武家頌，崔欣茹，張景榮，徐 菲，陳 媛，周 潔，何丹寧， 顧芝瑕，吳玉環(huán)，俞志明

(1. 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 311121； 2. 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院植物RNA信號傳導(dǎo)研究中心，浙江 杭州 311121)

根毛是由根表皮單細(xì)胞發(fā)育而成的管狀凸起，其極性生長的特點(diǎn)是研究細(xì)胞分化的理想模型[1].根毛是根的重要組成部分，當(dāng)植物遇到缺水或者養(yǎng)分不足(尤其是缺磷)的情況下，往往會(huì)通過增加根毛的長度和密度來緩解不利因素[2].根毛使植物更好地錨定在土壤中，并為土壤微生物提供與植物互作的場所[3].

模式植物擬南芥(Arabidopsisthaliana)具有基因組小、生育期短、遺傳材料多等優(yōu)點(diǎn)，是根毛發(fā)育調(diào)控機(jī)制研究最清楚的植物.現(xiàn)有的根毛發(fā)育調(diào)控模型表明，擬南芥根毛發(fā)育是由根毛細(xì)胞的位置和轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物的側(cè)向運(yùn)輸共同決定的[4].該模型涉及眾多轉(zhuǎn)錄因子家族，其中堿性-螺旋-環(huán)-螺旋(basic helix-loop-helix, bHLH)在其中起重要作用.這些bHLH基因在根毛發(fā)育過程中起正向或負(fù)向調(diào)控作用.目前關(guān)于bHLH家族功能研究進(jìn)展的報(bào)道主要集中在逆境脅迫、生長發(fā)育及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[5-6]，針對bHLH參與根毛發(fā)育調(diào)控的報(bào)道較少[7].為了更好地追蹤最新研究進(jìn)展，本文對近期相關(guān)研究成果進(jìn)行歸納總結(jié)，闡述bHLH在擬南芥根毛發(fā)育調(diào)控中的作用.

1 根毛的發(fā)育

擬南芥根尖成熟區(qū)從內(nèi)到外依次為木質(zhì)部、韌皮部、中柱鞘、內(nèi)皮層、皮層及表皮細(xì)胞[8](圖1).根毛主要分布在成熟區(qū)，其發(fā)育過程分為4個(gè)階段：根毛細(xì)胞命運(yùn)決定、起始、伸長(尖端生長)和成熟[2].

圖1 擬南芥根成熟區(qū)橫切面[2,9]Fig.1 Cross section of the Arabidopsis root maturation region[2,9]

根毛細(xì)胞命運(yùn)決定主要有3種模式：隨機(jī)模式、小細(xì)胞模式和聚類排列模式[10].在隨機(jī)模式中，任何位置的表皮細(xì)胞都能產(chǎn)生根毛，代表植物有竹子和蘆葦?shù)葐巫尤~植物、絕大多數(shù)雙子葉植物[11]；在小細(xì)胞模式中，根表皮細(xì)胞不對稱分裂產(chǎn)生的較小細(xì)胞發(fā)育為根毛，代表植物有水鱉[11]；在聚類排列模式中，根毛細(xì)胞與非根毛細(xì)胞交替分布，根毛細(xì)胞呈隊(duì)列式排列.

與兩個(gè)皮層細(xì)胞接觸的表皮細(xì)胞形成根毛，稱之為H細(xì)胞(root hair cell)；只與一個(gè)皮層細(xì)胞接觸的表皮細(xì)胞不能形成根毛，稱之為N細(xì)胞(non-root hair cell).這種類型的根毛細(xì)胞在十字花科等植物中廣泛存在，代表植物有擬南芥[11].

