薛曉巖，張振興，季 佳，王雯慧,3，代紅煬，李高銀，李素華*，宋建領(lǐng)*

(1.西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南昆明 650224；2.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室，云南昆明 650224；3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南昆明 650031；4.會澤黑頸鶴國家級自然保護(hù)區(qū)管護(hù)局，云南曲靖 654200；5.昭陽區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，云南昭通 657000)

禽腺病毒4型(Fowl adenovirus 4，AdV-4)是近年來在我國暴發(fā)的以禽心包積液和肝炎為主要特征的病毒性傳染病，給我國養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。該病起源于巴基斯坦安卡拉地區(qū)，又稱“安卡拉病毒”，之后在伊拉克、印度、智利、美國南部和中部、韓國、波蘭、日本等國家和地區(qū)大面積暴發(fā)和流行。2014年我國北方多地相繼暴發(fā)該病，2015年開始在我國呈地區(qū)流行態(tài)勢。近年來，該病的診斷技術(shù)、疫苗研制和防控技術(shù)的研究都取得了一定的進(jìn)展，為了更好地預(yù)防和控制該病的發(fā)生與流行，本文比較全面的綜述了該病的病原學(xué)特點及其研究成果。

1 禽腺病毒的病原學(xué)

1.1 禽腺病毒分類

禽腺病毒(Fowl adenovirus，F(xiàn)AdV)是屬于禽腺病毒科(Adenoviridae)禽腺病毒屬的是一種DNA病毒。根據(jù)病毒群特異性抗原的差異性，可將FAdV分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3個亞群。禽腺病毒Ⅰ群(FAdV-Ⅰ)具有共同的群抗原，是雞胚致死孤兒病(chicken embryo lethal orphan，CELO)和雞包涵體肝炎(inclusion-body hepatitis，IBH)的主要病原；禽腺病毒Ⅱ群(FAdV-Ⅱ)是雛雞大理石脾病(Marble spleen disease，MSD)的主要病原；禽腺病毒Ⅲ群(FAdV-Ⅲ)是引起減蛋綜合征(Egg drop syndrome，EDV)的代表性毒株。

FAdV Ⅰ群與Ⅱ群無抗原相關(guān)性，二者與Ⅲ群只有部分抗原交叉反應(yīng)[1]。根據(jù)抗血清的交叉中和反應(yīng)特性和限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性技術(shù)分析,可將Ⅰ亞群FAdV分為12個血清型(1～8a，8b～11)和5個基因型(A～E)。血清型和基因型具有確定相關(guān)性，其中A基因型包括1個血清型(FAdV-A-1)，B基因型包括1個血清型(FAdV-B-5),C基因型包括2個血清型(FAdV-C-4和FAdV-C-10),D基因型包括4個血清型(FAdV-D-2、FAdV-D-3、FAdV-D-9和FAdV-D-11),E基因型包括4個血清型(FAdV-E-6、FAdV-E-7、FAdV-E-8a和FAdV-E-8b)。當(dāng)前國內(nèi)主要流行C和E兩種基因型，F(xiàn)AdV-11、FAdV-4、FAdV-8a、FAdV-8b，F(xiàn)AdV-D-11等血清型均在國內(nèi)感染雞中分離到，尤其以FAdV-C-4流行范圍最廣、致病性最高，在家禽養(yǎng)殖中危害最大[2，3]。

1.2 禽腺病毒結(jié)構(gòu)及主要結(jié)構(gòu)蛋白

FAdV是20面體對稱的球形狀，無囊膜包被，直徑為70 nm～90 nm[4]，病毒外殼由衣殼蛋白(Capsid)、核酸芯髓(Core)和纖突(Fiber)及相關(guān)蛋白組成，病毒結(jié)構(gòu)如圖所示(圖1)[5]。其中衣殼蛋白由240個六鄰體(Hexon)、12個五鄰體(Penton)和12個纖突(Fiber)3種結(jié)構(gòu)蛋白構(gòu)成[6]。病毒核酸為雙鏈DNA結(jié)構(gòu)，包裹在蛋白質(zhì)外殼中心部位，占整個病毒體積的11%～14%，因此FAdV也被認(rèn)為是目前體積最大和結(jié)構(gòu)最復(fù)雜的DNA病毒。基因組約為43 kb～46 kb，基因兩端各含有一個約40 bp～200 bp末端重復(fù)序列[7]。

圖1 禽腺病毒粒子模式圖[5]Fig.1 Pattern diagram of avian adenovirus particles[5]

