李鈴睿 宋俊龍 劉漢卿 孔德光 陳創(chuàng)

甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid cancer，PTC)分化良好，長期隨訪發(fā)現(xiàn)，高達25%的PTC出現(xiàn)復(fù)發(fā)[1]。BRAF、RAS、RET和NTRK等基因促進PTC形成信號通路的激活。TERT和Tp53與PTC的去分化和轉(zhuǎn)移相關(guān)[2]。二代測序(NGS)以低成本對多種基因快速檢測，同時篩選出基因變異的位點并進行定量分析。NGS技術(shù)可使更多的生物標志物運用到甲狀腺癌(thyroid cancer，TC)的診斷、靶向治療及預(yù)后評估中。本研究對34例PTC病人石蠟標本進行NGS檢測，分析BRAF突變頻率與PTC臨床病理特征的關(guān)系。

對象與方法

一、對象

2015年3月～2021年5月我院手術(shù)治療的PTC病人34例。26例行甲狀腺腺葉切除+淋巴結(jié)清掃術(shù)，8例為甲狀腺全切術(shù)后基于雙風(fēng)險評估的促甲狀腺激素抑制目標予以治療后復(fù)發(fā)[3]，且一次手術(shù)確診為PTC，收集病人的基本資料及手術(shù)標本。腫瘤分期根據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會第8版術(shù)后TNM分期系統(tǒng)確定[4]。無病生存期(disease-free survival，DFS)定義為從手術(shù)開始到第一次復(fù)發(fā)確診的時間。納入標準：術(shù)后病理檢查診斷為PTC；臨床病理資料完整。排除標準：未檢測到基因變異；合并其他惡性腫瘤。本研究已獲得我院倫理委員會批準，病人均知情同意。

二、方法

1.文庫制備和測序:雜交捕獲測序法制備文庫，利用NGS技術(shù)，檢測70個TC相關(guān)基因的突變、插入、缺失或融合(表1)。首先，QIAamp DNA FFPE Tissue Kit提取TC福爾馬林固定石蠟包埋樣本的基因組DNA，Covaris M220超聲波破碎儀對DNA進行片段化處理，然后進行末端修復(fù)、加“A”尾、連接測序接頭和添加雙端唯一標簽。純化后的文庫通過探針靶向捕獲，并用PCR對捕獲的文庫擴增富集，Qubit熒光定量儀測定濃度，同時使用Agilent 2100生物分析儀分析文庫片段分布。制備好的質(zhì)量合格文庫在NovaSeq 6000測序平臺上進行150bp雙端測序。

表1 甲狀腺癌70基因變異檢測列表

2.生物信息學(xué)分析:Trimmomatic(v0.38)先去除雙端測序reads的3＇ 端和5＇ 端的殘留接頭序列，接著VarScan(v2.3.9)程序?qū)NV/InDel進行分析，最后ANNOVAR和VEP進行基因變異注釋。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié)果

1.34例PTC病人的臨床病理特點:34例PTC中有76.47%病人進行了原發(fā)灶的檢測，平均年齡(35.96±12.79)歲；腫瘤最大徑中位數(shù)為1.4 cm(范圍0.4～5.0 cm)，促甲狀腺激素范圍為0.019～7.605 IU/ml，中位數(shù)為1.925 IU/ml(表2)。8例(23.53%)病人進行了復(fù)發(fā)灶檢測，均為頸部淋巴結(jié)復(fù)發(fā)，年齡27～52歲，中位年齡37歲，男女各4例；DFS 2～66個月，平均25.38個月(圖1)。

表2 26例原發(fā)性PTC的基本資料

2.34例PTC病人的基因變異情況：34例PTC共檢測到BRAF、TERT、Tp53、NTRK3和RET 5種變異(圖1)。合并2種及以上變異定義為多基因變異。26例原發(fā)灶中僅BRAF突變者19例，占原發(fā)性PTC變異的73.08%，突變位點為V600E，平均突變頻率為(15.58±9.70)%；RET重排4例(15.38%)，2例為NCOA4型，位點為exon8-exon12，另2例為CCDC6型，位點為exon1-exon12；多基因變異2例(7.69%)，分別為BRAF V600E+TERT C250T+Tp53 E285K和BRAF V600E+ETV6-NTRK3；NTRK3融合1例(3.85%)，為ETV6型，融合位點為exon4-exon14；復(fù)發(fā)灶中僅BRAF突變者6例(75%)，突變位點均為V600E，平均突變頻率為(16.43±14.14)%；RET重排1例(12.5%)，為NCOA4型，位點位于exon8-exon12；多基因變異1例(12.5%)，為BRAF V600E+TERT C228T。8例復(fù)發(fā)灶中未檢測到NTRK3變異。

