袁肇方，時(shí)小鳳，張向博,2，白生菊，鞏轉(zhuǎn)娣，魏鎖成,2

(1.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心，甘肅 蘭州 730030；2.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030； 3.西北民族大學(xué) 醫(yī)院，甘肅 蘭州 730030)

0 引言

卵巢癌也稱卵巢惡性腫瘤，是女性生殖器官常見的惡性腫瘤之一[1].上皮性卵巢癌約占所有卵巢惡性腫瘤的90%，死亡率居各類婦科腫瘤的首位，嚴(yán)重威脅著廣大婦女的生命健康安全.因?yàn)槁殉矏盒阅[瘤的發(fā)病機(jī)理有許多種原因，因此在治療方法上也有所不同.目前，大多數(shù)治療方案采用手術(shù)治療和化療藥物治療聯(lián)合進(jìn)行.雖然使用化學(xué)藥物進(jìn)行治療的作用機(jī)理明了，其療效也非常顯著，但是化學(xué)藥物具有一定的毒性，而且長期使用還容易產(chǎn)生耐藥性，因此在臨床治療上需要毒性較小并且療效顯著的藥物，而中藥相對于化學(xué)藥物具有明顯的優(yōu)點(diǎn).近年來發(fā)現(xiàn)多種中藥材，如大黃、紅花、雷公藤、厚樸、黃連和丹參等，可以通過不同的作用機(jī)理應(yīng)用于卵巢癌的治療中.

紅景天為景天科紅景天屬的多年生草本植物，多分布在高寒地帶[2]，如四川和西藏地區(qū).紅景天苷作為紅景天的有效活性成分之一，具有抗腫瘤、抗疲勞、抗輻射、抗病毒、抗衰老和免疫調(diào)節(jié)等多種功效[3].紅景天苷對肺癌、肝癌、乳腺癌、胃癌和宮頸癌等均有顯著的抑制效果[4].

磷酸酶和張力蛋白同源物(PTEN)是一種同時(shí)具有脂質(zhì)磷酸酶和蛋白磷酸酶活性的抑癌因子.20%的透明細(xì)胞癌和15%左右的卵巢子宮內(nèi)膜樣腺癌中可發(fā)現(xiàn)PTEN基因的缺失[5-7].

PTEN是一類抑癌基因，其在多種癌癥中都呈低表達(dá)狀態(tài)，上調(diào)PTEN表達(dá)可減緩癌癥的發(fā)展[8].本實(shí)驗(yàn)對紅景天苷抑制卵巢癌的增殖作用與PTEN的關(guān)系進(jìn)行研究，從而為紅景天苷應(yīng)用于臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 材料

1.1 藥物與試劑

紅景天苷；McCoy，s5A培養(yǎng)基；胎牛血清；CCK-8細(xì)胞增殖檢測試劑盒；AnnexinⅤ-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒、細(xì)胞周期試劑盒；磷酸酶-張力蛋白基因(PTEN)一抗；BCA蛋白定量試劑盒；RNA提取液.

1.2 主要儀器

CO2培養(yǎng)箱，超低溫冰箱，熒光定量PCR儀及化學(xué)發(fā)光儀，低溫高速離心機(jī)，倒置顯微鏡.

1.3 細(xì)胞株

人卵巢癌細(xì)胞株SKOV3，置于25cm2培養(yǎng)瓶貼壁生長.

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

使用含10%滅活的胎牛血清和1%雙抗(青霉素/鏈霉素)的McCoy，s5A培養(yǎng)基培養(yǎng)人卵巢癌細(xì)胞SKOV3，于5%CO2、37℃恒溫恒濕細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng).2～3天用0.25%胰酶消化，進(jìn)行傳代.

2.2 藥物處理及分組

將對數(shù)生長期SKOV3細(xì)胞于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，實(shí)驗(yàn)組分為五組，分別為SAL-1組(4 μmol/mL)、SAL-2組(8 μmol/mL)、SAL-3組(16 μmol/mL)、SAL-4組(30 μmol/mL)和SAL-5組(40 μmol/mL),對照組(CG)為空白對照，繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h和72 h.

