李華祥，石 蠫，蔣文浩，王娟娟，陸春雷，高亞軍，賈祿強，楊振泉*

（1 揚州大學食品科學與工程學院 江蘇揚州 225127 2 江南大學食品學院 江蘇無錫 214122）

樟芝（Antrodia camphorate 或Taiwanofungus camphoratus），又名牛樟芝、牛樟菇等，是一種大型珍稀藥食兩用真菌，屬于擔子菌綱、多孔菌目、薄孔菌屬，素有“藥芝之王”、“森林紅寶石”之美譽[1-2]。國內外大量研究證實樟芝在保肝、抗癌、抗腫瘤、抗病毒、抗炎癥、抗氧化、降血壓、降血脂、緩解疲勞及調節(jié)免疫等方面具有顯著功效[3-5]。隨后，研究者們從樟芝子實體及發(fā)酵菌絲體中分離出百余種活性物質，主要包括三萜類、多糖類及苯環(huán)類等，具有較大的研究潛力及開發(fā)價值[6]。

國外學者Geethangili 等[7]研究發(fā)現(xiàn)，樟芝的氯仿及正己烷提取物均能顯著抑制幽門螺桿菌（Helicobacter pylori）的生長。Lien 等[8]發(fā)現(xiàn)，樟芝的3種有機溶劑（乙醇、氯仿及乙酸乙酯）提取物均對口腔細菌變異鏈球菌（Streptococcus mutans）和牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis）的生長具有顯著抑制效果，其MIC 值為4～16 μg/mL。國內學者楊淑賢等[9]及汪雯翰等[10]發(fā)現(xiàn)，樟芝的3 種有機溶劑（甲醇、氯仿及正丁醇）提取物均對金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌的生長具有顯著抑制效果。李娟等[11]發(fā)現(xiàn)，樟芝乙酸乙酯提取物對7 種多重耐藥性人體致病細菌的生長具有顯著抑制效果。

有關樟芝菌絲體提取物在抑制食源性致病菌方面的研究較少，尤其是對副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）及霍亂弧菌（Vibrio cholerae）等弧菌和阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazakii）的生長抑制效果研究尚顯不足。本文以成本低廉且較易獲得的樟芝深層發(fā)酵菌絲體[12]為原料，研究樟芝菌絲體不同提取物對15 種食源性致病菌的抑制作用，進一步補充和完善樟芝活性物質在抑菌方面的研究，為開發(fā)新型安全高效、功能多樣的食品奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株 本文所用樟芝及所有食源性致病菌菌株均為本實驗室保藏菌株[13]。

1.1.2 試劑 本文中培養(yǎng)樟芝斜面所用的PDA培養(yǎng)基、培養(yǎng)食源性致病菌所用的LBS 培養(yǎng)基及LB 培養(yǎng)基，上海生工；用于配制樟芝發(fā)酵培養(yǎng)基的相關試劑及其它常規(guī)試劑（分析純），國藥集團（中國）。

1.2 方法

1.2.1 樟芝菌絲體的收集 根據(jù)樟芝深層發(fā)酵的前期研究成果，采用5 L 發(fā)酵罐按照文獻[14]中的培養(yǎng)基配方（葡萄糖2%，酵母浸出粉0.2%，MgSO40.15%，KH2PO40.3%，pH 4.5）和發(fā)酵條件（接種量為1×106spore/mL，26 ℃，150 r/min，發(fā)酵10 d）進行樟芝深層發(fā)酵，結束后用4 層紗布過濾并收集樟芝菌絲體。

1.2.2 樟芝活性物質的提取 將樟芝菌絲體與甲醇、乙醇、乙酸乙酯或蒸餾水按料液比為1∶10 的比例混合，超聲處理45 min 后，靜置過夜。然后離心（8 000 r/min，10 min，4 ℃）收集上清液，即得樟芝菌絲體提取液[15]。

將樟芝有機溶劑提取液70 ℃水浴蒸干后，稱重并用DMSO 溶劑復溶；將樟芝水提取液真空冷凍干燥，稱重后用水復溶。最終獲得已知濃度的樟芝菌絲體提取液。

1.2.3 致病菌的培養(yǎng)及稀釋 參照石瑀等[16]的方法，將食源性致病菌分別接種于LBS 培養(yǎng)基（弧菌）及LB 培養(yǎng)基（非弧菌）中，37 ℃培養(yǎng)12 h。再用無菌生理鹽水梯度稀釋（梯度為10，共稀釋10個梯度）并吸取100 μL 各稀釋菌液均勻涂布于平板上，培養(yǎng)10～12 h 后進行菌落計數(shù)。最后，根據(jù)菌落計數(shù)結果將每個測試菌的培養(yǎng)液用生理鹽水稀釋到1×105CFU/mL 備用。

