林 楊, 顧美英 , 孫 建, 唐琦勇, 李 雪, 朱 靜, 古麗尼沙·沙依木, 張志東,2*

(1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所 新疆特殊環(huán)境微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830091;2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052)

乳酸菌(Lactic acid bacteria, LAB)是指利用碳水化合物發(fā)酵，可產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌統(tǒng)稱[1]，主要為革蘭陽(yáng)性細(xì)菌，其廣泛分布于自然界中[2]，對(duì)動(dòng)、植物和人類的正常生理代謝發(fā)揮了重要的作用[3]，可廣泛用于食品、醫(yī)藥及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等領(lǐng)域。新疆是畜牧業(yè)大省，因傳統(tǒng)習(xí)俗和飲食文化，多個(gè)民族具有食用發(fā)酵乳制品的悠久歷史，存在風(fēng)味不一、極具各民族特色的傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品，如酸馬奶、奶豆腐、稀奶油、奶疙瘩等，蘊(yùn)藏著豐富的乳酸菌資源。然而，隨著工業(yè)化乳酸發(fā)酵劑的大量使用，使得傳統(tǒng)發(fā)酵工藝受到嚴(yán)重沖擊，導(dǎo)致部分具有優(yōu)良性狀的菌株流失。因此，加大相關(guān)傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中乳酸菌資源的挖掘和評(píng)價(jià)，有著重要的科學(xué)研究意義。近年來(lái)，許多學(xué)者從新疆各地區(qū)的傳統(tǒng)乳制品中分離獲得多種乳酸菌資源，均表現(xiàn)出良好的生產(chǎn)特性和應(yīng)用價(jià)值。如蔡靜靜等[4]從新疆伊犁地區(qū)的傳統(tǒng)乳制品中，篩選出具有良好產(chǎn)酸及產(chǎn)香的乳桿菌，并以此為發(fā)酵劑，研制出了特性好、風(fēng)味佳的發(fā)酵乳；高云云等[5]從新疆塔城地區(qū)的酸馬奶等乳制品中篩選出3株高產(chǎn)胞外多糖的植物乳桿菌，其中菌株1-3展現(xiàn)出較強(qiáng)的腸道定殖、降膽固醇能力和膽鹽耐受性等益生特性，可作為潛在益生菌應(yīng)用于功能性產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)。此外，還有學(xué)者針對(duì)阿克蘇拜城縣的傳統(tǒng)發(fā)酵酸奶進(jìn)行乳酸菌的分離篩選，獲得的部分菌株具有良好的產(chǎn)多糖、產(chǎn)香等發(fā)酵特性及益生特性。新疆阿克蘇托木爾峰國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)位于阿克蘇地區(qū)溫宿縣北部，與吉爾吉斯斯坦相接壤，其周邊世代生活著維吾爾族、柯?tīng)柨俗巫宓饶撩?，保存著歷史悠久的常溫自然發(fā)酵酸奶的傳統(tǒng)工藝，其相關(guān)乳酸菌資源目前鮮有報(bào)道，有待深入挖掘。 本研究通過(guò)對(duì)托木爾峰自然保護(hù)區(qū)周邊村鎮(zhèn)傳統(tǒng)發(fā)酵酸乳進(jìn)行收集，分離篩選相關(guān)乳酸菌，并對(duì)菌株的生長(zhǎng)特性、益生功能及食用安全性進(jìn)行研究，為進(jìn)一步篩選益生效果好、食品安全的乳酸菌資源，并對(duì)其開(kāi)發(fā)和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 ①傳統(tǒng)酸乳：2020年6月采自阿克蘇地區(qū)蘇托木爾峰自然保護(hù)區(qū)周邊村鎮(zhèn)，由柯?tīng)柨俗巫宕迕癫捎脗鹘y(tǒng)工藝常溫自然發(fā)酵而成。②指示菌：大腸埃希菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、青霉菌(Penicillium)和黑曲霉(Aspergillusniger)菌株，均由新疆微生物資源保藏管理中心(Microbiological Culture Collection Center of Xinjiang，MCCCX)提供。③抗生素濾紙片：青霉素10 IU/片、紅霉素15 μg/片、四環(huán)素30 μg/片、鏈霉素10 μg/片、慶大霉素10 μg/片、卡那霉素30 μg/片、諾氟沙星10 μg/片、氨芐西林10 μg/片、利福平5 μg/片、萬(wàn)古霉素30 μg/片，購(gòu)自北京天壇生物制品股份有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①M(fèi)RS培養(yǎng)基、R2A培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基、乳糖膽鹽培養(yǎng)基和哥倫比亞血瓊脂培養(yǎng)基，購(gòu)自青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；②功能酶定性培養(yǎng)基：在R2A培養(yǎng)基中分別加入1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的脫脂牛奶、可溶性淀粉、果膠、吐溫-80、羧甲基纖維素鈉制備而成；③生物胺檢測(cè)培養(yǎng)基：牛肉膏5.0 g，胰蛋白胨5.0 g，酵母粉5.0 g，葡萄糖0.5 g，檸檬酸銨2.0 g，氯化鈉2.5 g，磷酸氫二鉀2.0 g，吐溫-80 1 mL，硫酸鎂0.2 g，碳酸鈣0.1 g，硫酸亞鐵0.04 g，硫酸錳0.05 g，維生素B10.01 g，5-磷酸吡哆醛0.05 g，溴甲酚紫0.06 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH值5.8～6.0；④改良氨基脫羧酶檢測(cè)培養(yǎng)基：分別在生物胺檢測(cè)培養(yǎng)基中加入10 g/L的對(duì)應(yīng)前體氨基酸(精氨酸、酪氨酸、尸氨酸、色氨酸、組氨酸)，制備而成；⑤硝基還原酶檢測(cè)培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，硝酸鉀1 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.4左右；⑥蛋白胨水培養(yǎng)基：蛋白胨20 g，氯化鈉5 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.4～7.6。

