徐 沖， 馮 敏*， 柴林山， 李劍梅， 張疏雨， 陳 杰， 郭玲玲, 陳麗媛, 王立飛

(1.遼寧省微生物科學研究院，遼寧 朝陽 122000；2.遼寧省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)基地建設(shè)工程中心，遼寧 沈陽 110033)

香菇(Lentinulaedodes(Berk.)Pegler)又名花菇、香蕈、冬菇，屬層菌綱、擔子菌亞綱、傘菌目、口蘑科[1]。香菇肉質(zhì)肥嫩，味道鮮美，香味獨特，受到廣大消費者喜愛，同時富含多種營養(yǎng)物質(zhì)，如多糖、蛋白質(zhì)、嘌呤、氨基酸以及多種不飽和脂肪酸和礦質(zhì)元素[2-4]，其中香菇多糖為主要活性成分，其以β-(1-3)葡萄糖殘基為主鏈，β-(1-6)葡萄糖殘基為側(cè)鏈，單糖主要包括葡萄糖、甘露醇和半乳糖[5]。香菇多糖具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等功能，并廣泛應用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域[6-8]，從香菇子實體中直接提取多糖不僅周期長，且成本高，而利用液體發(fā)酵方法生產(chǎn)香菇多糖已成為行業(yè)普遍采用的方法[9-11]，香菇多糖的液體發(fā)酵培養(yǎng)研究主要以優(yōu)化發(fā)酵條件和篩選選育高產(chǎn)多糖菌株為手段，而選育高產(chǎn)多糖菌株是基礎(chǔ)，高產(chǎn)香菇多糖菌株主要通過自然篩選[9，12]、雜交育種[13]、誘變篩選[14-15]等方法獲得。本研究通過對采集自長白山的6株野生香菇菌株和2株實驗室保藏的人工栽培菌株，進行發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)多糖性能篩選研究，旨在為生產(chǎn)香菇多糖提供優(yōu)質(zhì)菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 6株通過組織分離自長白山的野生香菇菌株，編號分別為CB0901、CB0902、CB0903、CB0904、CB0905、CB0906；2株為人工栽培菌株，編號分別為L06、F0912。8株香菇菌株均由遼寧省微生物科學研究院食用菌育種研究室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基[10]①固體培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基；②液體發(fā)酵培養(yǎng)基：馬鈴薯100 g去皮煮沸15 min過濾，濾液中加入葡萄糖20 g，酵母膏4 g，KH2PO43 g，MgSO41.5 g，加水定容至1 000 mL， pH自然，以500 mL三角瓶裝液量100 mL進行分裝，121 ℃滅菌30 min。

1.1.3 試劑與儀器 葡萄糖、酵母膏、MgSO4、KH2PO4、濃硫酸、苯酚(分析純)。超凈工作臺(VS-1300L-U，蘇州安泰)；電子天平(ME104E，上海梅特勒-托利多)；高壓滅菌鍋(LD2F-75L，上海申安)；多功能酶標儀(1510-03055，美國Themo Fisher公司)；高速離心機(Hico21，上海生工)；恒溫搖床(SPH2102，上海世平)；生化培養(yǎng)箱(SPX-450，北京中儀國科)；電熱鼓風干燥箱(101-2BS，天津宏諾)。

1.2 方法

1.2.1 菌株培養(yǎng) 無菌條件下將菌株接種于PDA平板中央，25 ℃恒溫避光培養(yǎng)7～10 d,待菌絲長滿平板后，用打孔器取直徑0.5 cm菌絲塊接入500 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基，160 r/min，25 ℃避光培養(yǎng)6 d得種子液，按照10%(體積分數(shù))接種量接入液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，160 r/min，25 ℃避光培養(yǎng)，分別設(shè)置7、10、14 d時結(jié)束發(fā)酵，每個試驗3個重復。

