蔡文杰，史宇星，晁 蕾，葛欣竺，劉智慧，于園儀，王莎莎，王世貴，唐 斌

(杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 311121)

應(yīng)用捕食性瓢蟲等天敵昆蟲防治有害生物已有近120年的歷史.作為捕食性瓢蟲中的一員，異色瓢蟲(Harmoniaaxyridis)對蚜蟲、葉螨、介殼蟲等重要害蟲具有很強(qiáng)的捕食能力[1]，在其引入地及原產(chǎn)地都發(fā)揮了重要的控害作用[2].天敵昆蟲的生殖力研究主要是通過飼養(yǎng)提高天敵昆蟲的產(chǎn)卵能力[3-4]，在合適的時間內(nèi)獲得充足的天敵昆蟲.目前開發(fā)的人工飼料可保證異色瓢蟲正常生長發(fā)育，但對提高成蟲的生殖力效果欠佳，多代后生殖力下降[5-6]，不利于物種的擴(kuò)繁[7].因此，尋找生殖力促進(jìn)因子、改進(jìn)人工飼料配方的研究顯得尤為重要.

昆蟲的生長發(fā)育和生殖離不開能量供給.丙酮酸通過乙酰輔酶A和三羧酸循環(huán)實(shí)現(xiàn)體內(nèi)糖、脂肪和氨基酸間的互相轉(zhuǎn)化.丙酮酸激酶(pyruvate kinase，PYK)是糖酵解途徑關(guān)鍵限速酶，在埃及伊蚊(Aedesaegypti)和棕櫚象甲(Rhynchophoruspalmarum)胚胎發(fā)生過程中，均發(fā)現(xiàn)PYK活性升高[8-9]；且有研究發(fā)現(xiàn)胚胎肌肉發(fā)育需要PYK[10].另有研究[11]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)PYK基因表達(dá)下降后，褐飛虱(Nilaparvatalugens)的生殖力顯著降低.因此，推斷昆蟲胚胎發(fā)育和生殖力受丙酮酸激酶活性的影響.RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)已被廣泛用于基因功能、調(diào)控等研究[12-13].本研究以異色瓢蟲為研究對象，通過RNA干擾技術(shù)降低異色瓢蟲靶標(biāo)基因PYK1-1的表達(dá)水平，測定異色瓢蟲生殖力相關(guān)指標(biāo)，探究丙酮酸激酶基因在調(diào)控異色瓢蟲生殖力中的作用.

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

供試異色瓢蟲為杭州師范大學(xué)動物適應(yīng)與進(jìn)化重點(diǎn)實(shí)驗室飼養(yǎng)種群，蟲源為2020年5—7月采集于杭州師范大學(xué)校園及附近田間.將蚜蟲(Megourajaponica)放置在蠶豆苗上飼養(yǎng)，再將接有蚜蟲的蠶豆苗放入有異色瓢蟲的養(yǎng)蟲籠中.溫度(25±1) ℃，相對濕度(70±5)%，光周期為14 L∶10 D.

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 dsRNA的合成

采用Trizol法提取異色瓢蟲總RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳和NanoDropTM2000微量核酸測定儀檢測RNA的質(zhì)量和濃度.采用PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(Takara，日本)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗，獲得cDNA的第一條鏈.運(yùn)用Primer 5軟件設(shè)計丙酮酸激酶基因PYK1-1(GenBank：MZ327965)的dsRNA特異性引物(表1)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增.采用MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit膠回收試劑盒(Takara，日本)對目標(biāo)片段進(jìn)行回收，對回收產(chǎn)物進(jìn)行T克隆.使用帶T7啟動子(5’-GGATCCTAATACGACTCACTATAGG-3’)的引物進(jìn)行交叉PCR反應(yīng)后，使用T7 RiboMAXTMExpress RNAi System雙鏈RNA合成試劑盒(Promega，美國)合成dsPYK1-1[14].采用同樣的方法合成綠色熒光蛋白(GFP)基因的dsRNA.

表1 實(shí)時熒光定量PCR所用引物Tab.1 Primers used for qRT-PCR

1.2.2 異色瓢蟲的顯微注射

1.2.3 實(shí)時熒光定量PCR(qRT-PCR)

1.2.4 生殖力指標(biāo)測定

取未注射組(CK)、注射dsGFP組及注射dsPYK1-1組各10只成蟲(雌∶雄=1∶1)分別放入飼養(yǎng)盒(280 mL)中，每天飼喂蚜蟲.每個處理重復(fù)5次.記錄每組第1次產(chǎn)卵的日期，產(chǎn)卵前期為羽化到第1次產(chǎn)卵的間隔期.從第1次產(chǎn)卵開始，每天記錄產(chǎn)卵量，共統(tǒng)計30 d的產(chǎn)卵量，同時記錄每批卵的孵化率.另外，收集注射后第3、5、7天的雌蟲，在解剖鏡下解剖卵巢并拍照記錄，每個時間點(diǎn)解剖4只及以上雌蟲.