2.3 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖

取處于對數(shù)生長期的卵巢癌細(xì)胞消化離心，以每孔5×104個(gè)細(xì)胞均勻接種至96孔培養(yǎng)板中，在培養(yǎng)基中加入4、8、16、30和40 μmol/mL濃度的紅景天苷處理SKOV3細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h和72 h，每組設(shè)置5個(gè)副孔.分別在24 h、48 h和72 h，每孔加10 μL CCK-8溶液，以加入等體積的PBS作為空白對照，置于37℃培養(yǎng)箱中溫育3 h，用多功能酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度(OD)值，計(jì)算不同時(shí)間不同濃度紅景天苷對卵巢癌細(xì)胞SKOV3增殖的抑制率.

2.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期

取細(xì)胞密度長至90%的6孔板，按濃度為8、16、30和40 μmol/mL的紅景天苷加藥48 h后用胰酶(不含EDTA)消化收集細(xì)胞，1000 g離心5 min，棄上清，PBS重懸，1000 g離心5 min，棄上清，加入500μl結(jié)合液輕輕重懸，加入5 μl Annexin V-FITC輕輕混勻，再加入10 μl PI混勻，室溫避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期，使用FlowJo進(jìn)行數(shù)據(jù)分析.

2.5 PTEN mRNA表達(dá)檢測

Real-time PCR樣本收集方法按照傳統(tǒng)RNA抽提方式進(jìn)行，各組細(xì)胞中加入1mlTrizol后加入200 μl氯仿混勻后靜置10 min,4°C，12000 r/min離心15 min,將上層的水箱轉(zhuǎn)移至新的無RNase的EP管,加入500 μl異丙醇,混勻,靜置10 min后12000 r/min離心10 min,棄上清,可見白色RNA沉淀于管底,75%乙醇清洗后晾干，待RNA沉淀變?yōu)闊o色透明狀,加入30 μlDEPC水溶解RNA,儲(chǔ)存于-80℃.使用hieff UNICONqPCR SYBR Green Master Mix(抗體法，No Rox)試劑盒進(jìn)行基因的定量PCR檢測，采用20 μl的反應(yīng)體系，95 ℃預(yù)變性30s后95 ℃10 s，60 ℃30 s進(jìn)行 40個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)擴(kuò)增曲線和融解曲線，依據(jù)公式 2-ΔΔCT計(jì)算被檢測基因的相對量，引物序列如表1所示.

表1 引物序列

2.6 PTEN蛋白表達(dá)

采用Western blot方法收集各組SKOV3細(xì)胞于離心管中，加入RIPA裂解液，電動(dòng)勻漿器進(jìn)行裂解，BCA 蛋白定量試劑盒檢測蛋白濃度.上樣量為20 μL蛋白質(zhì)，通過10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用PBS清洗PVDF膜5 min，加入5%脫脂奶粉封閉2 h.加入一抗(PTEN、GAPDH)4 ℃孵育過夜.加入二抗(1∶2500)，37 °C孵育1 h.二抗孵育后使用ECL發(fā)光液處理，在暗室中進(jìn)行曝光拍照.每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，使用Image 軟件分析各條帶灰度值.

3 結(jié)果

3.1 卵巢癌SKOV3細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化

紅景天苷作用于卵巢癌細(xì)胞SKOV3 24 h、48 h和72 h細(xì)胞形態(tài)的改變可見圖1-1、圖1-2和圖1-3.對照組(CG)中的SKOV3細(xì)胞生長良好，增殖旺盛，并在它們之間緊密相連(見圖1).與CG相比，實(shí)驗(yàn)組SKOV3細(xì)胞的增殖活力逐漸減弱，隨著紅景天苷濃度從SAL-1組增加到SAL-5組，細(xì)胞分裂隨著死亡細(xì)胞的增加而減少.SKOV3細(xì)胞的數(shù)量在48 h和72 h時(shí)也有所減少.當(dāng)紅景天苷濃度達(dá)到30 μmol/mL(SAL-4組)和40 μmol/mL(SAL-5組)時(shí)，大量SKOV3細(xì)胞變成卵形和梭形.72 h時(shí)，紅景天苷所有處理組的SKOV3細(xì)胞數(shù)量明顯低于24 h和48 h.這些結(jié)果表明，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，SKOV3細(xì)胞的生長逐漸變得遲緩.

