張生杰，王 麗，田志梅，曹雪芹，龐文娟

武威市藥品檢驗(yàn)檢測中心，甘肅 武威 733000

白芍為毛茛科植物芍藥Paeonia lactifloraPall.的干燥根，具有平肝止痛，養(yǎng)血調(diào)經(jīng)，斂陰止汗功效［1］。白芍含有多種生物活性物質(zhì)，主要有苷類、萜類、黃酮類、鞣質(zhì)類、揮發(fā)油類、酚類和糖類等化合物，含白芍中成藥處方600 個，涵蓋主治疾病165 種、主治證候159 種［2］，白芍藥材的市場需求量較大，導(dǎo)致目前多個地方開始引種芍藥，關(guān)于所引種栽培白芍藥材質(zhì)量如何，與其主產(chǎn)地白芍藥材質(zhì)量是否一致尚未見研究報道，因此建立一種簡單、快速的白芍多指標(biāo)質(zhì)量控制方法尤為重要。

一測多評法（quantitative analysis of multi-components by single-marker，QAMS）由王智民課題組首次提出［3］，通過建立樣品中某一有效、廉價、易得的典型成分與樣品其余成分間的相對校正因子以計(jì)算樣品中其他成分的量。王智民等［4］建立的《一測多評質(zhì)量評價技術(shù)指南》，被認(rèn)為是適合中藥特點(diǎn)的多指標(biāo)質(zhì)量控制與評價模式，目前已廣泛應(yīng)用于藥品質(zhì)量控制領(lǐng)域［5-8］，一測多評法是中國藥典2015 版中重點(diǎn)推廣的技術(shù)之一，也是未來中藥多組分同步檢測的發(fā)展方向之一［9］，同時“一測多評”也將為中藥檢測方法的“綠色化”提供更有效的技術(shù)手段和途徑［10］。因此，本研究主要以甘肅河西地區(qū)引種白芍和主產(chǎn)區(qū)（安徽亳州、浙江磐安、四川中江、山東菏澤）白芍為研究對象，采用高效液相色譜法建立QAMS 分析方法，同時測定沒食子酸、兒茶素、芍藥苷內(nèi)酯、芍藥苷、1，2，3，4，6-五沒食子?；咸烟?、苯甲酰芍藥苷6 種成分的含量，以芍藥苷為內(nèi)參物，建立芍藥苷與其他5 種成分的相對校正因子，同時考察多個因素的耐用性及系統(tǒng)適用性，并測定不同產(chǎn)地白芍飲片，其結(jié)果與外標(biāo)法測定結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)，以驗(yàn)證所建QAMS方法的準(zhǔn)確性和可行性。

1 材料

1.1 儀器LC-20AD 高效液相色譜配有DAD 檢測器（日本島津公司）；Agilent1260 與Agilent1100高效液相色譜（美國安捷倫公司）；MS105DU 十萬分之一電子分析天平（梅特勒托利多）；UA10MFD超聲波清洗器（德國wiggens）。

1.2 試藥共收集25 批白芍樣品，其中包括來自4 個主產(chǎn)地的20 批白芍樣品，5 個甘肅河西地區(qū)引種的白芍樣品。對照品沒食子酸（批號：110831-201906，含量以91.5%計(jì)）、兒茶素（批號：110877-201604，含量以99.2%計(jì)）、芍藥苷內(nèi)酯（批號：190027-201902，含量以98.0%計(jì)）、芍藥苷（批號：110736-201943，含量以95.1%計(jì)）購于中國食品藥品檢定研究院；1，2，3，4，6-五沒食子?；咸烟牵ㄅ枺?30031-201909，含量以98.0%計(jì)）、苯甲酰芍藥苷（批號：02003-201902，含量以98.0%計(jì)）購于北京更新生物科技有限公司；乙腈（色譜純，默克Merck 公司、批號：10945730812），其他試劑均為分析純。