1.1.3 儀器與設(shè)備 超凈工作臺(tái)(SW-CJ-1F，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；生化培養(yǎng)箱(SPX-250BF，上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；立式冷藏柜(SC-316，海爾HAIER公司)；自動(dòng)高壓滅菌鍋(HVE-50，日本HIRAYAMA公司)；紫外分光光度計(jì)(UVZ2550，日本島津儀器公司)；PCR儀(ABI 2720，賽默飛世爾科技有限公司)；光學(xué)顯微鏡(CH20BIMF200，日本Olympus有限公司)；高速冷凍離心機(jī)(PLCD，德國(guó)Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離篩選 無(wú)菌條件下，采用標(biāo)準(zhǔn)梯度稀釋法，分別取1 mL酸乳樣品置于9 mL生理鹽水中，混勻，依次稀釋至10-5。分別取各濃度樣品稀釋液100 μL，均勻涂布于含有1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))CaCO3的MRS平板上，37 ℃培養(yǎng)48 h。挑取有溶鈣圈的菌落，劃線純化后，轉(zhuǎn)接至MRS固體斜面，37 ℃培養(yǎng)48 h，置于4 ℃保存，備用。

1.2.2 菌株的分子鑒定 挑取少量新鮮的單菌落菌苔，并以此為PCR擴(kuò)增模板，利用細(xì)菌16S rRNA基因序列PCR擴(kuò)增通用引物(27 F和1492 R)，進(jìn)行16S rRNA基因序列的擴(kuò)增[6]。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，切膠回收后，送至北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司測(cè)序。在EzTaxon數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ezbiocloud.net/)中，進(jìn)行菌株的16S rRNA基因序列比對(duì)，并下載相似性最高的模式菌株序列，使用MEGA 7.0進(jìn)行ClustalX多重比對(duì)，并構(gòu)建Neighbor-Joining系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，初步確定菌株分類地位。

1.2.3 菌株的生長(zhǎng)特性 菌株的適宜生長(zhǎng)溫度、耐鹽特性和起始pH均采用MRS液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行，膽鹽耐受性在含0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))豬膽鹽的乳糖膽鹽培養(yǎng)基上進(jìn)行；牛奶胨化試驗(yàn)參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[7]進(jìn)行。

1.2.4 菌株的功能性酶活 將斜面保存的乳酸菌菌株于MRS平板活化2～3代后，采用點(diǎn)接法，用無(wú)菌竹簽分別將各菌株接種至果膠酶篩選培養(yǎng)基、酯化酶篩選培養(yǎng)基、淀粉酶篩選培養(yǎng)基、纖維素篩選培養(yǎng)基等待測(cè)培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)3～5 d，分別測(cè)量菌落周圍的透明圈直徑和菌落直徑，并以HC值(透明圈直徑/菌落直徑)判斷各菌株的產(chǎn)酶能力。其中，可直接觀察菌落周圍的透明圈篩選蛋白酶、果膠酶和酯化酶；用0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的碘液染色后觀察透明圈，篩選淀粉酶；用0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的剛果紅染色后觀察透明圈,篩選纖維素酶[8]。