注：字母A、B、C、D、E、F分別代表對照組(CG)、SAL-1、SAL-2、SAL-3、SAL-4和SAL-5組.

3.2 紅景天苷對卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖的影響

CCK-8檢測發(fā)現(xiàn)紅景天苷對卵巢癌細(xì)胞SKOV3的抑制率隨著濃度的增加逐漸升高，如圖2所示.在24 h、48 h和72 h實(shí)驗(yàn)組中，SAL-2組和SAL-3組的抑制率顯著高于CG組(P<0.05)，SAL-4組和SAL-5組的抑制率極顯著高于CG組(P<0.01).

3.3 紅景天苷對卵巢癌SKOV3細(xì)胞周期的影響

以不同濃度紅景天苷(4、8、16、30和40 μmol/mL)處理SKOV3細(xì)胞48 h后，細(xì)胞周期結(jié)果分析如圖3所示.隨著紅景天苷濃度的增加，G0/G1期細(xì)胞比例逐漸增加，SAL-3組顯著高于CG組(P<0.05)，SAL-4和SAL-5極顯著高于CG組(P<0.01)，SAL-5極顯著高于SAL-2組(P<0.01)；S期細(xì)胞比例逐漸減少；G2/M期的細(xì)胞比例無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.結(jié)果顯示，紅景天苷對卵巢癌細(xì)胞SKOV3的阻滯期為G0/G1期.

注：*P<0.05與CG組比較；##P<0.01與SAL-1組比較.

注：*P<0.05與CG組比較；**P<0.01與CG組比較；##P<0.01與SAL-2組比較.

3.4 紅景天苷對卵巢癌SKOV3細(xì)胞凋亡的影響

凋亡率結(jié)果顯示，紅景天苷增大了SKOV3細(xì)胞的體外凋亡率.隨著紅景天苷濃度的增加SKOV3細(xì)胞的凋亡率也在增大(見圖4).SAL-5組在24 h、48 h和72 h時(shí)，SKOV3細(xì)胞的凋亡率均顯著高于對照組(CG)和SAL-1組(P<0.05或P<0.01).結(jié)果表明，高劑量的紅景天苷可顯著促進(jìn)SKOV3細(xì)胞的凋亡.

注：*P<0.05與CG組比較；#P<0.05與SAL-1組比較；##P<0.01與SAL-1組比較.

3.5 SKOV3細(xì)胞中PTEN mRNA的表達(dá)水平

隨著時(shí)間的延長和劑量的增加，PTEN mRNA的表達(dá)水平也逐漸呈依賴性的增加(見圖5).在24 h、48 h和72 h時(shí)，SAL-5組的PTEN mRNA相對表達(dá)量增幅最大，且SAL-5組極顯著高于CG組和SAL-1組(P<0.01).研究結(jié)果表明，紅景天苷呈劑量依賴性地改變SKOV3細(xì)胞中PTEN mRNA的相對表達(dá)，而較高劑量的紅景天苷可提高SKOV3細(xì)胞中PTEN mRNA的表達(dá)水平.

注：*P<0.05與CG組比較；**P<0.01與CG組比較；#P<0.05與SAL-1組比較；##P<0.01與SAL-1組比較.