統(tǒng)計(jì)研究乳腺腫塊患者中，良性腫塊血流顯示率66.7%（16/24），Vmax 為（11.40±6.35）cm/s，RI 為（0.55±0.11）；惡性腫塊血流顯示率為95.7%（44/46），Vmax 為（16.25±10.25）cm/s，RI 為（0.66±0.12），對比兩組腫塊血流顯示率、Vmax、RI差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2 方法與結(jié)果

2.1 混合對照品溶液制備取對照品沒食子酸、兒茶素、芍藥苷內(nèi)酯、芍藥苷、1，2，3，4，6-五沒食子?；咸烟?、苯甲酰芍藥苷對照品適量，用甲醇配成含沒食子酸105.31mg/L、兒茶素115.43mg/L、芍藥苷內(nèi)酯403.12 mg/L、芍藥苷997.35 mg/L、1，2，3，4，6-五沒食子?；咸烟?03.54 mg/L、苯甲酰芍藥苷107.35 mg/L的混合對照品溶液。

為了能夠讓農(nóng)場主自行存儲農(nóng)作物，讓農(nóng)產(chǎn)品的價格維持在一個較為穩(wěn)定的狀態(tài)，美國政府推出了儲備補(bǔ)貼制度。該制度主要指農(nóng)場主通過與農(nóng)產(chǎn)品信貸公司簽訂儲備合同，在農(nóng)產(chǎn)品存儲期間，不僅可以獲得高于無追索權(quán)貸款率的貸款，而且能夠獲得一定的儲備補(bǔ)貼。但是當(dāng)農(nóng)產(chǎn)品被儲存之后，農(nóng)場主不能私自隨意進(jìn)行出售，必須在市場價格達(dá)到設(shè)定的釋放價格數(shù)值時才能夠?qū)⑵涫鄢鯷6]。如果達(dá)到釋放價格后農(nóng)場主不愿意出售，那么政府將取消相應(yīng)的利息補(bǔ)貼和儲備補(bǔ)貼；如果作物價格已經(jīng)達(dá)到制定的收回貸款價格時，此時相關(guān)農(nóng)作物貸款人必須歸還所貸款項(xiàng)。

2.6 真菌對抗菌藥物的敏感性 培養(yǎng)出白色念珠菌292株，占分離細(xì)菌株的11.50%。對氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、兩性霉素B、5-氟胞嘧啶均敏感。

精密取混合對照品儲備液，稀釋5、10、15、20、25 倍分別進(jìn)樣10 μL，測定沒食子酸、兒茶素、芍藥苷內(nèi)酯、芍藥苷、1，2，3，4，6-五沒食子?；咸烟恰⒈郊柞Ｉ炙庈盏姆迕娣e，以芍藥苷為內(nèi)參物，分別計(jì)算沒食子酸（A）、兒茶素（B）、芍藥苷內(nèi)酯（C）、1，2，3，4，6-五沒食子酰基葡萄糖（D）、苯甲酰芍藥苷（E）相對于芍藥苷（S）的相對校正因子fA/S、fB/S、fC/S、fD/S、fE/S。各成分相對校正因子的相對誤差（RSD）分別為0.33%、0.20%、0.32%、0.12%、0.12%，均小于0.5%，表明方法有效。見表2。

2.3 色譜條件色譜柱：Shim-pack GIST-HP C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）。流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脫：0～10.0 min，95%～90% B；10.0～20.0 min，90%～80% B；20.0～30.0 min，80%～70%B；30.0～35.0 min，70%B；35.0～37.0 min，70%～50%B；37.0～50.0 min，50%B。檢測波長：232 nm，體積流量：1.0 mL/min，柱溫：30℃，進(jìn)樣量：20 μL。

2.4.3 精密度試驗(yàn) 稱取甘肅省金昌朱王堡引種栽培白芍樣品約1.0g，按照“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，以“2.3”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，測定峰面積。沒食子酸、兒茶素、芍藥苷內(nèi)酯、芍藥苷、1，2，3，4，6-五沒食子?；咸烟?、苯甲酰芍藥苷峰面積的RSD 分別為0.69%、0.29%、0.70%、0.16%、0.36%、0.81%，表明儀器精密度良好。