每一行代表1種基因或臨床特征，每一列代表1例病人A：BRAF單基因變異的突變頻率;B：基因變異種類及位點;C:基本臨床特征圖1 34例PTC的基因變異景觀圖

3.BRAF突變頻率與臨床病理特征的關(guān)系：原發(fā)灶中僅BRAF突變者19例，平均年齡(37.16±13.50)歲，突變頻率1.14%～34.24%，中位數(shù)為13.61%，結(jié)合平均數(shù)，取15%為界值將病人分為低頻突變組(≤15%)和高頻突變組(>15%)，比較兩組臨床病理特征的差異。結(jié)果顯示，高頻組腫瘤更大(直徑>2 cm，P=0.033)，多單個病灶(P=0.005)，低頻組則相反。兩組間性別、年齡、病理亞型、是否CLNM、是否ETE、TNM分期及是否合并HT等差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表3)。

表3 BRAF突變頻率與臨床病理特征的關(guān)系(例)

討論

多種基因參與PTC的發(fā)生發(fā)展，驅(qū)動基因的變異、富集及缺失使細胞異常生長、分化和凋亡。本研究原發(fā)灶共檢測到包括多基因變異的4種變異，復(fù)發(fā)灶檢測到3種，兩組基因中BRAF平均突變頻率分別為(15.58±9.70)% 和(16.43±14.14)%。有研究發(fā)現(xiàn)PTC原發(fā)灶與復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移灶的BRAF狀態(tài)具有一致性[5-6]。Melo等[7]檢測了180例PTC原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的BRAF、TERT及NRAS的突變頻率，結(jié)果表明，三種突變頻率在兩組間具有一致性，尤其是BRAF突變。因此，BRAF、RAS和TERT可能在PTC復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用，對手術(shù)不能切除的復(fù)發(fā)性PTC的后續(xù)治療具有參考意義。本研究未獲得復(fù)發(fā)灶對應(yīng)的原發(fā)灶樣本，未進行二者的相關(guān)性分析。

BRAF V600E是PTC最常見的基因變異，本研究中原發(fā)灶和復(fù)發(fā)灶均有此突變，原發(fā)灶中BRAF V600E患病率為80.77%，與既往報道相仿(29%～83%)[8]。目前，BRAF狀態(tài)與PTC臨床病理特征的相關(guān)性研究尚有爭議，多數(shù)研究認為，BRAF突變是ETE、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM晚期的危險因素[9]。Kim等[10]的研究表明，BRAF V600E突變比例高的PTC與腫瘤大小、ETE、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，突變比例低者臨床行為與BRAF陰性腫瘤相似。本研究得到類似結(jié)果，PTC常具有多發(fā)小病灶的表現(xiàn)與低頻組一致，而高頻組多單個大病灶。de Biase等[11]和Guerra等[12]的研究均揭示了BRAF V600E陽性腫瘤細胞>30%(高突變者)的PTC體積大于<30%者(低突變者)，而后者進一步發(fā)現(xiàn)高突變者的復(fù)發(fā)比例明顯高于低突變者。多項研究表明，BRAF V600E突變頻率與ETE顯著相關(guān)[13-14]，因此我們推測BRAF V600E突變的累積促進腫瘤的局部生長，進而影響病人預(yù)后。本研究未發(fā)現(xiàn)突變頻率與ETE的關(guān)系，可能與納入的樣本較少且確診年齡較小有關(guān)。

RET/PTC重排是甲狀腺腫瘤發(fā)生的早期事件，以RET/PTC1(CCDC6-RET)和 RET/ PTC3(NCOA4-RET)最常見。前者在經(jīng)典型中多見，而后者常與較大腫瘤、實性/梁狀亞型和較晚TNM分期相關(guān)[15]。本研究中納入RET/PTC1 2例，分別為實性/梁狀亞型和經(jīng)典型； RET/PTC3 3例，原發(fā)灶2例為經(jīng)典型，復(fù)發(fā)灶1例。TERT主要為第228位點或第250位點的C到T突變。TERT突變與TC侵襲性有關(guān)，當遠處轉(zhuǎn)移時，BRAF、 TERT兩種突變常同時存在[7]。本研究中原發(fā)灶和復(fù)發(fā)灶各1例檢測到TERT突變，均為多基因變異，且原發(fā)性PTC病人病理亞型為TCV，部分去分化，腫瘤>4 cm，存在肌肉、神經(jīng)侵犯和脈管癌栓。Tp53維持細胞正常生長， Tp53變異與TC的去分化相關(guān)[2,16]。本研究中僅原發(fā)組1例病人檢測到Tp53突變，且合并BRAF和TERT突變。NTRK家族包括NTRK1， NTRK2和NTRK3三種融合，NTRK1融合比NTRK3更具侵襲性，二者均是預(yù)后不良的危險因素[16]。本研究在原發(fā)灶中檢測到2例NTRK融合，其中1例合并BRAF突變。多數(shù)PTC僅存在單基因變異，多基因變異時可能激活多條信號通路，加速PTC發(fā)展。本研究中多基因變異在原發(fā)灶和復(fù)發(fā)灶中的比例分別為7.69%和12.50%。Trybek等[17]研究表明，BRAF V600E合并TERT突變與ETE、TNM Ⅱ～Ⅳ期、復(fù)發(fā)和較差的治療反應(yīng)相關(guān)。本研究因檢測到上述基因變異的病人較少，尚未進行相關(guān)的臨床分析。