馬佳文 李想 張翼宙

浙江中醫(yī)藥大學(xué) 杭州 310053

早發(fā)性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）是女性常見(jiàn)的內(nèi)分泌疾病，是指40歲之前出現(xiàn)卵巢功能減退，臨床表現(xiàn)為月經(jīng)稀發(fā)甚至閉經(jīng)，嚴(yán)重者影響育齡期女性的生育能力[1]。POI在一般人群中的發(fā)病率為1%[2]，由于女性工作與生活壓力的增大，近年來(lái)POI的發(fā)病率上升至3.7%[3]，上升趨勢(shì)明顯。POI如不及時(shí)治療，將發(fā)展為卵巢早衰（premature ovarian failure，POF），此時(shí)卵巢功能衰竭，將出現(xiàn)絕經(jīng)、生殖器官萎縮等絕經(jīng)期表現(xiàn)[4]，且無(wú)法逆轉(zhuǎn)。因此，POI的治療具有重要的臨床意義。

西醫(yī)臨床治療POI一般采用激素替代療法（hormone replacement therapy，HRT）[5]，但世界衛(wèi)生組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)公布的致癌物清單提示，雌激素-孕激素更年期治療（合用），以及雌激素-孕激素口服避孕藥（合用）均屬于1類(lèi)致癌物。由此可見(jiàn)，該療法存在不容忽視的致癌隱患。中醫(yī)學(xué)則從“天癸即元陽(yáng)”和“腎主生殖”等整體思路出發(fā)，多靶點(diǎn)協(xié)同治療改善卵巢功能。中醫(yī)婦科經(jīng)典著作《傅青主女科》記載了“年未老經(jīng)水?dāng)唷钡牟∽C，采用“必須散心之郁，而大補(bǔ)其腎水”[6]的益經(jīng)湯治療。本研究團(tuán)隊(duì)以《傅青主女科》益經(jīng)湯為基礎(chǔ)，化裁出寧心通郁滋腎方，研究發(fā)現(xiàn)該方對(duì)POI患者有較好的臨床療效，但其作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確，活性成分及關(guān)聯(lián)性未知，這在一定程度上限制了該方的推廣使用。本研究基于四級(jí)桿-靜電軌道阱（Q exactive orbitrap，Q-Orbitrap）高分辨液質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng)分析結(jié)果，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)寧心通郁滋腎方治療POI的活性成分和作用靶點(diǎn)進(jìn)行篩選，結(jié)合分子對(duì)接技術(shù)，為深入研究寧心通郁滋腎方的作用機(jī)制及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 儀器 Q Exactive高分辨質(zhì)譜儀和UltiMate 3000 RS均購(gòu)于賽默飛世爾科技有限公司；Direct-Q?5純水/超純水一體機(jī)系統(tǒng)購(gòu)于德國(guó)默克密理博公司；D3024R型高速微量冷凍離心機(jī)為北京大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司產(chǎn)品；MTV-100多管渦旋混合儀購(gòu)于杭州奧盛儀器有限公司。

1.2 試劑 中藥材包括熟地黃、龜板、黨參、山藥、酸棗仁、柴胡、菟絲子、當(dāng)歸、白芍、丹皮等，均購(gòu)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院（批號(hào)：20210701、20210827、210601、210701、20210801、210201、20210501、20210702、20210801、20210801）；色譜純甲醇購(gòu)于賽默飛世爾科技有限公司；色譜純甲酸購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 Q-Orbitrap高分辨液質(zhì)聯(lián)用分析

1.3.1.1 質(zhì)譜條件和色譜條件 （1）質(zhì)譜條件：Q Exactive高分辨質(zhì)譜儀以電噴霧電離源（electrospray ionization，ESI）為離子源，采用正負(fù)離子切換的掃描方式。檢測(cè)方式采用full mass/dd-MS2，設(shè)置分辨率為70 000（full mass）和17 500（dd-MS2），掃描范圍為150.0～2 000.0 m/z。電噴霧電壓為3.8 kV，毛細(xì)管溫度為300℃。碰撞氣采用高純氬氣；鞘氣采用氮?dú)?，體積流量為40 Arb；輔助氣采用氮?dú)?，溫度?50℃。數(shù)據(jù)采集時(shí)間為30 min。