根毛起始是指根毛母細(xì)胞在靠近根尖端形成凸起的過程[12].Rho GTP酶極性化地定位在即將凸起的細(xì)胞質(zhì)膜上，決定根毛起始的部位[13]，跨高爾基網(wǎng)絡(luò)定位蛋白YIP4a及YIP4b對Rho GTP酶的激活及在質(zhì)膜上的積累起關(guān)鍵作用[14].同時(shí)，根毛起始區(qū)域會(huì)產(chǎn)生高Ca2+濃度區(qū)，高Ca2+濃度能一直持續(xù)到根毛伸長階段[13].根毛起始區(qū)呈酸性(pH<4.5)，酸性條件能夠?yàn)楦患诟蛊鹛幍腅XPANSIN等細(xì)胞壁作用蛋白發(fā)揮功能提供最佳環(huán)境，細(xì)胞壁膨松，根毛凸起[15].另外，F(xiàn)-actin大量富集在凸起部位，也被認(rèn)為是根毛起始形成的關(guān)鍵因素[16].

根毛伸長是指從起始部位向外繼續(xù)延伸，形成管狀細(xì)胞結(jié)構(gòu)的過程.在根毛伸長過程中，新質(zhì)膜和細(xì)胞壁合成所需的原料等都堆積在根毛尖端，而此時(shí)根毛尖端伸長區(qū)內(nèi)的Ca2+濃度是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)濃度的10倍左右，當(dāng)Ca2+濃度差異消失時(shí)，根毛伸長隨即停止[17].肌動(dòng)蛋白在肌動(dòng)蛋白解聚因子和Profilin協(xié)同作用下，動(dòng)態(tài)地完成重組裝[16].而在根毛起始中起關(guān)鍵作用的酸性條件，似乎在根毛的伸長階段并不是特別重要，因此根毛起始和伸長被認(rèn)為是完全不同的2個(gè)階段[15].

根毛成熟是指根毛伸長到一定長度后不再生長的階段.細(xì)胞質(zhì)和液泡聚集在根毛圓蓋形頂端處，Rop GTP酶[13]和鈣離子濃度降至基線水平[18]，鈣離子通道蛋白隨后消失[19].至此，根毛細(xì)胞成熟.

2 與擬南芥根毛發(fā)育相關(guān)的bHLH轉(zhuǎn)錄因子

bHLH是植物第二大轉(zhuǎn)錄因子家族，可以形成同源或異源二聚體[20].通過共同基序預(yù)測擬南芥有147個(gè)成員，歸為21個(gè)亞家族[21]；還有報(bào)道[22]稱有133個(gè)成員，其中113個(gè)能被檢測到.與動(dòng)物bHLH相比，植物bHLH是由B類祖先進(jìn)化而來，擬南芥bHLH分成12個(gè)亞家族.整合以上二者的數(shù)據(jù)并進(jìn)一步分析后認(rèn)為，擬南芥有162個(gè)成員[23].利用十字花科18種代表植物替換早先的9種代表植物，再進(jìn)行序列比對分析后發(fā)現(xiàn)，擬南芥中含有225個(gè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子[24].

bHLH由兩個(gè)不同的功能域組成：氨基端(N端)為約15個(gè)堿性氨基酸殘基組成的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(basic region)，識別并結(jié)合DNA核心基序E-box (5’-CANNTG-3’) (圖2A)和G-box (5’-CACGTG-3’) (圖2B)，典型的堿性區(qū)內(nèi)含有極保守的HER元件(His5th-Glu9th-Arg13rd)[22]；羧基端(C端)是由疏水氨基酸殘基組成的HLH區(qū)域(helix-loop-helix)，是形成同源或異源二聚體的親和結(jié)構(gòu)域.其中，兩個(gè)α-螺旋被一個(gè)可變長度的環(huán)狀結(jié)構(gòu)分隔[21].

在植物中，bHLH在根[25]、莖[26]、葉[27]、花[28]、果實(shí)[29]、種子[30]的生長與發(fā)育，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[31]和逆境脅迫[32]等調(diào)控過程中均具有重要的生物學(xué)功能.截至目前，已發(fā)現(xiàn)有11個(gè)AtbHLH基因在根毛發(fā)育過程中起重要作用，見表1.本文將對這11個(gè)成員在根毛發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中所扮演的角色進(jìn)行詳細(xì)闡述.