1.2.2 菌絲生物量及胞內(nèi)多糖含量測定 各菌株按1.2.1培養(yǎng)至相應天數(shù)，收集發(fā)酵液8 000 r/min離心20 min去上清液，得到菌絲體，蒸餾水洗滌3次，冷凍干燥后稱得菌絲體生物量。取3個重復平均值，單位g/L。將凍干后的菌絲體研磨成粉末，并稱取50 mg加入50 mL容量瓶中，沸水浴中提取3 h,冷卻至室溫后定容混勻，8 000 r/min離心20 min,取上清液，苯酚硫酸法測定總糖含量[16]，3,5-二硝基水楊酸法測定還原糖含量[17]，胞內(nèi)多糖含量=總糖-還原糖。

1.2.3 胞外多糖得率及多糖含量測定 取1.2.2中的上清液，緩慢加入4倍體積無水乙醇，攪拌均勻，4 ℃靜置醇沉12 h，8 000 r/min離心20 min，收集沉淀以無水乙醇洗滌2次，收集沉淀物，冷凍干燥得胞外多糖，稱重計算得率。采用苯酚硫酸法測定其多糖含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵時間各菌株菌絲體生物量比較

對各菌株菌絲體生物量進行比較，結(jié)果顯示各菌株菌絲體生物量存在較大差異(圖1)，各菌株隨著培養(yǎng)時間的延長菌絲體生物量均有不同程度的增加。培養(yǎng)至第7天時，菌株CB0901、CB0902和CB0903的菌絲體生物量分別達到8.42、6.09和7.18 g/L，顯著高于其他5株菌株。與培養(yǎng)第7天相比，培養(yǎng)至第14天時，菌株CB0901菌絲體生物量最高，為14.76 g/L，提高幅度也最大；菌株CB0903次之，菌絲體生物量為13.77 g/L；菌株CB0902菌絲體生物量為10.56 g/L。這3株菌對比其他5株菌絲體生物量存在較大差異，因此菌株CB0901、CB0902和CB0903發(fā)酵培養(yǎng)過程中對比其他菌株具有比較優(yōu)勢，按菌絲體生物量大小排序為CB0901> CB0903> CB0902。

圖1 不同發(fā)酵時間各菌株菌絲體生物量Fig.1 Mycelial biomass of each strain at different fermentation times數(shù)值為平均值±SD(n=3)，同一圖例中不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下圖同Values are the means ±SD(n=3),different lower case letters in the same legend indicate significant differences at P<0.05,the same below

2.2 不同發(fā)酵時間各菌株菌絲體胞內(nèi)多糖含量比較

各菌株不同發(fā)酵時間菌絲體胞內(nèi)多糖含量分析結(jié)果表明，在菌絲體發(fā)酵培養(yǎng)的不同時期胞內(nèi)多糖的變化趨勢不同，其中菌株CB0901、CB0902、CB0903、CB0906和L06隨著發(fā)酵時間的延長胞內(nèi)多糖含量呈不同程度地增加(圖2)，菌株CB0904和CB0905胞內(nèi)多糖含量隨發(fā)酵時間延長先增加后減少，而菌株L0912胞內(nèi)多糖含量隨著發(fā)酵時間延長明顯降低。培養(yǎng)至第7天時，菌株CB0903和CB0901的胞內(nèi)多糖含量高于10%，分別達到14.36%和10.40%，顯著高于其他菌株(6.43%～8.60%)。培養(yǎng)第14天時，菌株CB0903的胞內(nèi)多糖含量達到21.96%，菌株CB0901次之，為17.61%。各菌株胞內(nèi)多糖總量結(jié)果(表1)表明，各菌株在不同發(fā)酵時期胞內(nèi)多糖含量存在明顯差異，除菌株CB0905外，其他菌株均在第14天時多糖總量最高，其中以菌株CB0903為最優(yōu)，多糖含量在第14天時達到0.302 4 g，綜合菌絲體生物量及多糖產(chǎn)量，菌株CB0903具有較大優(yōu)勢。

圖2 不同發(fā)酵時間各菌株菌絲體胞內(nèi)多糖含量Fig.2 Intracellular polysaccharide content of mycelium of each strain at different fermentation times