1.2.5 菌株的抗氧化活性 將乳酸菌菌株接種至MRS液體培養(yǎng)基中，30 ℃，150 r/min培養(yǎng)48 h后，取10 mL發(fā)酵菌液，4 000 r/min、4 ℃離心15 min，得到發(fā)酵上清液，并參照李權(quán)威等[9]和張瑩[10]的方法，于室溫測(cè)定各菌株上清液的DPPH自由基和羥基(OH-)自由基清除能力。每組試驗(yàn)各重復(fù)3次，以1 mg/mL的維生素(VC)作為對(duì)照。

1.2.6 菌株的抑菌活性 分別挑取新鮮培養(yǎng)的指示菌株大腸埃希菌、枯草芽胞桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌，接種于LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)16 h。取100 μL發(fā)酵菌液，均勻涂布于MRS固體培養(yǎng)基。待上述菌液平板吸收后，將乳酸菌菌株點(diǎn)接于劃定區(qū)域中心，30 ℃培養(yǎng)48 h，觀察菌株抑菌圈情況。青霉菌、黑曲霉則用無(wú)菌生理鹽水制成的孢子懸液涂布于平板，點(diǎn)接乳酸菌菌株，培養(yǎng)48 h后，觀察菌株抑菌圈情況。

1.2.7 菌株藥敏性評(píng)價(jià) 乳酸菌菌株于MRS液體培養(yǎng)基活化過(guò)夜，3 000 r/min離心10 min后棄去上清液，菌體重懸于無(wú)菌生理鹽水中，并調(diào)整菌體濁度為0.5麥?zhǔn)蠁挝?。分別取100 μL菌懸液，均勻涂布于MRS固體培養(yǎng)基，待菌液被平板吸干后，將藥敏紙片貼于培養(yǎng)基表面，37 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)量抑菌圈直徑，并記錄結(jié)果。

1.2.8 菌株的溶血性測(cè)定 取活化后的乳酸菌菌株，接種于哥倫比亞血瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落周圍溶血情況。菌落周圍形成透明的溶血環(huán)，為β-溶血；菌落周圍形成草綠色環(huán)，為α-溶血；菌落周圍沒(méi)有變化，為γ-溶血，即不溶血。金黃色葡萄球菌在相同條件下培養(yǎng)，作陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.9 菌株有害代謝物質(zhì)檢測(cè) ①生物胺的測(cè)定[11]：將活化后的乳酸菌菌株分別在改良氨基脫羧酶檢測(cè)平板和未添加前體氨基酸的平板上劃線，37 ℃培養(yǎng)并觀察顏色變化，變?yōu)樽仙臑殛?yáng)性，否則為陰性。試驗(yàn)以接菌在未添加前體氨基酸的平板(CK)為對(duì)照。②吲哚試驗(yàn)[12]：以2%(體積分?jǐn)?shù))乳酸菌菌懸液接種于蛋白胨水培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)48 h，滴加吲哚試劑，液面出現(xiàn)玫瑰紅色則為陽(yáng)性，否則為陰性。試驗(yàn)以大腸埃希菌為陽(yáng)性對(duì)照，以不接種乳酸菌菌液的蛋白胨水培養(yǎng)基為空白對(duì)照。③硝基還原酶活性檢測(cè)[13]：以1%(體積分?jǐn)?shù))乳酸菌菌懸液接種于硝基還原酶檢測(cè)培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)72 h，依次向乳酸菌發(fā)酵培養(yǎng)液中加入α-萘胺溶液和對(duì)氨基苯甲磺酸溶液，觀察培養(yǎng)基顏色的變化。以大腸埃希菌為陽(yáng)性對(duì)照，未接種菌株的硝基還原酶檢測(cè)培養(yǎng)基為空白對(duì)照。

1.2.10 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010、MEGA 7.0、Origin 8.0等數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行整理及統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選和分子鑒定