（2）色譜條件：色譜柱為Welch XB-C18（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；以0.1%甲酸水溶液（A）-甲醇（B）為流動(dòng)相，色譜梯度為0～1 min，98%A；1～5 min，80%A；5～10 min，50%A；10～15 min，20%A；15～20 min，5%A；20～25 min，5%A；25～26 min，98%A；26～30 min，98%A；流速為0.30 mL/min；柱溫箱溫度為35℃；自動(dòng)進(jìn)樣器溫度為10℃；進(jìn)樣體積為5 μL。

1.3.1.2 上樣溶液的制備 寧心通郁滋腎方由熟地黃30 g、龜板12 g、黨參12 g、山藥15 g、酸棗仁12 g、柴胡6 g、菟絲子12 g、當(dāng)歸15 g、白芍12 g、牡丹皮9 g組成。加入8倍質(zhì)量的單蒸水，覆蓋藥面浸泡30 min，大火煮沸后，小火煎煮40 min，濾出藥液，第2次煎煮法與第1次相同，最后將兩次藥液混合進(jìn)行濃縮，獲得寧心通郁滋腎方水煎液。取水煎液200 μL，加入80%甲醇溶液1 mL，渦旋10 min。4℃下20 000r/min離心10 min，取上清液并過(guò)濾。

1.3.1.3 數(shù)據(jù)分析 Q-Orbitrap高分辨液質(zhì)聯(lián)用采集的數(shù)據(jù)通過(guò)Compound DiscovererTM2.1軟件完成初步整理后，在mzCloud數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索比對(duì)，構(gòu)建寧心益腎方水煎液成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)。

1.3.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

1.3.2.1 寧心通郁滋腎方活性成分篩選及潛在靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 通過(guò)Q-Orbitrap高分辨液質(zhì)聯(lián)用分析，構(gòu)建寧心益腎方水煎液成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(kù)，篩選出mzCloud數(shù)據(jù)庫(kù)匹配豐度（mzCloud best match）≥80的化合物。通過(guò)PubChem查找化合物的2D結(jié)構(gòu)，并導(dǎo)入Swiss ADME數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.swissadme.ch/）[7]。 初步限定化合物的腸胃吸收度為“High”，以此篩選具有較好生物利用度的活性化合物。再者，篩選五種類(lèi)藥性（Lipinski、Veber、Ghose、Egan、Muegge） 中有2個(gè)及以上為“Yes”的化合物，即為寧心通郁滋腎方中的活性成分。通過(guò)Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.swisstargetprediction.ch/）預(yù)測(cè)活性成分對(duì)應(yīng)的藥物靶點(diǎn)?？赡苄裕≒robability）＞0的靶點(diǎn)即為寧心通郁滋腎方的藥物靶點(diǎn)。

1.3.2.2 POI疾病靶點(diǎn)篩選 通過(guò)基因組注釋數(shù)據(jù)平臺(tái)（Genome Annotation Database Platform，GeneCard）（https://www.genecards.org/）和在線(xiàn)人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM） 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.omim.org/）得到與POI相關(guān)的疾病靶點(diǎn)，并與寧心通郁滋腎方的藥物靶點(diǎn)相匹配，獲取交集靶點(diǎn)。利用Cytoscape 3.8.2軟件構(gòu)建寧心通郁滋腎方活性成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.3.2.3 蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將藥物與疾病的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)（http://string-db.org/cgi/input.pl），物種選擇為“Homo Sapiens”，置信度設(shè)定為0.7，從而構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)。 將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件，借助Cyto NCA中的度中心性（degree centrality，DC）、中介中心性（betweenness centrality，BC）、接近中心性（closeness centrality，CC）、特征向量中心性（eigenvector centrality，EC）、網(wǎng)絡(luò)中心性 （network centrality，NC）、 局部邊連通性（local average connectivity，LAC）等6個(gè)參數(shù)篩選節(jié)點(diǎn)，選取網(wǎng)絡(luò)連接度≥2倍中值的節(jié)點(diǎn)為關(guān)鍵靶點(diǎn)[8]。將關(guān)鍵靶點(diǎn)與活性成分對(duì)應(yīng)的結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件，依據(jù)度值篩選出寧心通郁滋腎方治療POI的關(guān)鍵活性成分，構(gòu)建“關(guān)鍵靶點(diǎn)-關(guān)鍵活性成分”網(wǎng)絡(luò)。