我國出口企業(yè)勞動力成本和稅收高于周邊一些發(fā)展中國家，人民幣升值對我國出口企業(yè)的影響較大，導(dǎo)致小微出口企業(yè)的融資成本居高不下。應(yīng)加快完善支持外貿(mào)發(fā)展的財稅金融政策，降低出口企業(yè)的融資成本，為降低出口商品的成本助力，使中國制造在國際市場上更有價格競爭力。

2.6.5 不同pH 值對校正因子的影響 取混合對照品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件調(diào)整流動相磷酸水體積分?jǐn)?shù)為0.01%、0.05%、0.10%，其他色譜條件不變，記錄峰面積，按“2.5”項(xiàng)下方法計(jì)算相對校正因子，結(jié)果RSD值均小于2.0%，表明各成分相對校正因子在磷酸水體積分?jǐn)?shù)0.01%～0.10%范圍內(nèi)耐受性良好。見表7。

圖1 色譜圖

2.4.2 線性關(guān)系考察 精密取混合對照品溶液，依次用甲醇溶液稀釋20、10、5、2倍，并與對照品溶液組成一系列混合對照品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測定，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。見表1。

表1 6個化合物峰面積與濃度線性關(guān)系

2.4 HPLC方法學(xué)考察

就餐區(qū)域、購物區(qū)域以及商品展示區(qū)是目前商場的主要組成，個性化針對的是展示區(qū)設(shè)計(jì)進(jìn)行的創(chuàng)新。該區(qū)域的構(gòu)造、燈光色彩等可保留原來設(shè)計(jì)的精華，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行相應(yīng)優(yōu)化，使展覽的商品更加個性，增加其賣點(diǎn)。每個陳列架的設(shè)計(jì)要和商品相得益彰，最大程度地凸顯商品特色。例如在服裝展示區(qū)，男裝和女裝在展架設(shè)計(jì)上存在明顯差異，前者需要設(shè)計(jì)高端、奢華的衣櫥，并在燈光的烘托下，將服裝精細(xì)的做工、優(yōu)質(zhì)的面料展現(xiàn)在消費(fèi)者面前。后者設(shè)計(jì)時需要相對寬敞的空間，將款式不同的衣服陳列在相應(yīng)區(qū)域，給消費(fèi)者造成視覺沖擊，使其感覺服裝款式新穎多樣。

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取甘肅省金昌朱王堡引種栽培白芍樣品6 份，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，測定各成分含量。結(jié)果沒食子酸、兒茶素、芍藥苷內(nèi)酯、芍藥苷、1，2，3，4，6-五沒食子?；咸烟?、苯甲酰芍藥苷含量平均值分別為0.83、0.82、4.65、28.66、4.26、0.88 mg/g，RSD 分別為1.47%、1.27%、1.02%、0.85%、0.74%、0.92%，表示該方法重復(fù)性較好。

2.6.1 不同儀器對相對校正因子的影響 取混合對照品溶液，用Shim-pack GIST-HP C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）考察LC-20AT 型、Agilent1260型、Agilent1100型3種高效液相色譜系統(tǒng)，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件，各進(jìn)樣5、10、15、20、25 μL，記錄峰面積，按“2.5”項(xiàng)下方法計(jì)算相對校正因子，結(jié)果RSD值均小于2.0%，表明不同儀器型號對相對校正因子影響不明顯。見表3。

2.5 相對校正因子的建立校正因子計(jì)算。在一定線性范圍內(nèi)，某一組分的量與檢測器響應(yīng)值成正比，在進(jìn)行多指標(biāo)評價時，以樣品中某一代表組分為內(nèi)標(biāo)物，建立該組分與其他組分之間的校正因子（relative correction factor，RCF），通過相對校正因子計(jì)算其他組分的含量［4］：