從采集的8種傳統(tǒng)酸奶中共分離挑選細(xì)菌35株，酵母菌3株。將其中的細(xì)菌轉(zhuǎn)接至含有1% CaCO3的MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)和透明圈大小，初步篩選出12株疑似乳酸菌株，經(jīng)革蘭染色、鏡檢，初步確定6株疑似乳酸菌。

將6株菌的16S rRNA基因序列與EzTaxon數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ezbiocloud.net/)中模式菌株進(jìn)行比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖1)。結(jié)果表明，6株菌均為乳酸菌，分屬于腸球菌屬(Enterococcus)、乳植桿菌屬(Lactiplantibacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)。分別編號(hào)為乳酸菌菌株Z6-4、Z6-9、Z6-11、Z8-1、Z8-5、Zp-1。

圖1 基于菌株16S rRNA基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of strains based on the 16S rRNA gene sequences

2.2 菌株的生長(zhǎng)特性

菌株的生長(zhǎng)特性(表1)表明，6株乳酸菌均能耐受5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的NaCl，其中5株可在45 ℃正常生長(zhǎng)，顯示出較強(qiáng)的耐溫及耐鹽特性；6株乳酸菌菌株均在起始pH 3.0時(shí)不生長(zhǎng)，而pH為4時(shí)，菌株Zp-1和Z8-5生長(zhǎng)較好。6株乳酸菌均可在0.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))豬膽鹽培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)，表現(xiàn)了良好的耐酸、耐鹽和耐膽鹽特性，有利于其在腸道中定殖。6株乳酸菌菌株均具有良好的胨化能力，無(wú)乳清析出；其中菌株Z6-9、Z8-5和Zp-1發(fā)酵牛奶香氣濃郁，酸乳柔和細(xì)膩，可作為乳制品工業(yè)中的潛在生產(chǎn)菌株。

2.3 菌株的功能性酶活

通過(guò)透明圈法對(duì)各菌株的產(chǎn)酶特性進(jìn)行分析(表2)，發(fā)現(xiàn)6株乳酸菌菌株可不同程度的代謝產(chǎn)生常見(jiàn)的食品工業(yè)酶，6株菌均產(chǎn)蛋白酶，其中4株活性較強(qiáng)；3株可產(chǎn)生淀粉酶，3株可產(chǎn)生果膠酶，當(dāng)酸乳加工和食用時(shí)，這些酶可較好地酶解食物中大分子蛋白，協(xié)助催化淀粉和果膠類食品分解，使之更容易消化吸收。但6株乳酸菌菌株的酯化酶和纖維素酶活力較差，均不產(chǎn)生纖維素酶，僅菌株Z8-5可產(chǎn)酯化酶。

表1 菌株的生長(zhǎng)情況

表2 菌株功能性酶活

2.4 菌株的抗氧化活性

菌株發(fā)酵上清液中的代謝產(chǎn)物對(duì)DPPH、OH-自由基的清除能力見(jiàn)圖2。由圖2可知，6株乳酸菌菌株的代謝產(chǎn)物對(duì)不同的自由基表現(xiàn)出不同程度的清除能力，其中菌株Z8-5和Zp-1發(fā)酵液對(duì)兩種自由基的清除率均在80%以上，清除能力較好；總體來(lái)說(shuō)，6株乳酸菌菌株對(duì)OH-自由基的清除率較DPPH自由基略好，菌株Z6-9和Z8-1的清除能力分別達(dá)96%和90%，與1 mg/mL VC清除OH-自由基的能力接近，而菌株Zp-1的清除率最低，僅為36%。除菌株Z6-4外，其余菌株對(duì)DPPH自由基的清除率差別不大，在77.5%～84.1%之間。

2.5 菌株的抑菌活性

抑菌性試驗(yàn)(表3)表明，6株乳酸菌菌株對(duì)常見(jiàn)的腸道致病菌均有不同程度的抑制作用，對(duì)大腸埃希菌和枯草芽胞桿菌均有抑制作用，而菌株Z6-9和Zp-1的抑制作用最強(qiáng)；4株對(duì)金黃色葡萄球菌有抑制作用，其中Z8-5和Zp-1的活性較強(qiáng)，但對(duì)霉菌和酵母菌均沒(méi)有抑制作用。一般而言，多數(shù)乳酸菌代謝產(chǎn)生細(xì)菌素，可對(duì)親緣關(guān)系相近的革蘭陽(yáng)性細(xì)菌有較好地抑制作用，而本研究中多數(shù)菌株對(duì)大腸埃希菌同樣表現(xiàn)出較強(qiáng)地抑制作用，表明本研究中的乳酸菌除代謝細(xì)菌素外，可能還代謝其他抑菌物質(zhì)，有待進(jìn)一步分析。

