朱洪宇, 史志敏

(南京醫(yī)科大學附屬蘇州科技城醫(yī)院 放療科, 江蘇 蘇州, 215010)

肺癌目前是中國發(fā)病率、死亡率最高的惡性腫瘤, 5年生存率低于18%[1]。非小細胞肺癌(NSCLC)在肺癌中占比為85%, 其治療方式主要有手術(shù)、化放療、靶向藥物治療等[2]。研究[3]發(fā)現(xiàn)，多數(shù)NSCLC患者存在表皮生長因子受體(EGFR)基因突變，且EGFR合并腫瘤抑制基因共同突變的患者往往預后不良。EGFR酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)是EGFR突變NSCLC患者的首選治療方案，但治療一段時間后會出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，影響預后[4]。

微小RNA(miRNA)是廣泛參與機體各種生命活動的單鏈小分子非編碼RNA, 其在腫瘤中的差異表達及在腫瘤細胞增殖、凋亡、侵襲、化療抵抗、耐藥等方面的調(diào)控作用已被廣泛報道[5-7]。研究[8-9]發(fā)現(xiàn), miR-338-3p在肺癌等多種腫瘤中表達下調(diào)，有望成為NSCLC治療的潛在靶點。研究[10]顯示, miR-338-3p可通過EGFR信號通路抑制NSCLC細胞增殖、遷移及侵襲，但對NSCLC細胞出現(xiàn)EGFR-TKI耐藥的作用研究較少。本研究探討miR-338-3p對EGFR-TKI吉非替尼耐藥的肺癌細胞株P(guān)C-9/GR凋亡及程序性死亡配體1(pPD-L1)表達的影響，并初步分析其作用機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

人肺腺癌細胞株P(guān)C-9及其吉非替尼耐藥細胞株P(guān)C-9/GR(貨號YS2301C、YS3629C)購自美國ATCC; RPMI-1640培養(yǎng)液(貨號CP680110A)購自上海冠導生物工程有限公司; 吉非替尼、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒、信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子1(STAT1)抑制劑Fludarabine(貨號JKLN007404a、JKMK1417B、JKLN020840)購自上海經(jīng)科化學科技有限公司; MTT溶液(貨號JK3297)購自上海晶抗生物工程有限公司; miR-338-3p NC、miR-338-3p模擬物及miR-338-3p、U6引物購自柏業(yè)貿(mào)易(上海)有限公司; 兔抗p-STAT1、兔抗STAT1、兔抗PD-L1、兔抗Bcl-2、兔抗Bax、兔抗GAPDH、羊抗兔二抗(貨號ab109461、ab210524、ab243877、ab196495、ab232479、ab181603、ab133470)購自美國abcam。NAPCO-8800型培養(yǎng)箱購自美國Shellab; MODEL550型酶標儀、GS-800型凝膠掃描成像系統(tǒng)購自美國Bio-Rad; Lightcycler 480II型熒光定量PCR儀購自德國Roche; CytoFLEX型流式細胞儀購自美國Beckman coulter。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與分組: PC-9細胞、PC-9/GR細胞復蘇后接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，放入37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中，生長至覆蓋培養(yǎng)瓶80%面積，棄培養(yǎng)液，用0.25%胰蛋白酶消化，顯微鏡下觀察到細胞回縮變圓后終止消化，吹打為單細胞并更換新鮮培養(yǎng)液重懸，按1∶2比例分瓶傳代。

取傳代3次的對數(shù)生長期PC-9、PC-9/GR細胞，按2×104個/mL接種于細胞培養(yǎng)板，分別加0、0.25、0.5、1、2、4、8 μmol/L吉非替尼，檢測細胞增殖情況，以確定吉非替尼用量。此外，傳代3次的對數(shù)生長期PC-9、PC-9/GR細胞按2×104個/mL接種于細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)后，檢測細胞中miR-338-3p表達。

將PC-9/GR細胞分為對照組、miR-338-3p NC組、miR-338-3p組和STAT1抑制劑組。其中miR-338-3p NC組、miR-338-3p組、STAT1抑制劑組細胞貼壁后，分別轉(zhuǎn)染miR-338-3p NC、miR-338-3p模擬物和miR-338-3p模擬物，培養(yǎng)48 h后采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)檢測轉(zhuǎn)染效果，之后4組均在培養(yǎng)液中加1 μmol/L吉非替尼, STAT1抑制劑組同時加100 μmol/L的STAT1抑制劑Fludarabine，細胞繼續(xù)培養(yǎng)，進行后續(xù)實驗。

1.2.2 qRT-PCR檢測細胞中miR-338-3p表達：細胞培養(yǎng)48 h, 使用TRIzol提取細胞總RNA并檢測其濃度、純度，以RNA為模板行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后進行qRT-PCR反應，用熒光定量PCR儀檢測，U6為內(nèi)參基因, miR-338-3p表達結(jié)果以2-△△Ct法表示。miR-338-3p上游引物: 5′-GTCAGTTCCAGCATCAGTGATT-3′, 下游引物: 5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′; U6上游引物: 5′-GCTCGCTTCGGCAGCACA-3′, 下游引物: 5′-GAGGTATTCGCA CCAGAGGA-3′。

1.2.3 MTT法檢測細胞增殖：細胞培養(yǎng)48 h, 每孔加10 μL MTT溶液，培養(yǎng)4 h, 棄上清，每孔加150 μL DMSO, 震蕩5 min, 用酶標儀檢測490 nm波長處吸光度(OD)值，計算增殖率(%)=OD實驗組/OD對照組×100%。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡：細胞培養(yǎng)48 h, 收集后按照Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒說明書進行處理，避光孵育15 min, 使用流式細胞儀進行檢測。