1.2.1 六鄰體蛋白 六鄰體(Hexon)蛋白基因全長2 829 bp，共編碼943個氨基酸，是結(jié)構(gòu)蛋白中含量最高、分子量最大、結(jié)構(gòu)最穩(wěn)定的蛋白，且FAdV各亞群的Hexon具有較高同源性。Hexon是由3條長度相近的六鄰體多肽鏈(330 ku～360 ku)聚合而成的非頂點殼粒子。每個六鄰體多肽由基底區(qū)(pedestal regions)和高變環(huán)區(qū)(variable loops)兩部分構(gòu)成，基底區(qū)包括P1、P2兩個保守區(qū)域，高變環(huán)區(qū)由Loop 1～4共4個環(huán)裝區(qū)共同構(gòu)成，其中Loop 1區(qū)由132-289位aa組成，Loop 2區(qū)由363-507位aa組成，Loop 4區(qū)在793-878位aa組成[8，9]。Hexon蛋白具有特異抗原決定簇，可通過loop 1區(qū)遺傳進(jìn)化分析確定FAdV血清型[10]。FAdV的毒力也可能由Hexon介導(dǎo)，高致病性FAdV-4毒株的Hexon蛋白被非致病性毒株Hexon替換后，毒力明顯減弱[11]。此外，Hexon蛋白的高變環(huán)區(qū)與病毒感染力密切相關(guān)，研究表明在FAdV復(fù)制前期，高變環(huán)區(qū)與宿主肺巨噬細(xì)胞scavenger受體SR-A6的結(jié)合，可促進(jìn)病毒入侵宿主細(xì)胞，并加快復(fù)制過程[12]。

1.2.2 五鄰體蛋白 五鄰體(Penton)蛋白由5個多肽組成頂點殼粒，殼粒直徑8 nm～10 nm，均排在三角形面上。Penton可與Hexon蛋白結(jié)合介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞黏附，并通過與宿主細(xì)胞受體結(jié)合，激活宿主細(xì)胞發(fā)生病變[13]。

1.2.3 纖突蛋白 衣殼蛋白的12個纖突(Fiber)蛋白均以Penton base為基底，長約為9 nm～77.5 nm，以天線樣穿過衣殼伸出到頂端，是病毒最外側(cè)蛋白[14]。蛋白遠(yuǎn)端為頭結(jié)區(qū)，形成球域蛋白(Knob protein)，結(jié)合有FAdV的血凝素蛋白，是病毒與宿主細(xì)胞表面受體結(jié)合的部位，直接介導(dǎo)病毒與靶細(xì)胞接觸。通常哺乳動物腺病毒只有一種纖突蛋白，而FAdV中均存在兩種長度具有差異的纖突蛋白，即長纖維Fiber-1和短纖維Fiber-2，分別由基因獨立編碼。雖然兩種Fiber蛋白的存在是所有FAdV所共有的，不同血清型FAdV中的兩種Fiber編碼基因具有差異性，使得Fiber長度存在血清型差異性,其中FAdV-A-1是唯一存在50 nm極端長度差的血清型，這一特征可作為FAdV-A-1與其他血清型的鑒別標(biāo)志[15]。然而有研究對FAdV代表毒株的Fiber序列深入研究后發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AdV-C是唯一具有相同長度的Fiber蛋白的FAdV物種[16]。研究表明，F(xiàn)iber-2基因有助于增強(qiáng)病原體的增殖能力，缺失該基因，將無法產(chǎn)生病毒粒子，從而使病毒失去毒性，高致病性FAdV-4毒株的Fibe-2被弱毒株ON1 Fiber-2替換后病毒毒性明顯減弱[10]。

1.3 禽腺病毒理化特性

由于FAdV無囊膜包被，因此病毒對乙醚、胰蛋白酶等脂溶劑具有較強(qiáng)的抵抗力，經(jīng)脂溶性溶劑處理后的病毒仍具有感染性。低溫環(huán)境更有利于FAdV-Ⅰ病毒粒子存活，可在-20℃環(huán)境中長期存活，但在56℃經(jīng)30 min可滅活；病毒對pH環(huán)境有相當(dāng)強(qiáng)的耐受能力，在pH 3～9中仍可保持感染性。但1 g/L的甲醛溶液和DNA抑制劑5-碘-2脫氧尿苷可使病毒迅速滅活。FAdV-Ⅰ不可凝集禽類紅細(xì)胞，但在pH 6～9的室溫條件下可凝集大鼠紅細(xì)胞，血凝素對胰酶、RNA酶、神經(jīng)氨酸酶不敏感。