表1 擬南芥中參與根毛發(fā)育的bHLHsTab.1 Members of bHLH family involve in root hair development in Arabidopsis

2.1 AtbHLH1(GL3), AtbHLH2(EGL3), AtbHLH12(MYC1)

與野生型相比，純合突變體gl3-1或egl3-1根下半部分的根毛無顯著差異，但根上半部分的根毛明顯增多，而純合雙突變體gl3-1egl3-1不論在根的下半部分還是上半部分的根毛都增多.35S:GL3及35S:EGL3轉(zhuǎn)基因植株只產(chǎn)生極少量的根毛.由此可見，GL3與EGL3基因功能是冗余的，且無論根毛細(xì)胞還是非根毛細(xì)胞，都對根毛發(fā)生起抑制作用.由甲苯胺藍(lán)染色結(jié)合GUS報(bào)告基因的結(jié)果可以得知，GL3/EGL3基因在根表皮細(xì)胞發(fā)育早期表達(dá)[34].Atmyc1表現(xiàn)為短根毛表型[36]，處于WER、CPC基因下游，但不受GL2的調(diào)控[33].EGL3、GL3、MYC1都屬于Ⅲf亞家族[33].

2.2 AtbHLH66 (AtLRL1), AtbHLH69 (AtLRL2), AtbHLH82 (AtLRL3)

百脈根突變體Ljrhl1-1及Ljrhl1-2的表型為無根毛或極少根毛，是由LjRHL1基因(ROOTHAIRLESS1)突變導(dǎo)致.RHL1屬于bHLH家族，與擬南芥AT2G24260(AtLRL1,AtbHLH66)、AT4G30980(AtLRL2,AtbHLH69)、AT5G58010(AtLRL3,AtbHLH82)處在進(jìn)化樹的同一個(gè)分支(Ⅺ亞家族)，這3個(gè)同源基因都能完全回復(fù)百脈根根毛突變表型[35].Atlrl1-2和Atlrl2-2突變體根毛與野生型無明顯差異，但Atlrl1-2、Atlrl2-2-/+或Atlrl1-2-/+、Atlrl2-2雙突變均表現(xiàn)出短根毛的表型[35].純合突變體Atlrl3-1根毛與野生型相比無明顯差異，Atlrl1-2-/+、Atlrl3-1及Atlrl2-1Atlrl3-1雙突變體表現(xiàn)為短根毛.相對而言，Atlrl2-1Atlrl3-1的根毛突變表型更為明顯.三突變體Atlrl1-2-/+、Atlrl2-1、Atlrl3-1的根毛極少[35].因此認(rèn)為AtLRL1、AtLRL2、AtLRL3功能冗余，且對根毛發(fā)育起正調(diào)控作用.AtbHLH66、AtbHLH69基因突變后，會(huì)出現(xiàn)根毛分叉表型[33].

2.3 AtbHLH83(RHD6), AtbHLH86(RSL1)

擬南芥不同生態(tài)型(Col-0,Ler,WS)的rhd6突變體根毛少且短[39].rhd6在根毛凸起部位表現(xiàn)出明顯的基部位移，還能觀察到同一個(gè)細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生多根毛的現(xiàn)象，并占有一定的比例.因此，RHD6與根毛極性發(fā)育及根毛起始關(guān)系密切[40].RSL1與RHD6同屬bHLH的Ⅷc亞家族[22]，存在功能冗余現(xiàn)象.與野生型相比，Atrsl1-1突變體根毛不論長度和密度的差別均不明顯；Atrhd6-3Atrsl1-1純合雙突變體幾乎無根毛.AtRSL1只能部分回復(fù)Atrhd6-3Atrsl1-1雙突變的根毛表型[39].

