yù)后相關(guān)。TimeROC分析顯示LTB4R的AUC大于0.6，尤其是5年AUC=0.748，顯示出較強(qiáng)的預(yù)后評(píng)估性能。我們前期收集了一組與AML預(yù)后相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)因素，包括年齡、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、原始細(xì)胞比例、重現(xiàn)性遺傳學(xué)異常等，均納入Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸分析，多因素回歸結(jié)果證實(shí)LTB4R是AML不良預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)基因。

基于“調(diào)整結(jié)構(gòu)、補(bǔ)齊短板、提升質(zhì)量”，推進(jìn)供給側(cè)改革，以精準(zhǔn)扶貧為核心，“輸血”與“造血”相結(jié)合，從目標(biāo)層、戰(zhàn)略層和路徑層提出供給側(cè)改革視角下精準(zhǔn)扶貧優(yōu)化路徑，對(duì)接扶貧資源供需，確保貧困地區(qū)精準(zhǔn)脫貧，見圖4。

LTB4R屬于G 蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）超家族，特異性表達(dá)于白細(xì)胞，在胰腺癌、表皮腫瘤、結(jié)腸癌中的表達(dá)水平異常，并可發(fā)揮調(diào)控免疫微環(huán)境、促進(jìn)腫瘤增殖和侵襲的功能生物學(xué)功能。然而，LTB4R能否以及如何調(diào)控腫瘤免疫并影響白血病的發(fā)生發(fā)展尚不清楚。

現(xiàn)金流折現(xiàn)模型的公式表述如下：P0=(E0CF1)/(1 +R)+(E0CF2)/(1 +R)2+...(延續(xù)到無限期)，其中P0代表某一企業(yè)、資產(chǎn)或工程的現(xiàn)值(當(dāng)前價(jià)值)，E0CFn代表當(dāng)前預(yù)測(cè)的未來第n期產(chǎn)生的自由現(xiàn)金流，R代表自由現(xiàn)金流的折現(xiàn)率。自由現(xiàn)金流貼現(xiàn)(DCF)模型是一種重要的公司估值方法，其定義為公司的價(jià)值等于公司在其剩余的生命周期中能夠提供的自由現(xiàn)金流的現(xiàn)值之和。

蕭飛羽左腕上的鋼環(huán)轉(zhuǎn)動(dòng)得越來越快，顯然是否接受天問大師的賭約他一時(shí)難以取舍。當(dāng)他終于按住轉(zhuǎn)動(dòng)的鋼環(huán)，目光卻落在武成龍身上。武成龍似乎知道他企圖進(jìn)一步確定什么急忙傳音：“語出無悔，承諾是金，天問大師和紫陽道長(zhǎng)口碑更勝只手拿云。只是除了黑白雙煞實(shí)力不為屬下所知，其他人應(yīng)戰(zhàn)會(huì)有違三少收服天問大師和紫陽道長(zhǎng)的初衷?！?/p>