1.3.2.4 基因本體（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書(shū) （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析 通過(guò)生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫(kù)（the Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery，DAVID）（https://david.ncifcrf.gov/）[9]，對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO分析和KEGG富集分析，獲取相關(guān)的生物學(xué)信息，從而分析寧心通郁滋腎方治療POI的可能作用機(jī)制。

1.3.3 分子對(duì)接 將1.3.2.3中篩選出關(guān)鍵靶點(diǎn)和關(guān)鍵活性成分依據(jù)度值降序排列。選取前8位的關(guān)鍵活性成分分別與該成分靶向的、且度值排序前10的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接，以此驗(yàn)證成分-靶點(diǎn)之間的相關(guān)性。 在UniPort（https://www.uniprot.org/）、RCSB蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)（RCSB Protein Data Bank，RCSB PDB）（https://www.rcsb.org/）、ZINC數(shù)據(jù)庫(kù)（http://zinc.docking.org/）[10]中獲取成分和靶點(diǎn)的三維結(jié)構(gòu)，利用SYBYL-X 2.1.1軟件中的Surflex-Dock進(jìn)行分子結(jié)構(gòu)對(duì)接，獲取對(duì)接分?jǐn)?shù)（total score）。

2 結(jié)果

2.1 Q-Orbitrap高分辨液質(zhì)聯(lián)用分析結(jié)果 本研究采用Q-Orbitrap高分辨液質(zhì)聯(lián)用進(jìn)行成分分析，中藥復(fù)方水煎液的總離子流圖見(jiàn)圖1。相關(guān)結(jié)果在mzCloud數(shù)據(jù)庫(kù)匹配到812個(gè)化合物，依據(jù)mzCloud數(shù)據(jù)庫(kù)匹配豐度降序排列。見(jiàn)表1。

表1 寧心通郁滋腎方水煎液成分表Tab.1 Ingredients of the water extract of Ningxin Tongyu Zishen Formula

2.2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果

2.2.1 寧心通郁滋腎方活性成分及其靶點(diǎn) 選取寧心通郁滋腎方水煎液中mzCloud數(shù)據(jù)庫(kù)匹配豐度≥80的化合物共113個(gè)，根據(jù)生物利用度及五種類(lèi)藥性的限定，最終確定符合標(biāo)準(zhǔn)的中藥活性成分71個(gè)。通過(guò)Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)共查詢(xún)到相關(guān)靶點(diǎn)7 185個(gè)，滿(mǎn)足條件靶點(diǎn)共3 734個(gè)，篩選去重后獲得藥物靶點(diǎn)共807個(gè)。

2.2.2 寧心通郁滋腎方活性成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖通過(guò)Gene Card和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)共獲得1 143個(gè)疾病靶點(diǎn)，將這些疾病靶點(diǎn)與藥物靶點(diǎn)相匹配，共獲得交集靶點(diǎn)176個(gè)。利用Cytoscape 3.8.2軟件繪制寧心通郁滋腎方活性成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。見(jiàn)圖2。

圖2 寧心通郁滋腎方活性成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 The active component-intersection target network of Ningxin Tongyu Zishen Formula

2.2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析 將176個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)，依據(jù)限定條件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，共得到176個(gè)節(jié)點(diǎn)，2 904條邊。見(jiàn)圖3A。將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件進(jìn)行篩選后，共獲得關(guān)鍵靶點(diǎn)39個(gè)，并依據(jù)度值進(jìn)行排序。見(jiàn)圖3B、C。這39個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)即寧心通郁滋腎方治療POI的關(guān)鍵靶點(diǎn)。將關(guān)鍵靶點(diǎn)與對(duì)應(yīng)化合物導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，共獲得55種關(guān)鍵活性成分。見(jiàn)圖4。依據(jù)度值降序，前8種關(guān)鍵活性成分認(rèn)定為主要關(guān)鍵活性成分，分別為槲皮素（Quercetin）、 異鼠李素（Isorhamnetin）、 瑟丹內(nèi)酯（Sedanolide）、咖啡酸（Caffeic acid）、柚皮素（Naringenin）、 羅漢松脂素（Matairesinol）、 阿魏酸（Ferulic acid）、棕櫚油酸（Palmitoleic acid）。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)及關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選圖Fig.3 PPI network and the key target screening map