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Microsoft Office Excel 2010、SPSS 20.0軟件整理和分析實(shí)驗數(shù)據(jù).采用單因素方差中Tukey法分析異色瓢蟲產(chǎn)卵前期、30 d總產(chǎn)卵量、孵化率在不同處理組之間的差異性，采用t檢驗分析異色瓢蟲基因表達(dá)水平在不同處理組之間的差異性，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果

注：不同小寫字母表示組別間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；下同.

2.1 RNA干擾PYK1-1基因后對異色瓢蟲產(chǎn)卵前期的影響

將dsPYK1-1注射進(jìn)成蟲體內(nèi)后，在48 h和72 h均檢測到PYK1-1基因表達(dá)水平下調(diào)[12]，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，表明RNA干擾有效.dsPYK1-1組異色瓢蟲雌蟲產(chǎn)卵前期(9.60±0.81) d長于dsGFP組(7.20±0.58) d，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1.

2.2 RNA干擾PYK1-1基因后對異色瓢蟲雌蟲產(chǎn)卵量的影響

CK組單只雌蟲30 d總產(chǎn)卵量最多，其次是dsGFP組，dsPYK1-1組產(chǎn)卵量最少，3組間30 d總產(chǎn)卵量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，詳見圖2.dsPYK1-1組前10 d單雌總產(chǎn)卵量[(130.25±22.30)枚]低于CK組[(194.50±12.13)枚]，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05).

2.3 RNA干擾PYK1-1基因后對孵化率的影響

3組雌蟲所產(chǎn)卵的孵化率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖3.CK組孵化率最高(69.76±4.46)%，其次為dsGFP組(64.79±2.79)%，dsPYK1-1組孵化率最低(62.20±4.63)%.

圖2 不同處理異色瓢蟲單只雌蟲產(chǎn)卵量Fig.2 Egg production per female of Harmonia axyridis in different treatments圖3 不同處理成蟲所產(chǎn)卵的孵化率Fig.3 Hatching rate of eggs laid by adults of different treatments

2.4 RNA干擾后對異色瓢蟲雌蟲Vg和VgR基因表達(dá)的影響

注射dsPYK1-1到異色瓢蟲后，第3天Vg1的相對表達(dá)水平高于dsGFP組，第5天和第7天Vg1的相對表達(dá)量降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖4A).異色瓢蟲Vg2的表達(dá)水平在第5天和第7天均低于dsGFP組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖4B).在3個檢測時間點(diǎn)中，僅在注射后第5天，異色瓢蟲VgR的表達(dá)水平低于dsGFP組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖4C).

ns表示P>0.05；*P<0.05；**P<0.01.

2.5 RNA干擾后對異色瓢蟲卵巢形態(tài)的影響

異色瓢蟲dsPYK1-1組雌蟲卵巢在第3、5、7天均比另外2組雌蟲的卵巢發(fā)育滯后(圖5).第5天時，CK組雌蟲卵巢可見黃色成熟卵粒；dsGFP組雌蟲卵巢雖未見黃色卵粒，但卵巢大小與CK組相似；dsPYK1-1組的雌蟲卵巢較小，說明卵巢發(fā)育較為遲緩.第7天時，CK組和dsGFP組雌蟲卵巢中的黃色卵粒清晰可見，卵粒比較飽滿；dsPYK1-1組初步形成黃色卵粒.結(jié)果表明dsPYK1-1表達(dá)被抑制后，異色瓢蟲的卵巢發(fā)育被延遲.

圖5 不同處理雌蟲卵巢形態(tài)Fig.5 Ovarian morphology of female adults in different treatments