1.2.4 抑菌譜的測定 測定樟芝菌絲體提取物的部分抑菌譜時，我們采用的是牛津杯法[17]，具體操作參照陸春雷等[13]和石瑀等[16]的方法，每個試驗組均設置3 個生物重復。

1.2.5 最小抑菌濃度的測定 測定樟芝菌絲體提取物對食源性致病菌的最小抑菌濃度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC） 時采用二倍稀釋法[18]，具體操作參照陸春雷等[13]和石瑀等[16]的方法，設置生理鹽水空白對照組及DMSO 溶劑對照組，每個組均設置6 個生物重復。我們將溶劑無抑菌效果（即根據(jù)分光光度計檢測及肉眼觀察結果，判斷抑菌率為0） 且樟芝菌絲體提取物完全抑菌（即根據(jù)分光光度計檢測及肉眼觀察結果，判斷抑菌率為100%）時所對應的樟芝菌絲體提取物最低添加濃度視為相應的最小抑菌濃度。

1.2.6 抑菌效果驗證 測定樟芝菌絲體甲醇提取物對各測試菌的抑菌率時，我們采用的是平板菌落計數(shù)法[19]。根據(jù)最小抑菌濃度的檢測結果，我們選取副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌及最小弧菌3 株菌株作為測試菌以驗證樟芝甲醇提取物的抑菌效果。具體操作參照陸春雷等[13]和石瑀等[16]的方法，此處以檢測樟芝菌絲體甲醇提取物對金黃色葡萄球菌抑制效果的操作為例進行簡要描述。即采用20 mL 玻璃試管為容器，LB 培養(yǎng)基的裝液量為5 mL，接入100 μL 濃度為1×105CFU/mL 的金黃色葡萄球菌菌液，再加入400 μL 質量濃度為10 mg/mL 的樟芝菌絲體甲醇提取液（此濃度在最小抑菌濃度檢測試驗中抑菌效果理想且對應的溶劑無抑菌效果），將試管置于37 ℃、120 r/min 搖床中培養(yǎng)，并于8，10，12 h 分別取樣進行平板菌落計數(shù)。以相同體系中添加400 μL 無菌生理鹽水代替樟芝菌絲體甲醇提取液的試管作為空白對照組，每組設置3 個生物重復，根據(jù)菌落計數(shù)結果計算樟芝菌絲體甲醇提取物對測試菌株的抑菌率。檢測樟芝菌絲體甲醇提取物對副溶血性弧菌及最小弧菌的抑菌率時，除了將LB 培養(yǎng)基替換成LBS培養(yǎng)基以外，其余操作均與檢測樟芝菌絲體提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌率操作相同。

2 結果與分析

2.1 樟芝菌絲體提取物的抑菌譜

按1.2.2 節(jié)中的方法，獲得質量濃度分別為49.6，17.6，44.0，82.0 mg/mL 的樟芝菌絲體甲醇提取液（ME）、乙醇提取液（AE）、乙酸乙酯提取液（EE）及水提液（WE）。分別吸取500 μL 上述4 種樟芝菌絲體提取液并將質量濃度統(tǒng)一稀釋至15 mg/mL 后，按1.2.4 節(jié)中的方法檢測樟芝菌絲體不同提取物對15 株食源性致病菌的抑制效果，獲得各樟芝菌絲體提取物的部分抑菌譜，結果如表1所示。

由表1可以看出，4 種樟芝菌絲體提取物對大腸桿菌、沙門氏菌及6 株阪崎腸桿菌均無明顯抑制作用，但對金黃色葡萄球菌的生長均呈現(xiàn)顯著抑制作用。此外，樟芝菌絲體甲醇提取物對5 株弧菌及蠟樣芽孢桿菌均有較好的生長抑制效果；樟芝菌絲體乙醇提取物對河流弧菌及創(chuàng)傷弧菌有較好的生長抑制效果；樟芝菌絲體乙酸乙酯提取物僅對金黃色葡萄球菌的生長有較為顯著的抑制效果；樟芝菌絲體水提物對霍亂弧菌及創(chuàng)傷弧菌有較好的生長抑制效果?？梢?，樟芝菌絲體甲醇提取物的抑菌譜最廣，能顯著抑制15 株測試菌中7 株菌株的生長。

表1 樟芝菌絲體不同提取物的抑菌譜Table 1 The antibacterial spectrum of different extracts from mycelia of Antrodia camphorata