式中fsi為內(nèi)標(biāo)物s 與組分i 之間的校正因子（f），AS為內(nèi)參物S 峰面積，CS為內(nèi)參物濃度，Ai為某待測成分i峰面積，Ci為某待測成分i濃度。

2.2 供試品溶液制備取白芍細(xì)粉1.0 g，精密稱定，置150 mL 三角瓶中，加入70%乙醇約50 mL，稱定重量，超聲（300 W，50 kHz）處理30 min，放冷，再稱定重量，70%乙醇補(bǔ)足，搖勻，0.22 μm 微孔濾膜濾過，即得。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 稱取甘肅省金昌朱王堡引種栽培白芍樣品約1.0g，按照“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于2、4、8、10、12、24 h按“2.3”項(xiàng)下色譜條件測定峰面積。結(jié)果供試品溶液在24 h 內(nèi)色譜峰面積無明顯變化，沒食子酸、兒茶素、芍藥苷內(nèi)酯、芍藥苷、1，2，3，4，6-五沒食子酰基葡萄糖、苯甲酰芍藥苷的RSD 分別為0.59%、0.26%、0.11%、0.25%、0.97%、0.27%，表明供試品溶液在制備后24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表2 相對校正因子

2.6 相對校正因子的耐用性

閱讀和寫作是“辯證互補(bǔ)的關(guān)系”，在平時的語文教學(xué)中，我們要充分利用好教材這個“例子”，把閱讀教學(xué)和寫作教學(xué)有機(jī)結(jié)合起來，相互促進(jìn)，共同提高。在學(xué)習(xí)人教版語文教材必修1第二單元的古代記敘散文時，我們既要積累相關(guān)的文言基礎(chǔ)知識、學(xué)習(xí)古代記敘散文的閱讀方法，也要注意學(xué)習(xí)這些課文在寫人記事等方面的寫作技巧，通過滲透、整合等方式把寫作教學(xué)和古文閱讀教學(xué)有機(jī)地結(jié)合起來，相互促進(jìn)，提高學(xué)生的閱讀和寫作水平。

2.4.6 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的白芍樣品（杭州-1）9 份，每份約1.0 g，精密稱定，分成3組分別精密加入混合對照品儲備液3、5、7 mL，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3”項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣，記錄色譜峰峰面積，沒食子酸、兒茶素、芍藥苷內(nèi)酯、芍藥苷、1，2，3，4，6-五沒食子?；咸烟恰⒈郊柞Ｉ炙庈盏钠骄訕踊厥章史謩e為99.0% 、99.4%、98.6%、99.4%、99.3%、99.0%，RSD分別為1.08%、0.80%、1.27%、1.24%、0.90%、0.76%。

表3 不同儀器測定的相對校正因子（n=3）

2.6.2 不同色譜柱對相對校正因子的影響 取混合對照品溶液，采用LC-20AT 型高效液相色譜系統(tǒng)，考察色譜柱CAPCELL PAK-C18MGⅡ（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）、Shim-pack GIST-HP C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）、Agilent XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）、Phenomenex C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）4 種不同品牌和型號色譜柱，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣5、10、20 μL，記錄峰面積，按“2.5”項(xiàng)下方法計(jì)算相對校正因子，結(jié)果RSD 值均小于2.0%，表明不同色譜柱對各相對校正因子無明顯影響。見表4。

表4 不同色譜柱測定的相對校正因子（n=3）

2.6.3 不同柱溫對相對校正因子的影響 取混合對照品溶液，采用LC-20AT型高效液相色譜系統(tǒng)和Shim-pack GIST-HP C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）色譜柱，考察色譜柱不同柱溫25、30、35℃對相對校正因子的影響，結(jié)果RSD值均小于2.0%，表明相對校因子在柱溫25～35℃的耐受性良好。見表5。