圖2 菌株發(fā)酵液對(duì)DPPH自由基、羥基(OH-)自由基清除能力Fig.2 DPPH and hydroxyl (OH-) free radical scavenging activity of metabolites from strainss

表3 菌株的抑菌活性

2.6 菌株藥敏性評(píng)價(jià)

選取10種常見(jiàn)抗生素進(jìn)行菌株的耐藥性評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示(表4)，6株乳酸菌菌株對(duì)抗生素呈現(xiàn)出不同的藥敏性。其中，所有菌株對(duì)紅霉素、氨芐西林和利福平具有敏感性，有5株菌株對(duì)萬(wàn)古霉素敏感。諾氟沙星抑菌效果最差，除菌株Z6-4和Z8-5外，其他菌株均對(duì)其具有耐藥性。此外，研究發(fā)現(xiàn)菌株Z6-4對(duì)試驗(yàn)抗生素均表現(xiàn)出藥敏性。本研究中，乳桿菌屬和腸球菌屬對(duì)四環(huán)素、紅霉素、利福平等表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐受性，這一結(jié)果與許女等[14]和張?jiān)诘萚15]對(duì)乳桿菌和腸球菌的研究結(jié)果一致。一般而言，耐藥性較強(qiáng)的菌株在腸道定殖后，有利于耐受各種原因服用的抗生素等藥物，從而更長(zhǎng)久地發(fā)揮其益生作用[16]，但也帶來(lái)了耐藥性基因轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。

表4 菌株抗生素敏感性

2.7 溶血性測(cè)定

菌株分泌的溶血素能夠溶解細(xì)胞，使機(jī)體引發(fā)紅細(xì)胞內(nèi)在缺陷、抗原抗體反應(yīng)等，從而導(dǎo)致敗血癥，這與菌株自身所攜帶的致病性基因有關(guān)，溶血性是評(píng)價(jià)乳酸菌安全性的重要指標(biāo)之一[17]。溶血試驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，6株乳酸菌菌落周圍既無(wú)草綠色環(huán)也無(wú)透明圈，屬于無(wú)毒性的γ-溶血，表明菌株不具有引發(fā)敗血癥的隱患。

2.8 有害代謝物質(zhì)檢測(cè)

6株乳酸菌菌株的有害代謝物質(zhì)檢測(cè)結(jié)果如表5所示，菌株Z6-4和Z6-11在添加了L-酪氨酸、L-色氨酸和L-組氨酸的平板上，呈現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，說(shuō)明其具有產(chǎn)胺能力，分別能夠?qū)⑶绑w氨基酸轉(zhuǎn)化為酪胺、色胺和組胺，而其余菌株則均為陰性結(jié)果，不具有生物胺產(chǎn)生能力。吲哚檢測(cè)表明，菌株Z6-11、Z8-1、Z8-5和Zp-1發(fā)酵液的液面顏色均為輕微的玫瑰紅色，結(jié)果呈弱陽(yáng)性；在硝基還原酶試驗(yàn)中，6株乳酸菌株均不產(chǎn)生硝基還原酶。

圖3 菌株的溶血試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Hemolysis test results of strainsA：6株乳酸菌菌株；B：金黃色葡萄球菌A: Six Lactic acid bacteria were tested; B:Staphylococcus aureus

表5 菌株的有害代謝物質(zhì)檢測(cè)

3 討 論

新疆地域廣闊，伊犁、阿勒泰、喀什、阿克蘇等地區(qū)少數(shù)民族均有利用馬乳、牛乳、駱駝乳、羊乳等發(fā)酵自制乳制品的習(xí)俗，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期自然馴化，保留了優(yōu)良特性的土著乳酸菌[18-20]。近年來(lái)，多數(shù)學(xué)者從新疆伊犁、喀什等地的傳統(tǒng)奶酪[21]、泡菜[22]和酸奶[23]中分離篩選獲得多種乳酸菌，且部分菌株具有良好的胃腸道耐受性和產(chǎn)酸、抑菌等益生特性。新疆阿克蘇地區(qū)作為古絲綢之路的重要驛站，乳制品種類繁多，尤其是阿克蘇拜城縣賽里木酸奶，又稱“拉絲酸奶”，具有顏色乳白、氣味清香、有彈性、酸甜可口，且質(zhì)地黏稠的特點(diǎn)[24]。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)[25]、塔里木大學(xué)[26]等先后對(duì)賽里木酸奶中菌株組成和酸奶營(yíng)養(yǎng)組分進(jìn)行了分析，分離出了瑞士乳桿菌(Lactobacillushelveticus)、嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)和馬克思克魯維酵母菌(Kluyveromycesmarxianus)，其中乳桿菌為優(yōu)勢(shì)菌屬，并推測(cè)GABA和油酸、亞油酸可能是賽里木酸奶中重要功能因子。但對(duì)獲得的菌株的食用安全性鮮有相關(guān)評(píng)價(jià)。