圖4 關(guān)鍵靶點(diǎn)-關(guān)鍵活性成分網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 key target-key active component network

2.2.4 GO分析 將寧心通郁滋腎方治療POI的39個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO分析，以P＜0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)GO分析獲取的生物學(xué)過(guò)程（biological process，BP）、細(xì)胞組 分 （cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）的數(shù)據(jù)分別進(jìn)行升序排列，并選取其中排名前15位者繪制富集氣泡圖。見(jiàn)圖5。結(jié)果顯示，寧心通郁滋腎方主要通過(guò)細(xì)胞液（cytosol）、細(xì)胞質(zhì)（cytoplasm）、核質(zhì)（nucleoplasm）、蛋白復(fù)合體（protein complex）、細(xì)胞核（nucleus）等細(xì)胞組分參與凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控 （negative regulation of apoptotic process）、一氧化氮生物合成過(guò)程的正調(diào)控（positive regulation of nitric oxide biosynthetic process）、蛋白磷酸化正調(diào)控（positive regulation of protein phosphorylation）、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄正調(diào)控（positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter）、轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控-DNA模板（positive regulation of transcription-DNA-templated）等生物過(guò)程，發(fā)揮酶結(jié)合（enzyme binding）、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合（transcription factor binding）、相同蛋白結(jié)合（identical protein binding）、激酶活性（kinase activity）、蛋白結(jié)合（protein binding）等分子功能，起到改善卵巢功能，治療POI的作用。

圖5 寧心通郁滋腎方治療POI靶點(diǎn)GO分析Fig.5 GO analysis of targets of Ningxin Tongyu Zishen Formula in the treatment of POI

2.2.5 KEGG富集分析 通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)39個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG富集分析，得到具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）的通路共111條，以P值為依據(jù)，選取前20條進(jìn)行通路分類(lèi)匯總。見(jiàn)圖6。由圖中可知，39個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)主要富集在癌癥通路（pathways in cancer）、癌癥中的蛋白聚糖（proteoglycans in cancer）、乙型肝炎（hepatitis B）、前列腺癌（prostate cancer）、缺氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）、甲型流感（influenza A）、胰腺癌（pancreatic cancer）、催乳激素信號(hào)通路（prolactin signaling pathway）、黏附斑（focal adhesion）、叉頭蛋白O（forkhead box O，F(xiàn)oxO）、甲狀腺激素（thyroid hormone）、磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B（phosphatidylinositide 3-kinases-protein kinase B，PI3K-Akt）等信號(hào)通路。依據(jù)此20條信號(hào)通路的分子相互作用、反應(yīng)和關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，可分為人類(lèi)疾?。╤uman diseases）、生物系統(tǒng)（organismal systems）、環(huán)境信息處理 （environmental information processing）、細(xì)胞進(jìn)程（cellular processes）共四大類(lèi)。

圖6 寧心通郁滋腎方治療POI靶點(diǎn)KEGG富集通路分析Fig.6 KEGG pathway analysis of targets of Ningxin Tongyu Zishen Formula in the treatment of POI

2.3 分子對(duì)接結(jié)果 采用Surflex-Dock分子對(duì)接程序，將2.2.3中所述主要關(guān)鍵活性成分分別與靶向相關(guān)且度值排序前10的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接，從而獲得對(duì)接分?jǐn)?shù)（total score）。見(jiàn)圖7。對(duì)接分?jǐn)?shù)代表配體與靶蛋白受體結(jié)合的穩(wěn)定性，分?jǐn)?shù)越高則穩(wěn)定性越好。當(dāng)對(duì)接分?jǐn)?shù)＞5分時(shí)，提示分子與靶點(diǎn)蛋白的結(jié)合度較好。槲皮素是寧心通郁滋腎方的主要活性成分，其與對(duì)應(yīng)關(guān)鍵靶點(diǎn)的對(duì)接分?jǐn)?shù)均＞5，說(shuō)明均有較好的結(jié)合穩(wěn)定性，分子對(duì)接圖見(jiàn)圖8。