國內(nèi)齒圈熱處理主要應(yīng)用高頻感應(yīng)淬火工藝，但是因感應(yīng)器的結(jié)構(gòu)會帶來不同的淬硬效果。通常齒圈上下兩端面的淬硬層深度相同，即兩端面的淬硬層硬度也相同，硬度高了就會產(chǎn)生齒心部脆易斷裂的缺陷，大大降低齒的耐用性。在齒圈的實(shí)際工作時，僅僅與嚙合齒輪接近的端面受較大的沖擊，而與飛輪連接貼合的端面應(yīng)該保持較軟具有緩沖的功用最佳。這樣歸結(jié)起來就是齒面硬、齒心部相對較軟才是最佳的齒圈淬火狀態(tài)，倒梯形結(jié)構(gòu)的淬火感應(yīng)器可以達(dá)到這個“外硬內(nèi)軟”的理想狀態(tài)。

表5 不同柱溫下測定的相對校正因子（n=3）

2.6.4 不同流速對相對校正因子的影響 取混合對照品溶液，采用LC-20AT 型高效液相色譜系統(tǒng)和Shim-pack GIST-HP C18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）色譜柱，考察色譜柱不同流速0.8、1.0、1.2 mL/min 對相對校正因子的影響，結(jié)果RSD 值均小于2.0%，表明（1.0±0.2）mL/min 的流速波動對相對校正因子無顯著影響。見表6。

表6 不同流速下測定的相對校正因子（n=3）

2.4.1 專屬性考察 取沒食子酸、兒茶素、芍藥苷內(nèi)酯、芍藥苷、1，2，3，4，6-五沒食子酰基葡萄糖及苯甲酰芍藥苷對照品溶液、混合對照品溶液、供試品溶液，按照“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，分別采集6 種成分的光譜圖，通過DAD 檢測器采集3D 譜圖，比對樣品中各測定成分與相應(yīng)對照品的光譜圖，結(jié)果供試品中各待測成分光譜圖相似度均＞0.99，色譜峰分離度均＞1.5，其他雜質(zhì)峰對待測成分均無干擾。見圖1。

表7 不同pH下測定的相對校正因子（n=3）

2.6.6 不同實(shí)驗(yàn)人員對校正因子的影響 取混合對照品溶液，3 位不同實(shí)驗(yàn)員按“2.3”項(xiàng)下色譜條件測定，記錄峰面積，按“2.5”項(xiàng)下方法計(jì)算相對校正因子，結(jié)果RSD值均小于2.0%，表明不同實(shí)驗(yàn)人員對相對校正因子影響不大。見表8。

表8 不同實(shí)驗(yàn)員測定的相對校正因子（n=3）

2.6.7 相對校正因子的確定 將上述各實(shí)驗(yàn)獲得的fsi值取平均值，最終確定沒食子酸（A）、兒茶素（B）、芍藥苷內(nèi)酯（C）、1，2，3，4，6-五沒食子?；咸烟牵―）、苯甲酰芍藥苷（E）相對于芍藥苷（S）的相對校正因子分別為fA/S=0.699、fB/S=0.548、fC/S=1.470、fD/S=0.709、fE/S=0.656，RSD 分 別 為0.38%、0.38%、0.28%、0.62%、0.16%。

2.7 待測成分色譜峰定位采用待測組分（a）與內(nèi)標(biāo)物（s）的相對保留時間比值（ra/s=ta/ts）或保留時間差（ΔtR-AS=ta-ts）進(jìn)行定位［4］。分別考察相對保留時間比值和保留時間差2 種參數(shù)在不同品牌儀器、不同規(guī)格色譜柱中的重現(xiàn)性，結(jié)果采用相對保留時間進(jìn)行峰的定位較保留時間差的定位更可靠。見表9。

表9 不同儀器不同色譜柱下測得的相對保留值和保留時間差

2.8 QAMS 法與外標(biāo)法測定結(jié)果的比較取四大主產(chǎn)和甘肅栽培白芍樣品25 批，按“2.2”項(xiàng)下制備樣品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件分別測定樣品中沒食子酸、兒茶素、芍藥苷內(nèi)酯、芍藥苷、1，2，3，4，6-五沒食子?；咸烟?、苯甲酰芍藥苷峰面積，分別采用外標(biāo)法（external standard method，ESM）和QAMS法計(jì)算各組分含量，結(jié)果見表10。