2.2 樟芝菌絲體提取物的最小抑菌濃度

在檢測出不同樟芝菌絲體提取物的部分抑菌譜后，我們進一步檢測了4 種樟芝菌絲體提取物對其所對應測試菌株的最小抑制濃度，結果如表2所示。

由表2可知，DMSO 對食源性致病菌的生長有一定的抑制作用，但抑制效果隨濃度的降低而減弱，直至幾乎無抑菌效果。將用DMSO 溶解的樟芝菌絲體提取物的抑菌效果與相同濃度的DMSO（表中同一列數(shù)據(jù)）抑菌效果相比較后得出，4 種樟芝菌絲體提取物均對7 株測試菌的生長有顯著抑制作用，且最小抑菌質量濃度在0.3～41.0 mg/mL 之間。其中，樟芝菌絲體乙醇提物對金黃色葡萄球菌的最小抑菌質量濃度最低，為0.3 mg/mL；樟芝菌絲體水提物對弧菌的最小抑菌質量濃度最高，為41.0 mg/mL。

表2 不同樟芝菌絲體提取物對測試菌的抑制作用Table 2 The antibacterial activity of extracts from mycelia of Antrodia camphorata on test bacteria

（續(xù)表2）

2.3 樟芝菌絲體甲醇提取物的抑菌效果驗證

由于樟芝菌絲體甲醇提取物的抑菌譜最廣，抑菌效果最好。因此選擇樟芝菌絲體甲醇提取物及3 株致病菌（金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌及最小弧菌） 作為樟芝代表提取物及測試菌代表菌株，用20 mL 試管體系培養(yǎng)，并用平板菌落計數(shù)法進一步驗證樟芝菌絲體提取物對測試菌的抑制效果。

2.3.1 測試菌生長曲線的測定 首先測定了金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌以及最小弧菌21613的生長曲線，以確定最佳取樣時間，結果如圖1所示。

由圖1可知，副溶血性弧菌和最小弧菌的遲滯期、對數(shù)期和穩(wěn)定期分別為0～4 h，4～10 h 和10～12 h；金黃色葡萄球菌的遲滯期、對數(shù)期和穩(wěn)定期分別為0～6 h，6～10 h 和10～12 h?？梢?，當培養(yǎng)8 h 和10 h 時，3 種菌均處于對數(shù)期中期及對數(shù)期末期；培養(yǎng)12 h 時，3 種菌均處于穩(wěn)定期。因此，后續(xù)檢測樟芝甲醇提取物的抑菌率時，我們分別取培養(yǎng)8，10 h 及12 h 的菌液進行涂布及菌落計數(shù)。

圖1 測試菌的生長曲線Fig.1 The growth curve of test bacterias

2.3.2 樟芝菌絲體甲醇提取物的抑菌效果 采用平板菌落計數(shù)法，檢測樟芝甲醇提取物在最小抑菌濃度下對金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌及最小弧菌不同培養(yǎng)時間的抑菌率，以進一步驗證其抑菌效果，結果如表3所示。

表3 樟芝菌絲體甲醇提取物對測試菌的抑菌率Table 3 The antibacterial rate of methanol extracts from mycelia of Antrodia camphorate on test bacterias

由表3可知，樟芝菌絲體甲醇提取物對兩株弧菌的抑菌率在對數(shù)期中期達到最大值；而樟芝菌絲體甲醇提取物對金黃色葡萄球菌的抑制效果隨培養(yǎng)時間點的增加而增強，在穩(wěn)定期時抑菌率達到最大值。上述結果表明，樟芝菌絲體甲醇提取物確實能顯著抑制金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌以及最小弧菌的生長，且最大抑菌率均在92%以上，抑菌效果較為理想，從而進一步證實了抑菌譜試驗及最小抑菌濃度試驗數(shù)據(jù)的可靠性。

3 結論

樟芝菌絲體提取物對15 株食源性致病菌中的7 株（霍亂弧菌、副溶血性弧菌、河流弧菌、創(chuàng)傷弧菌、最小弧菌、金黃色葡萄球菌及蠟樣芽孢桿菌）具有較好的抑制效果，且不同提取物對測試菌的最小抑菌質量濃度范圍在0.3～41.0 mg/mL 之間。其中，樟芝菌絲體甲醇提取物的抑菌譜最廣，抑菌效果最顯著；平板菌落計數(shù)試驗結果表明，樟芝菌絲體甲醇提取物對金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌及最小弧菌的最大抑菌率均在92%以上，抑菌效果極其顯著，進一步證實了樟芝菌絲體提取物的抑菌效果。本研究結果較具開發(fā)價值及應用前景。