圖7 關(guān)鍵成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)對(duì)接結(jié)果熱圖Fig.7 Heat map of docking results between key components and key targets

圖8 槲皮素與關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對(duì)接圖Fig.8 Molecular docking of quercetin with key targets

3 討論

POI所表現(xiàn)出的卵巢功能衰退是一個(gè)漸進(jìn)的過(guò)程，因此在疾病早期就應(yīng)給予高度重視。2016年歐洲人類(lèi)生殖與胚胎學(xué)會(huì)明確了POI的定義，并強(qiáng)調(diào)要采取必要的干預(yù)，以延緩病情發(fā)展至卵巢功能衰退的終末階段，即POF[2]。由于POI的病因復(fù)雜，發(fā)病機(jī)制尚不明確，故尚未研發(fā)出治療該病的特效藥物。本研究團(tuán)隊(duì)自擬寧心通郁滋腎方，用于臨床治療POI，取得了良好的療效，但該方劑的作用機(jī)制尚不明確。由于中藥復(fù)方成分復(fù)雜，所以探明寧心通郁滋腎方治療POI的作用機(jī)制存在一定的困難。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)具有整體性與系統(tǒng)性的特點(diǎn)，能夠從分子層面探究中醫(yī)藥治療疾病多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的作用機(jī)制，近年來(lái)已被廣泛應(yīng)用于中藥復(fù)方的研究[11]。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)合分子對(duì)接的方式，為探究寧心通郁滋腎方治療POI的作用機(jī)制提供思路。

Q-Orbitrap高分辨液質(zhì)聯(lián)用分析結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果表明，寧心通郁滋腎方治療POI的活性成分包括槲皮素、異鼠李素、瑟丹內(nèi)酯、咖啡酸、柚皮素等。依據(jù)分子對(duì)接結(jié)果，其中主要活性成分槲皮素與磷酸肌醇3激酶調(diào)控亞基1（phosphoinositide-3-kinase regulatory subunit 1，PIK3R1）、 表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、蛋白激酶B1（protein kinase B1，AKT1）、類(lèi)固醇受體共激活因子（steroid receptor coactivator，SRC）等關(guān)鍵靶點(diǎn)的對(duì)接均較穩(wěn)定，可能在POI的治療中起到關(guān)鍵作用。槲皮素是一種天然黃酮類(lèi)化合物，具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌等多種藥理活性[12]。研究表明，槲皮素能夠通過(guò)抑制PI3K-AKT途徑，下調(diào)AKT的表達(dá)，從而抑制原始卵泡的過(guò)度激活，防止卵泡池的提前耗竭[13]。雖然目前尚未證實(shí)槲皮素能夠通過(guò)PIK3R1、EGFR、SRC影響卵巢功能，但已有研究表明，槲皮素能夠?qū)IK3R1、EGFR、SRC的表達(dá)產(chǎn)生影響，例如槲皮素能夠與PIK3R1結(jié)合并抑制其活性，從而緩解慢性腎功能衰竭大鼠的腎纖維化[14]；也能夠通過(guò)下調(diào)EGFR的表達(dá)，抑制人乳腺癌細(xì)胞株T47D的增殖，促進(jìn)其凋亡[15]；槲皮素作為毛茛甲醇提取物中的主要活性成分，還能夠靶向作用于SRC，發(fā)揮抗炎活性[16]。槲皮素是否通過(guò)PIK3R1、EGFR、SRC對(duì)卵巢組織發(fā)揮同樣作用，值得進(jìn)一步驗(yàn)證。

PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析提示，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription，STAT3）、SRC、AKT1、90kDa 熱休克蛋白αA19（heat shock protein 90kDa αA1，HSP90AA1）、促分裂原活化蛋白激酶3（mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3）、EGFR等39個(gè)靶點(diǎn)可能是寧心通郁滋腎方治療POI的關(guān)鍵靶點(diǎn)。其中，STAT3的度值最高，可能在治療中起到非常關(guān)鍵的作用。STAT3是一種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)錄因子，能夠參與免疫反應(yīng)、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和影響細(xì)胞存活。研究表明，在豬卵巢顆粒細(xì)胞中上調(diào)STAT3的表達(dá)能夠抑制細(xì)胞凋亡，而促進(jìn)細(xì)胞增殖[17]；STAT3還參與炎癥反應(yīng)，當(dāng)發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí)，STAT3的磷酸化水平上升[17]。以上結(jié)果提示，上調(diào)STAT3表達(dá)或抑制STAT3的磷酸化水平也許有助于卵巢功能的改善。