2 FAdV-4流行病學(xué)特征

禽腺病毒血清4型(FAdV-4)是致病性最強(qiáng)的腺病毒[17]，不僅能夠引起雞包涵體肝炎，還能引起心包積液，稱為心包積液-包涵體肝炎綜合征(Hydropericardium syndrome-inclusion body hepatitis,HPS-IBH)或者稱為雞心包積水綜合征(Hydropericardium syndrome,HPS)[18]。該病最早暴發(fā)于1987年的巴基斯坦的安卡拉地區(qū)的肉雞場內(nèi)，因為較強(qiáng)的傳染性使得在巴基斯坦其他地區(qū)迅速傳播，故又稱為“安卡拉病毒”。

2.1 FAdV-4的易感動物

FAdV-4易感肉雞、蛋雞、鴨、鵝等家禽，也可感染野生禽類。有學(xué)者[19]在野生黑鳶組織細(xì)胞切片中發(fā)現(xiàn)類似腺病毒的病毒顆粒。2014年有學(xué)者[20]在鴕鳥、烏鴉和鴿中成功分離到FAdV-Ⅰ，并通過陽性標(biāo)準(zhǔn)血清將分離株鑒定為FAdV-4。通過血清學(xué)試驗，在麻雀、孔雀血液中檢測到FAdV-4抗體呈陽性。研究者在死亡南極賊鷗的心臟、氣管、肺臟、腸道、肝臟以及腎臟組織中用PCR技術(shù)成功獲得FAdV基因組全長[21]。在2020年，國內(nèi)研究者第一次從鵪鶉中分離到FAdV-4毒株[22]。此外，我國學(xué)者從疑似患有HPS-IBH的鴛鴦肝臟組織中分離鑒定到一個FAdV-4分離株，該毒株來自患HPS-IBH家禽傳播感染[23]。

2.2 FAdV-4的傳播途徑

通常該病多見于高溫和潮濕地區(qū)，并且與多種家禽混養(yǎng)地區(qū)或者大規(guī)模飼養(yǎng)肉雞地區(qū)。研究表明，F(xiàn)AdV-4能長期潛伏于糞便、鼻氣管黏膜和腎臟中，可以通過各種排泄物排毒，其中糞便中載毒量最高，因此大部分發(fā)病雞是通過帶毒糞便經(jīng)糞-口途徑傳播。研究顯示病毒可通過呼吸道排放的病毒顆粒形成氣溶膠，在雞群短距離范圍內(nèi)緩慢傳播，但感染率較低。此外，病毒也可通過種蛋、雞胚垂直傳播。

2.3 FAdV-4的流行特征

起源于巴基斯坦安卡拉的FAdV-4，目前已在印度、中東、土耳其、斯洛伐克、墨西哥、秘魯、厄瓜多爾、俄羅斯、孟加拉國、智利、韓國和科威特有報道[24]。2014年開始在我國多地零星散發(fā)，2015年6月在我國呈現(xiàn)地方流行性，在山東、河南、江蘇、安徽、湖北、廣東、海南、云南等地均有報道[25,26]。研究者通過對我國2015年-2016年流行的105株FAdV進(jìn)行序列分析發(fā)現(xiàn)，其中93%為FAdV-4，說明FAdV-4是引起我國雞HPS的主要病原[27]。通過對2015年我國分離到的12株FAdV-4的Hexon基因遺傳進(jìn)化分析表明，國內(nèi)流行毒株可能源于印度株[28,29]。病毒分子特征分析顯示2015年國內(nèi)流行的FAdV-C-4和FAdV-E-8b毒株的Hexon蛋白，相比早期毒株已分別出現(xiàn)17個和84個核苷酸突變位點，氨基酸突變率分別為2.9%和10.4%。深入研究發(fā)現(xiàn)，國內(nèi)不同地區(qū)的分離株可能具有共同的祖先，李昕鍵等[30]分離到的海南HN1605毒株與山東分離株SDSX、SDXT2-15、SDSX-15、SDNY2-15 和湖北分離株HB1510、HBLF-15均來自同一毒株。近年來，國內(nèi)開始出現(xiàn)FAdV-4新毒株，這些毒株均分離自IBH和HPS患雞，該毒株與以往毒株的全基因組序列相比有一個ORF19缺失，為近年來FAdV-4毒性和傳染性增強(qiáng)提供一定的理論基礎(chǔ)[31]。

3 FAdV-4型檢測方法

3.1 病毒分離

由于肝臟是病毒載量最高的發(fā)病器官，通過將病雞肝臟組織研磨、過濾、除菌制成懸液，接種于6～9日齡SPF雞胚的卵黃囊、尿囊膜或尿囊腔的方式盲傳3代，收集雞胚尿囊液、尿囊膜雞雞胚肝組織可實現(xiàn)病毒的分離和純化。有研究表明FAdV-4經(jīng)卵黃囊途徑接種雞胚后在雞胚肝臟組織中的增殖效果最好，病毒載量最高，雞胚胎腎細(xì)胞、肝細(xì)胞、成纖維細(xì)胞中也能分離到病毒，但病毒載量較低[32]。