為進(jìn)一步探索LTB4R在AML腫瘤發(fā)生發(fā)展中的潛在功能，我們首先通過LinkedOmics數(shù)據(jù)庫篩選出LTB4R共表達(dá)基因集合，包含多個(gè)免疫微環(huán)境、EMT轉(zhuǎn)化、DNA損傷修復(fù)和能量代謝相關(guān)基因，反映了LTB4R對(duì)疾病調(diào)控分子網(wǎng)絡(luò)的重要影響。運(yùn)用GO和KEGG分析發(fā)現(xiàn)這些共表達(dá)基因富集到數(shù)條腫瘤相關(guān)的功能和信號(hào)通路，涉及免疫細(xì)胞分化、活化、吞噬功能和能量代謝。其次，我們基于LTB4R 表達(dá)水平將TCGA-LAML分組篩選出差異基因集合，GSEA分析顯示這些差異基因功能主要富集到免疫細(xì)胞活化、分化，信號(hào)傳導(dǎo)，免疫遞呈，免疫反應(yīng)，細(xì)胞因子信號(hào)通路。再次，通過與24種免疫細(xì)胞標(biāo)志的相關(guān)性研究我們發(fā)現(xiàn)LTB4R 與腫瘤免疫浸潤(rùn)呈顯著相關(guān)性。最后，通過STRING平臺(tái)構(gòu)建的PPI網(wǎng)絡(luò)揭示了在AML腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中與LTB4R功能密切相關(guān)的15個(gè)功能蛋白。以上結(jié)果顯示LTB4R介導(dǎo)的信號(hào)通路與免疫微環(huán)境、能量代謝之間可能存在協(xié)同或交互作用。臨床實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了生信分析的結(jié)論，LTB4R在AML患者中表達(dá)水平增高，并且與免疫檢查點(diǎn)基因HAVCR2呈顯著正相關(guān)，而受到樣本量的影響，LTB4R與PDCD1表達(dá)相關(guān)性分析未顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，擴(kuò)增結(jié)果顯示PDCD1擴(kuò)增曲線CT值均在32左右，表明該基因在樣本中表達(dá)量均較低，可能會(huì)掩蓋組間表達(dá)差異，考慮下一步擴(kuò)大樣本量繼續(xù)驗(yàn)證。

單項(xiàng)血清腫瘤標(biāo)記物的靈敏度和特異度并不高，而聯(lián)合檢測(cè)的靈敏度和特異度分別達(dá)到了83.33%和97.50%。如下表2所示。

綜上所述，本研究利用公共數(shù)據(jù)庫綜合分析了LTB4R在AML患者的特異性表達(dá)模式，評(píng)估了預(yù)后價(jià)值和臨床特征相關(guān)性，進(jìn)一步預(yù)測(cè)了其潛在功能，同時(shí)收集臨床樣本進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。目前臨床上采用的AML分型標(biāo)準(zhǔn)主要是FAB分型和WHO分型，前者主要基于形態(tài)學(xué)改變，后者側(cè)重重現(xiàn)性遺傳學(xué)異常。除M3 外，其他AML 分型的治療方案區(qū)別不大，F(xiàn)LT3、IDH、NPM1的預(yù)后價(jià)值尚待進(jìn)一步證實(shí)，靶向藥物臨床研究并未顯示出患者顯著獲益。因此現(xiàn)有的AML臨床預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估策略尚需進(jìn)一步優(yōu)化。

LTB4R表達(dá)水平在AML患者，特別是在預(yù)后不良的高危亞組中顯著升高，可作為腫瘤標(biāo)志物和預(yù)后因素之一。TimeROC實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了LTB4R預(yù)后預(yù)測(cè)的特異性和靈敏性。多因素COX回歸分析研究也證實(shí)納入臨床上現(xiàn)有的風(fēng)險(xiǎn)因素和預(yù)后指標(biāo)，包括年齡、分型、細(xì)胞遺傳學(xué)異常和預(yù)后基因后，LTB4R也是一個(gè)有效的獨(dú)立預(yù)后基因。LTB4R可輔助臨床進(jìn)行AML疾病風(fēng)險(xiǎn)分層，并可能參與或協(xié)同腫瘤免疫、能量代謝等信號(hào)通路，在白血病發(fā)生中發(fā)揮重要作用。

臨床實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證選取了白血病原始細(xì)胞≥20%或＞2000/μL的AML外周血樣本，可與TCGA、GEO數(shù)據(jù)集分析的結(jié)果相互驗(yàn)證、互為補(bǔ)充，有利于收集患者綜合診斷和預(yù)后評(píng)估信息，受限于經(jīng)濟(jì)原因，并不是所有AML患者都能接受二代測(cè)序檢查，本文證實(shí)LTB4R可采用外周血單個(gè)核細(xì)胞標(biāo)本檢測(cè)mRNA水平，外周血清/血漿檢測(cè)蛋白水平，標(biāo)本易于獲得，臨床實(shí)驗(yàn)室大多配備了分子診斷平臺(tái)和免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)流水線，有望開發(fā)檢測(cè)試劑盒，便于臨床應(yīng)用。