2014年，山東將堅(jiān)持開源與節(jié)流并重、城鄉(xiāng)保障與生態(tài)保護(hù)并行、興利與除害統(tǒng)籌、公益化支撐與市場化運(yùn)作結(jié)合、改革創(chuàng)新與夯實(shí)基礎(chǔ)并舉，增強(qiáng)水利發(fā)展的內(nèi)在活力。

表10 ESM法和QAMS法測得的白芍6種成分含量（n=25） mg/g

3 討論

3.1 提取方法的確定在前期試驗(yàn)方法研究和文獻(xiàn)查閱的基礎(chǔ)上［11-14］，本試驗(yàn)分別考察了不同濃度乙醇提取溶劑及超聲、回流不同提取方法，發(fā)現(xiàn)采用70%乙醇50 mL，超聲（300 W，50 kHz）處理30 min，能夠兼顧上述6種成分，得到最優(yōu)提取率，雜質(zhì)干擾峰少，且方法簡單快捷。

3.2 待測化合物的確定色譜峰的準(zhǔn)確定位是QASM 應(yīng)用的關(guān)鍵。本研究通過考察保留時間比值和保留時間差2 種參數(shù)在不同品牌儀器、不同規(guī)格色譜柱中的重現(xiàn)性。保留時間差的波動較為明顯，RSD 在1.62%～5.10%之間，相對保留時間波動較?。≧SD＜2.0%），為保證色譜峰的準(zhǔn)確定位，結(jié)合DAD 檢測器采集到3D 譜圖，比對樣品中各測定成分與相應(yīng)對照品的光譜圖，以驗(yàn)證待測成分定位，操作快捷且能夠準(zhǔn)確定位待測化合物，為以后研究多成分分析方法的建立提供了新途徑。

3.3 內(nèi)標(biāo)化合物的選擇白芍化學(xué)成分主要為揮發(fā)油類、單萜類、三萜類及黃酮類化合物等，其質(zhì)量控制一般以主要成分芍藥苷指示成分［15-17］。芍藥苷在白芍中含量達(dá)20～30 mg/g，且芍藥苷化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，容易取得，故選其作為內(nèi)參物，選用芍藥苷定量分析時沒食子酸、兒茶素、芍藥苷內(nèi)酯、1，2，3，4，6-五沒食子?；咸烟?、苯甲酰芍藥苷的相對校正因子穩(wěn)定，定量準(zhǔn)確RSD小于2.0%。

3.4 相對校正因子的確定本實(shí)驗(yàn)在儀器、色譜柱、柱溫、流速、pH 值及實(shí)驗(yàn)人員較小變動時，考察了其對相對校正因子的影響程度，結(jié)果各待測成分的相對校正因子在測定條件變化小的情況下影響較小，RSD 值均＜1%，按照《一測多評法建立的技術(shù)指南》中要求在綜合考慮影響相對校正因子的各種影響因素，在RSD小于5%的情況下，取其平均值作為相對校正因子［4］，因此，選擇各測定條件下的相對校正因子的均值作為最終“一測多評”方法的相對校正因子，通過對不同來源25 批次白芍樣品的測定對“一測多評”法和外標(biāo)法所得結(jié)果進(jìn)行配對t檢驗(yàn)分析，結(jié)果顯示兩種方法所得白芍藥材6 種含量不存在顯著差異（P＞0.01），且沒食子酸、兒茶素、苯甲酰芍藥苷含量相關(guān)性為1，表明“一測多評”法用于白芍中6 種成分的含量測定具有良好的準(zhǔn)確性，該法操作簡便快速、準(zhǔn)確可靠，可以應(yīng)用到白芍藥材及配方顆粒的含量測定以達(dá)到綠色、環(huán)保、節(jié)約成本，多指標(biāo)質(zhì)量控制的目的。