2.3 不同發(fā)酵時間各菌株胞外多糖得率及多糖含量比較

對不同菌株不同發(fā)酵時間的發(fā)酵液進行胞外多糖的提取，并對其胞外多糖得率及多糖含量進行測定分析(表2)，結(jié)果表明不同菌株的胞外多糖得率存在較大差異，培養(yǎng)第7天時菌株CB0902、CB0903、L06胞外多糖得率顯著高于其他菌株，分別達到2.55、2.75、2.30 g/L；培養(yǎng)至第14 天時，菌株CB0903和L06多糖得率分別增加到3.30和3.00 g/L，而菌株CB0902多糖得率與培養(yǎng)第7天相差不大(2.52 g/L)。不同菌株在不同發(fā)酵時間多糖得率的變化趨勢也不相同，菌株CB0901、CB0903、CB0904和L06胞外多糖隨發(fā)酵時間延長呈增加趨勢；菌株CB0902、CB0905、CB0906、L0912多糖得率呈先增加再減少趨勢，培養(yǎng)第10 天時，多糖得率最高，這可能與不同發(fā)酵培養(yǎng)過程中生長代謝特性不同有關(guān)。

菌株發(fā)酵胞外多糖含量測定結(jié)果表明，不同菌株在不同發(fā)酵時期胞外多糖含量均較高，達到69%以上。通過胞外多糖得率及多糖含量計算胞外多糖產(chǎn)量可知(表1)，菌株CB0901、CB0903、CB0904胞外多糖隨著發(fā)酵時間延長多糖含量逐漸增加，發(fā)酵第14天時，多糖含量最高，其他菌株在發(fā)酵第10天時，多糖含量最高，比較各菌株胞外多糖總量可知，發(fā)酵第14天時，菌株CB0903多糖含量最高，達到0.283 9 g。計算胞內(nèi)和胞外多糖總量，發(fā)酵第14天時各菌株總多糖均最高，菌株CB0903多糖總量同樣最高，為0.586 3 g，其次為菌株CB0901，多糖總量為0.470 3 g，均顯著高于其他菌株。綜合菌絲體生物量、胞內(nèi)多糖含量和胞外多糖含量，菌株CB0903在發(fā)酵產(chǎn)多糖性能上均具有比較優(yōu)勢，為產(chǎn)香菇多糖優(yōu)勢菌株。

表1 不同發(fā)酵時間各菌株多糖總量

表2 不同發(fā)酵時間各菌株胞外多糖得率及多糖含量

3 討 論

香菇多糖是香菇最主要活性成分，在調(diào)節(jié)機體免疫力、抗腫瘤、抗病毒、抗炎、抗氧化等方面的作用顯著，這些作用與香菇多糖的化學結(jié)構(gòu)密切相關(guān)[5-7]。香菇品種不同，其發(fā)酵產(chǎn)多糖的性能不盡相同，喬艷明等[12]對秦巴地區(qū)主栽香菇品種采用6種培養(yǎng)基對菌絲生長狀況和胞外多糖產(chǎn)量進行研究，其中66#菌株表現(xiàn)最優(yōu)，胞外多糖產(chǎn)量為2.99 g/L；聶建軍等[9]采用單因素及正交試驗優(yōu)化香菇A05發(fā)酵條件，胞外多糖產(chǎn)量為2.92 g/L；李昕竺等[13]收集國內(nèi)87份香菇品種(菌株)以多糖含量及農(nóng)藝性狀為指標進行評價，篩選出新808、廣香2044為優(yōu)勢雜交親本，進而通過單孢雜交初步獲得農(nóng)藝性狀優(yōu)良、產(chǎn)量高、粗多糖含量高的兩個優(yōu)勢菌株——212號、3號。本研究采用常規(guī)香菇液體發(fā)酵培養(yǎng)基[10]對采自長白山的6株野生香菇菌株發(fā)酵產(chǎn)胞內(nèi)多糖和胞外多糖性能進行了評價，并以遼寧地區(qū)的栽培菌株L06和L0912作為對照菌株，篩選的菌株CB0903培養(yǎng)至第14天時，菌絲體生物量為13.77 g/L，胞內(nèi)多糖含量為0.302 4 g，胞外多糖得率及其含量分別為3.30 g/L和0.283 9 g，總多糖量為0.586 3 g，與規(guī)?；耘嗑闘06和L0912相比，在產(chǎn)多糖性能方面具有較大優(yōu)勢，為野生香菇菌株資源化利用提供一定參考。