2.4 AtbHLH54(RSL4), AtbHLH84, AtbHLH85(RSL2)

rsl4-1純合突變體根毛變少變短，RNAi植株是短根毛且少根毛，35S啟動(dòng)子過表達(dá)RSL4后，根毛明顯伸長.與野生型的根毛細(xì)胞核比較，過表達(dá)RSL4后的根毛細(xì)胞核并未發(fā)現(xiàn)明顯變大，說明RSL4是通過延長工作時(shí)間達(dá)到伸長根毛的效果，對根毛伸長起正調(diào)控作用[38].RSL2與RSL4在bHLH結(jié)構(gòu)域上的相似度為89%，而兩個(gè)蛋白質(zhì)之間的相似度為40%.rsl2-1表現(xiàn)為少且短根毛表型.rsl2-1rsl4-1雙突變在體視鏡下為無根毛表型，但冷凍掃描電鏡顯示，與周圍的非根毛細(xì)胞相比，根毛細(xì)胞存在明顯凸起，說明RSL2、RSL4基因只在根毛伸長過程中起作用[38].分別用RSL2和RSL4基因回復(fù)rsl2-1rsl4-1突變體，RSL2只能部分回復(fù)少根毛及短根毛表型，RSL4可以在較大程度上回復(fù)根毛突變表型，但是與野生型相比仍存在差異[38].RSL4、AtbHLH84、AtbHLH85都屬于Ⅷc亞家族[22]，其中Atbhlh84、Atbhlh85突變體根毛會(huì)出現(xiàn)分叉表型[33].

3 擬南芥bHLH轉(zhuǎn)錄因子在根毛發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的作用

根毛細(xì)胞命運(yùn)決定過程涉及側(cè)向運(yùn)輸和位置決定兩種根毛發(fā)育模型，即轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞間的側(cè)向運(yùn)輸和位置決定基因SCM對根毛的命運(yùn)起調(diào)控作用[4].截至目前，已知在根毛發(fā)育調(diào)控中起重要作用的基因如表2所示.

表2 根毛發(fā)育調(diào)控的重要基因Tab.2 Key genes of root hair development regulation

3.1 非根毛細(xì)胞發(fā)育

只與一個(gè)皮層細(xì)胞接觸的表皮細(xì)胞發(fā)育成非根毛細(xì)胞.在非根毛細(xì)胞 (N細(xì)胞) 中，GL3/EGL3蛋白能與TTG1及WER結(jié)合，形成WER-GL3/EGL3-TTG1三元復(fù)合物[36].WER-GL3/EGL3-TTG1復(fù)合物正調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子GL2的表達(dá)[4,46-47](GL2是同源域/亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子蛋白[48]，是根毛發(fā)育的負(fù)調(diào)控因子[43,48])，使N細(xì)胞最終成為非根毛細(xì)胞(圖3).

GL2通過兩條途徑抑制根毛生成：①GL2直接靶向作用于RHD6(AtbHLH83)、RSL1(AtbHLH86)、RSL2(AtbHLH85)、LRL1(AtbHLH66)、LRL2(AtbHLH69)基因啟動(dòng)子，抑制這5個(gè)基因的表達(dá)，從而抑制根毛的產(chǎn)生[38](圖3)； ②GL2正調(diào)控C2H2型鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子AtZP1的表達(dá)，而AtZP1直接抑制RHD6(AtbHLH83)、RSL4(AtbHLH54)和RSL2(AtbHLH85)的表達(dá)[49](圖3).WER-GL3/EGL3-TTG1復(fù)合物還可誘導(dǎo)CPC表達(dá)[4]，CPC蛋白可以從非根毛細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)到鄰近的根毛細(xì)胞[50-51].與CPC蛋

當(dāng)擬南芥根表皮細(xì)胞同時(shí)與兩個(gè)皮層細(xì)胞接觸時(shí)，將發(fā)育成根毛細(xì)胞(粉色背景)，而只與一個(gè)皮層細(xì)胞接觸的表皮細(xì)胞則成為非根毛細(xì)胞(淡藍(lán)色背景).

白的移動(dòng)方向相反，GL3/EGL3蛋白從根毛細(xì)胞移動(dòng)至鄰近的非根毛細(xì)胞[52].