3 討論

生殖是昆蟲發(fā)育過程中的重要環(huán)節(jié)，對后代的繁衍起著至關(guān)重要的作用.研究[8]報道，葡萄糖代謝與埃及伊蚊胚胎發(fā)育密切相關(guān).本研究前期結(jié)果同樣顯示，在異色瓢蟲人工飼料中添加葡萄糖、海藻糖等糖類物質(zhì)能夠促進(jìn)異色瓢蟲卵巢發(fā)育、提高其產(chǎn)卵量[17]；PYK1-1表達(dá)被抑制后，異色瓢蟲葡萄糖含量先下降后上升[14]，表明PYK1-1能夠調(diào)控葡萄糖代謝.那么PYK1-1是否能夠通過海藻糖代謝來影響卵巢和發(fā)育呢？本研究結(jié)果顯示，當(dāng)異色瓢蟲PYK1-1表達(dá)受抑制后，雌蟲產(chǎn)卵前期延長、前期產(chǎn)卵量下降、卵巢發(fā)育遲緩、Vg和VgR基因表達(dá)量受影響，結(jié)果與褐飛虱注射dsPYK后飛虱產(chǎn)卵量下降相吻合[11,18].RNA干擾褐飛虱糖酵解限速酶己糖激酶基因，褐飛虱產(chǎn)卵量下降[18]；褐飛虱糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白6(NlST6)介導(dǎo)中腸腔到血淋巴的糖轉(zhuǎn)運(yùn)[19]，研究[20]發(fā)現(xiàn),飼喂dsNlst6可導(dǎo)致褐飛虱產(chǎn)卵前期明顯延長、產(chǎn)卵期縮短、產(chǎn)卵量減少.上述研究結(jié)果與本研究相符，推測可以通過調(diào)控糖代謝或者能量代謝相關(guān)基因控制生殖力，從而探尋更為合適的靶標(biāo)基因防控害蟲，或者借助這些靶標(biāo)基因調(diào)控生殖力，改進(jìn)人工飼料配方，提升天敵昆蟲的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)能力.

昆蟲體內(nèi)的糖、脂肪和蛋白質(zhì)是產(chǎn)卵量的物質(zhì)基礎(chǔ)，在卵黃原蛋白的合成中起著重要作用[18].昆蟲糖代謝水平與生殖能力之間存在相關(guān)性，本研究結(jié)果顯示，雌蟲在第21天至第30天的產(chǎn)卵量明顯提高，所產(chǎn)卵的孵化率在3個處理組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義.3組的30 d總產(chǎn)卵量差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可能與采用RNAi注射法短時間抑制PYK1-1基因表達(dá)有關(guān).對于通過長期飼喂抑制PYK1-1基因表達(dá)對異色瓢蟲產(chǎn)卵量的影響，后續(xù)還需進(jìn)一步研究.RNA干擾效應(yīng)可以穩(wěn)定地遺傳給子代，存在時間上的有效性[21].Fire等[12]發(fā)現(xiàn)將小干擾RNA注射到線蟲中能把RNA干擾的效應(yīng)傳給第2代，但不能傳給第3代，推測后續(xù)目的基因PYK1-1的抑制效果可能會減弱，瓢蟲的生理狀態(tài)會逐漸恢復(fù)，后續(xù)還需進(jìn)一步研究.

Vg是一類在卵巢外合成的蛋白質(zhì)，是卵黃的主要成分[22]，在胚胎發(fā)生過程中起著重要的營養(yǎng)作用[23].通常將Vg作為檢測昆蟲生殖力的分子標(biāo)記[24-26].影響Vg的表達(dá)主要有4種信號通路，分別是胰島素通路、雷帕霉素作用靶標(biāo)(target of rapamycin，TOR)信號途徑、蛻皮激素和保幼激素途徑、與能量相關(guān)的途徑[27].本研究結(jié)果顯示，RNAi抑制PYK1-1的表達(dá)后，Vg1和Vg2的表達(dá)水平受影響.Ge等[20]發(fā)現(xiàn)飼喂dsNlst6會導(dǎo)致褐飛虱雌蟲Vg表達(dá)水平降低，與本研究結(jié)果類似.VgR對卵母細(xì)胞的Vg攝取至關(guān)重要，并在昆蟲生殖力中起重要作用.當(dāng)斜紋夜蛾和褐飛虱VgR的表達(dá)水平被敲低后，卵巢中Vg蛋白水平降低，血淋巴中Vg蛋白積累，卵巢發(fā)育停滯，產(chǎn)卵失敗[28-29].褐飛虱丙酮酸激酶與己糖激酶基因沉默導(dǎo)致卵巢蛋白水平下降，且卵巢發(fā)育受阻[18,30].由此看來，瓢蟲PYK1-1的表達(dá)被干擾后，間接或直接降低Vg和VgR的表達(dá)，進(jìn)而對卵細(xì)胞和卵巢發(fā)育產(chǎn)生影響.

目前，對七星瓢蟲和異色瓢蟲人工飼料配方、生殖等方面進(jìn)行了大量的研究[31-32].本研究前期給異色瓢蟲飼喂添加適量海藻糖或者葡萄糖的人工飼料，發(fā)現(xiàn)雌蟲的生殖力比飼喂普通飼料有所提高[17].昆蟲卵巢發(fā)育和卵細(xì)胞成熟需要碳水化合物代謝，本研究結(jié)果表明昆蟲的糖酵解與生殖力之間存在聯(lián)系，后續(xù)可深入探究昆蟲能量代謝與生殖力之間的聯(lián)系.