3.6 SKOV3細(xì)胞中PTEN蛋白的影響

與CG相比，隨著紅景天苷劑量從4～40μmol/mL的增加，PTEN蛋白的表達(dá)水平逐漸升高(圖6).在24 h、48 h和72 h時(shí)，SAL-5組PTEN蛋白的表達(dá)水平極顯著高于CG組和SAL-1組(P<0.01)，且SAL-5組PTEN蛋白表達(dá)水平最高.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高濃度的紅景天苷可以提高SKOV3細(xì)胞中PTEN蛋白的表達(dá)水平.

注：*P<0.05與CG組比較；**P<0.01與CG組比較；#P<0.05與SAL-1組比較；##P<0.01與SAL-1組比較.

4 討論

中藥已廣泛應(yīng)用于腫瘤的臨床治療,在抑制腫瘤發(fā)展、減輕腫瘤患者病痛、提高其免疫功能、延長患者壽命等方面發(fā)揮重要作用[3].紅景天苷是從紅景天、大花紅景天以及高山紅景天中提取的一種酚類活性物質(zhì).紅景天苷主要的藥理作用有抗衰老、抗氧化、抗腫瘤、抗疲勞、增強(qiáng)免疫力以及清除自由基等[9]，也有健脾益肺、活血化瘀的功效.近年來，多項(xiàng)研究表明紅景天苷具有抗腫瘤的作用，其可阻滯癌細(xì)胞的周期，誘導(dǎo)癌細(xì)胞的凋亡、分化和自噬，在多種癌癥治療中發(fā)揮著重要作用[10-14].

本研究發(fā)現(xiàn)紅景天苷能夠抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞的增殖，其抑制率與紅景天苷濃度成正相關(guān).隨著藥物作用時(shí)間的延長，SKOV3的存活率下降，濃度為40 μmol/mL的紅景天苷作用效果最顯著.

磷酸酶和張力蛋白同源物(PTEN)是公認(rèn)的腫瘤抑制因子,它的突變與缺失和多種癌癥的發(fā)生發(fā)展有關(guān).PTEN是PI3K/Akt通路上游因子之一,是該條通路關(guān)鍵的負(fù)調(diào)控基因[15].PTEN能夠?qū)I3K進(jìn)行負(fù)反饋調(diào)節(jié),PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的第二信號磷脂酰肌醇-3-磷脂(PIP3)去磷酸化變成磷脂酰肌醇-2-磷酸(PIP2)失去激活A(yù)kt的作用，從而抑制PI3K/Akt信號通路發(fā)揮作用.當(dāng)PTEN出現(xiàn)缺失或突變可能會(huì)導(dǎo)致PI3K/Akt信號通路的激活[16-18].對細(xì)胞生長、凋亡、增殖及黏附產(chǎn)生影響.近年來的研究成果已經(jīng)證實(shí),PTEN與子宮內(nèi)膜癌﹑卵巢癌、宮頸癌等多種婦科腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[19-20].本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同時(shí)間不同濃度的紅景天苷干預(yù)SKOV3細(xì)胞后，PTEN mRNA和蛋白的表達(dá)量隨著紅景天苷濃度的遞增而升高.

結(jié)合CCK-8和流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，隨著紅景天苷濃度的增加，卵巢癌細(xì)胞SKOV3的抑制率逐漸增加，作用時(shí)間越長，其抑制率越高，半數(shù)抑制濃度越低.高濃度紅景天苷處理組的細(xì)胞凋亡率顯著高于對照組，結(jié)果表明高濃度紅景天苷可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞SKOV3的凋亡.紅景天苷處理組G0/G1期細(xì)胞比例顯著多于對照組，因此表明紅景天苷將SKOV3細(xì)胞阻滯于G0/G1期.PTEN基因與蛋白表達(dá)水平的變化表明紅景天苷可能通過調(diào)控PTEN基因發(fā)揮抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖的作用，從而抑制癌癥的發(fā)生和發(fā)展.有關(guān)應(yīng)用紅景天苷干預(yù)卵巢癌的文獻(xiàn)甚少，本研究為紅景天苷抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖提供一定的理論依據(jù).