3.2 根毛細(xì)胞發(fā)育

當(dāng)根表皮細(xì)胞與兩個(gè)皮層細(xì)胞接觸時(shí)，特異表達(dá)位置信號感受器蛋白SCM[44]，使該細(xì)胞發(fā)育成根毛細(xì)胞.SCM抑制WER基因的表達(dá)，導(dǎo)致WER在與CPC蛋白競爭結(jié)合GL3/EGL3-TTG1過程中處于劣勢[52]，而從非根毛細(xì)胞移動(dòng)至根毛細(xì)胞的CPC蛋白則處于競爭優(yōu)勢地位，最終大量形成CPC-GL3/EGL3-TTG1三元復(fù)合物.這個(gè)三元復(fù)合物抑制根毛負(fù)調(diào)控基因GL2的表達(dá)[53-54]，使GL2抑制的下游根毛正調(diào)控基因得到表達(dá)，最終生成根毛[36,55](圖3).

4 展望

4.1 bHLH在其他根毛誘導(dǎo)條件下的功能

根毛發(fā)育受內(nèi)部基因控制外，還受到激素、缺素等外界因素的影響，比如：缺磷條件下，生長素從根尖運(yùn)輸至分生區(qū)，調(diào)控RSL2及RSL4基因表達(dá)，增加根毛密度，誘導(dǎo)根毛伸長[55]；與RSL4啟動(dòng)子直接結(jié)合的MYB30是根毛發(fā)育負(fù)調(diào)控因子，乙烯信號通路主效轉(zhuǎn)錄因子EIN3(ETHYLENE INSENSITIVE3)是正調(diào)控因子，MYB30與EIN3之間具有互作關(guān)系，缺磷會(huì)誘導(dǎo)EIN3與MYB30對抗性競爭驅(qū)動(dòng)RSL4表達(dá)，從而誘導(dǎo)根毛伸長[56].與缺磷條件誘導(dǎo)根毛發(fā)育的機(jī)制研究相比，其他條件誘導(dǎo)因素的研究還相對比較薄弱[50-52,57].這些誘導(dǎo)因素中是否還存在新的根毛調(diào)控機(jī)制，以及bHLH在其中的功能還有待深入研究.

4.2 與根毛發(fā)育相關(guān)新bHLH基因的挖掘

擬南芥bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族成員眾多、功能各異.除了文中提到的11個(gè)成員外，尋找更多與根毛發(fā)育調(diào)控直接相關(guān)的bHLH將是未來需要解決的問題.Bruex等[33]從擬南芥17個(gè)根細(xì)胞命運(yùn)突變體出發(fā)，通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)挖掘到與根毛發(fā)育相關(guān)的208個(gè)核心基因,其中AT3G26744(AtbHLH116)還未被實(shí)驗(yàn)證實(shí).Zhang等[58]基于微流控及Barcoding技術(shù)開發(fā)的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序(single-cell RNA sequencing, scRNA-Seq)技術(shù)[59]，發(fā)現(xiàn)AT5G15160(AtbHLH134)在表皮細(xì)胞(18#細(xì)胞簇)及干細(xì)胞龕(19#細(xì)胞簇)特異表達(dá)，預(yù)示其可能在表皮細(xì)胞命運(yùn)決定中起作用[58].單細(xì)胞測序技術(shù)更精準(zhǔn)地再現(xiàn)了不同類型根細(xì)胞內(nèi)bHLH基因表達(dá)的差異，以及在根毛/非根毛細(xì)胞內(nèi)差異表達(dá)的基因，這些信息將為理解bHLH在根毛發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的作用提供線索[58,60].

隨著越來越多植物基因組測序工作的完成，bHLH家族增添了更多的新成員：水稻(Oryzasativa)有211個(gè)bHLH成員[24]，已知OsbHLH115與根毛伸長直接相關(guān)[61]；玉米(ZeamaysL.)有208[62]～308個(gè)[24]bHLH成員；馬尾松(Pinusmassoniana)有88個(gè)bHLH成員[63]；芒果(MangiferaindicaL.)中有212個(gè)bHLH成員[64]；歐洲葡萄黑比諾(Vitisviniferacv. Pinot Noir)中預(yù)測有113個(gè)bHLH成員[65].這些新基因?qū)閎HLH調(diào)控根毛發(fā)育研究提供新的思路.