對(duì)39個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG富集分析后發(fā)現(xiàn)，它們可能參與調(diào)控癌癥通路、癌癥中的蛋白聚糖、乙型肝炎、前列腺癌、HIF-1、甲型流感、胰腺癌、催乳激素信號(hào)、黏附斑、FoxO等信號(hào)通路，以及凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控、一氧化氮生物合成過(guò)程的正調(diào)控、蛋白磷酸化正調(diào)控等生物過(guò)程，發(fā)揮酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、相同蛋白結(jié)合等分子功能，從而治療POI。FoxO是重要的調(diào)節(jié)因子，參與細(xì)胞代謝、細(xì)胞增殖、DNA修復(fù)、自噬、氧化應(yīng)激等多種細(xì)胞內(nèi)過(guò)程[18]。該因子在細(xì)胞中廣泛表達(dá)，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中FoxO家族共有4個(gè)成員：FoxO1、FoxO3、FoxO4和FoxO6。其中，F(xiàn)oxO1作為活性氧（reactive oxygen species，ROS）的感受器，參與不同水平的氧化應(yīng)激調(diào)控[19]。FoxO1表達(dá)的上調(diào)會(huì)導(dǎo)致卵巢顆粒細(xì)胞的凋亡[20]。此外，它還能夠通過(guò)激活腫瘤蛋白53誘導(dǎo)的核蛋白1-腫瘤蛋白p53-細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶抑制劑1A（tumor protein 53-induced nuclear protein 2-tumor protein p53-cyclin-dependent kinase inhibitor 1A，TP53INP1-p53-CDKN1A）通路，從而誘導(dǎo)卵巢顆粒細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞周期阻滯[21]。而FoxO3a作為沉默信息調(diào)節(jié)因子1（sirtuin 1，SIRT1）的氧化還原靶分子，能夠參與卵巢的氧化應(yīng)激調(diào)控[22]。

現(xiàn)代女性面對(duì)來(lái)自生活、工作、社會(huì)等各方面的壓力，身體處于慢性應(yīng)激狀態(tài)，這也許是導(dǎo)致卵巢功能提前衰退的重要因素[23]。持續(xù)的慢性應(yīng)激影響會(huì)誘使卵巢內(nèi)ROS水平上升，氧化與抗氧化平衡失調(diào)，引起氧化應(yīng)激反應(yīng)[24]。氧化應(yīng)激會(huì)促使卵巢顆粒細(xì)胞內(nèi)炎性因子的釋放，促發(fā)炎癥反應(yīng)[25]；同時(shí)也通過(guò)破壞細(xì)胞成分，或激活凋亡相關(guān)信號(hào)通路，導(dǎo)致卵巢顆粒細(xì)胞凋亡[26]。由于卵巢功能的發(fā)揮依賴(lài)于卵巢顆粒細(xì)胞的正常生長(zhǎng)分化[5]，因此緩解氧化應(yīng)激所致的一系列反應(yīng)或許是治療POI的關(guān)鍵。

綜上所述，本研究基于Q-Orbitrap高分辨液質(zhì)聯(lián)用分析，以及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接技術(shù)，發(fā)現(xiàn)寧心通郁滋腎方可能通過(guò)槲皮素、異鼠李素、瑟丹內(nèi)酯、咖啡酸、柚皮素等關(guān)鍵活性成分，作用于對(duì)應(yīng)的關(guān)鍵靶點(diǎn)，通過(guò)緩解氧化應(yīng)激、修復(fù)氧化損傷、抑制卵巢顆粒細(xì)胞凋亡、促進(jìn)卵巢顆粒細(xì)胞增殖等機(jī)制改善卵巢功能，延緩卵巢的衰退，從而治療POI。本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究寧心通郁滋腎方治療POI的作用機(jī)制提供了方向與思路。