新疆阿克蘇托木爾峰國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)，位于新疆維吾爾自治區(qū)阿克蘇地區(qū)溫宿縣北部與吉爾吉斯斯坦相接壤，屬現(xiàn)代冰川、山地、荒漠、草原、森林混合生態(tài)系統(tǒng)。其周邊世代生活著維吾爾族、柯?tīng)柨俗巫宓饶撩?，保存著歷史悠久的常溫自然發(fā)酵酸奶的傳統(tǒng)工藝，此前少有研究。本研究對(duì)該地區(qū)周邊牧民農(nóng)戶進(jìn)行了酸奶收集，獲得了8個(gè)代表性樣品，并開(kāi)展了乳酸菌的分離篩選，獲得6株乳酸菌，經(jīng)16S rRNA序列分析，確定其隸屬于腸球菌屬(Enterococcus)、乳植桿菌屬(Lactiplantibacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)，其中腸球菌屬分離菌株最多，這可能是因當(dāng)?shù)氐臍夂?、海拔、傳統(tǒng)制作工藝等不同，造成菌株的分布具有一定的差異[27]。相關(guān)資源有待進(jìn)一步挖掘。

本研究獲得的乳酸菌均表現(xiàn)出較好的逆境適應(yīng)性和良好的抗氧化特性，所有菌株對(duì)大腸埃希菌和枯草芽胞桿菌均有抑制作用，且各菌株均可不同程度地表現(xiàn)出食品酶活及優(yōu)良的益生作用。抗生素的藥敏性分析表明，6株乳酸菌株呈現(xiàn)出不同的藥敏特性。一般認(rèn)為，乳酸菌分離自傳統(tǒng)發(fā)酵食品或動(dòng)物腸道中，具有食品安全性(Generally recognized as safe，GRAS)[28]，具有良好耐藥性的菌株能夠抵抗外來(lái)藥物的干擾，從而更好地定殖于腸道中發(fā)揮益生作用。然而，隨著抗生素濫用，部分乳酸菌表現(xiàn)出抗藥性增加和抗性基因潛在轉(zhuǎn)移[29]，其相關(guān)影響有待長(zhǎng)期動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)觀察。

安全性分析表明，試驗(yàn)所用的6株乳酸菌菌株均不溶血，且不具有硝基還原酶產(chǎn)生能力；部分菌株可代謝產(chǎn)生生物胺。相關(guān)報(bào)道顯示，能夠產(chǎn)生物胺的乳酸菌主要包括部分乳桿菌、腸球菌和片球菌等[30]，而本研究中的鏈球菌屬菌株Z6-11同樣具有產(chǎn)生物胺能力，與目前報(bào)道較為不同，由此可以看出，產(chǎn)生物胺的乳酸菌并無(wú)種屬特異性。生物胺可同藥物聯(lián)合治療疾病，且在動(dòng)植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著不可替代的作用[31-32]；然而當(dāng)遇到亞硝酸鹽存在時(shí)，可生成致癌物質(zhì)[33]，本研究中的乳酸菌菌株均不具有硝基還原酶，其生物胺的產(chǎn)生可能發(fā)揮益生作用。同時(shí)，本研究中部分菌株在吲哚試驗(yàn)中呈弱陽(yáng)性，而吲哚作為抗炎、解熱及鎮(zhèn)痛等藥劑的主要成分，在動(dòng)物健康中扮演了重要角色，具有重要的生物學(xué)及生態(tài)學(xué)雙重意義[34]。因此，相關(guān)菌株的生物安全性仍需進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)，以便做出進(jìn)一步評(píng)價(jià)。