3.2 分子生物學(xué)技術(shù)

實驗室最常用的檢測FAdV-4的方法是針對Hexon和Fiber設(shè)計引物，通過PCR鑒別特定血清型。近年來熒光定量PCR及特異性LAMP也被應(yīng)用于FAdV-4的鑒定。Pan等人建立了針對Hexon Loop 1區(qū)的探針熒光定量PCR檢測方法，具有更高的敏感性[33]。鐘鳴等人建立了FAdV-4特異性LAMP的檢測方法。也有學(xué)者[34]建立了基于Fiber基因的PCR-RFLP方法，可有效鑒別毒株是否可誘導(dǎo)HPS。

3.3 血清學(xué)方法

血凝和血凝抑制試驗常用于鑒定FAdV-4的血清型。Manzoor S等人通過使用人O型紅細(xì)胞血凝抑制試驗從野鳥中檢測出FAdV-4的血清抗體。近年來Feichtner等人利用FAdV-1和FAdV-4的Fiber作為抗原建立了2種血清型的ELISA鑒別檢測方法[35]。研究表明FAdV-4血清可以中和FAdV-11，但FAdV-11血清卻不能中和FAdV-4，同時FAdV-4、FAdV-8a和FAdV-8b之間也均不能相互中和，但FAdV-11與FAdV-8b之間可以相互中和[9]。

4 FAdV-4型疫苗

在研制FAdV-4弱毒活疫苗和油乳劑滅活疫苗的同時，很多研究者在FAdV-4基因工程疫苗和亞單位疫苗研究中也獲得一定進(jìn)展。張丹等研制的Penton、Fiber 2亞單位疫苗免疫均可使SPF雞獲得100%的保護(hù)率，且以Penton蛋白為抗原的疫苗刺激雞產(chǎn)生的抗體效價更高，抗體保護(hù)期更長[36]。范維等研制的FAdV-4 Fiber 2蛋白亞單位疫苗也能夠保護(hù)雞只免受強(qiáng)毒的攻擊[37]。韋悠等制備了FAdV-4和FAdV-8的多價油乳劑滅活苗，結(jié)果表明該疫苗穩(wěn)定性及安全性良好，免疫效果能持續(xù)6個月以上[38]。龐洪澤構(gòu)建的FAdV-4 Hexon和Penton串聯(lián)基因核酸疫苗，在雛雞體內(nèi)產(chǎn)生了特異性抗體[39]。疫苗的制備工藝也將影響免疫效果，研究表明HPS病死雞肝勻漿油乳劑疫苗保護(hù)效果明顯較鋁膠佐劑的效果要好,雞胚肝細(xì)胞勻漿(CEHH)疫苗的抗原含量較HPS-LH要低很多[40]。

5 展望

近年來，由于FAdV-4的迅速傳播，對國內(nèi)外家禽養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，該病的預(yù)防措施和治療得到了國內(nèi)外研究人員的高度重視。研究人員通過對FAdV-4病毒粒子的研究，一些制備的滅活疫苗和新型疫苗對阻斷FAdV-4的傳播有一定的效果。為了有效防控該病的發(fā)生與流行，應(yīng)該加強(qiáng)對新出現(xiàn)的FAdV-4型毒株生物學(xué)特性、發(fā)病機(jī)制、診斷檢測技術(shù)、該病與家禽其他傳染病之間的關(guān)聯(lián)性研究。家禽感染FAdV-4后誘導(dǎo)宿主免疫器官產(chǎn)生免疫逃避，應(yīng)進(jìn)一步探究其潛在的分子機(jī)制和參與該過程的細(xì)胞因子對闡明該病發(fā)病機(jī)制提供理論基礎(chǔ)；在終端檢測技術(shù)方面，未來應(yīng)研究敏感、特異、快速的新型等溫擴(kuò)增、免疫酶等檢測技術(shù)，能夠檢測不同感染宿主中不同組織樣品病原核酸；在該病與家禽其他傳染病之間的共感染中，應(yīng)該深入研究共感染因子和宿主之間的作用機(jī)制，對家禽常見疫病與FAdV-4共感染病例之間在組織損傷、生化水平和年齡依賴等方面進(jìn)行對比，有助于對研究共感染的致病機(jī)制提供依據(jù)。