1.2.5 蛋白印跡(WB)法檢測細胞中p-STAT1、STAT1、PD-L1、Bcl-2、Bax蛋白表達情況：細胞培養(yǎng)48 h, 收集細胞，使用RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法定量。取20 μg蛋白樣本, 95 ℃水浴5 min使蛋白變性，上樣，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，轉(zhuǎn)移目的蛋白至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，用封閉液封閉1.5 h, 放入一抗(兔抗p-STAT1、兔抗STAT1、兔抗PD-L1、兔抗Bcl-2、兔抗Bax、兔抗GAPDH)稀釋液(均1∶1 500)中孵育過夜，放入羊抗兔二抗(辣根過氧化物酶標記)稀釋液(1∶2 000)中室溫孵育1 h, 化學發(fā)光法顯色，凝膠掃描成像系統(tǒng)掃描圖像，分析條帶灰度值。目的蛋白表達量以目的蛋白與GAPDH灰度值的比值表示。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié) 果

2.1 PC-9細胞、PC-9/GR細胞在不同濃度吉非替尼作用下的增殖率

隨著吉非替尼濃度逐漸升高, PC-9細胞、PC-9/GR細胞的增殖率呈逐漸降低趨勢(P<0.05); 當吉非替尼濃度升高至1.00 μmol/L時, PC-9細胞與PC-9/GR細胞增殖率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。故后續(xù)實驗均采用1.00 μmol/L作為吉非替尼的處理濃度。見表1。

表1 不同濃度吉非替尼作用下PC-9細胞、PC-9/GR細胞的增殖率比較

2.2 PC-9細胞、PC-9/GR細胞中miR-338-3p表達情況

與PC-9細胞miR-338-3p表達水平(1.00±0)相比, PC-9/GR細胞中miR-338-3p表達水平(0.84±0.12)降低，差異有統(tǒng)計學意義(t=3.266,P=0.008)。

2.3 轉(zhuǎn)染后PC-9/GR細胞miR-338-3p表達情況

對照組與miR-338-3p NC組的miR-338-3p表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05); 與對照組、miR-338-3p NC組相比, miR-338-3p組、STAT1抑制劑組的miR-338-3p表達水平均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); miR-338-3p組與STAT1抑制劑組的miR-338-3p表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 轉(zhuǎn)染后PC-9/GR細胞miR-338-3p表達水平比較

2.4 各組PC-9/GR細胞增殖情況

對照組與miR-338-3p NC組的PC-9/GR細胞增殖率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05); 與miR-338-3p NC組相比, miR-338-3p組PC-9/GR細胞增殖率降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 與miR-338-3p組相比, STAT1抑制劑組PC-9/GR細胞增殖率升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組PC-9/GR細胞增殖率比較

2.5 各組PC-9/GR細胞凋亡情況

對照組與miR-338-3p NC組的PC-9/GR細胞凋亡率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05); 與miR-338-3p NC組相比, miR-338-3p組PC-9/GR細胞凋亡率升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 與miR-338-3p組相比, STAT1抑制劑組PC-9/GR細胞凋亡率降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1、表4。

A: 對照組; B: miR-338-3p NC組; C: miR-338-3p組; D: STAT1抑制劑組。圖1 各組PC-9/GR細胞凋亡情況

表4 各組PC-9/GR細胞凋亡率比較

2.6 各組PC-9/GR細胞中p-STAT1、STAT1、PD-L1、Bcl-2、Bax蛋白表達情況

對照組與miR-338-3p NC組的PC-9/GR細胞中p-STAT1/STAT1、PD-L1、Bcl-2、Bax蛋白表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05); 與miR-338-3p NC組相比, miR-338-3p組PC-9/GR細胞中p-STAT1/STAT1、Bax蛋白表達水平升高, PD-L1、Bcl-2蛋白表達水平降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05); 與miR-338-3p組相比, STAT1抑制劑組PC-9/GR細胞中p-STAT1/STAT1、Bax蛋白表達水平降低, PD-L1、Bcl-2蛋白水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2、表5。

表5 各組PC-9/GR細胞中p-STAT1、STAT1、PD-L1、Bcl-2、Bax蛋白表達水平比較

圖2 各組PC-9/GR細胞中p-STAT1、STAT1、PD-L1、Bcl-2、Bax蛋白表達情況

3 討 論

肺癌是全球腫瘤相關(guān)死亡的主要原因，近年來其發(fā)病率不斷升高。EGFR是原癌基因c-erb B1的表達產(chǎn)物，屬于酪氨酸激酶受體，在多種腫瘤中高表達[11]。研究[12-13]發(fā)現(xiàn)，存在EGFR突變的亞洲肺癌患者占50%, 這部分人群體內(nèi)肺癌細胞增殖、生長依賴于突變的EGFR, 用EGFR-TKI對其進行治療，臨床療效較好，但治療1年內(nèi)均會出現(xiàn)獲得性耐藥。故解決EGFR-TKI耐藥問題是肺癌治療方面比較棘手的問題。吉非替尼是第一代EGFR-TKI, 本研究通過設(shè)置吉非替尼濃度梯度，檢測PC-9細胞、PC-9/GR細胞的增殖率，最終選擇1.00 μmol/L作為后續(xù)實驗中PC-9/GR細胞的吉非替尼用藥濃度。

研究[14-15]表明, miRNA在腫瘤組織中異常表達，發(fā)揮促癌或抑癌基因的作用，參與腫瘤發(fā)生及進展。由于miRNA具有腫瘤病理的特異性，常被認為可作為一種新型靶點用于腫瘤的靶向治療。研究[16]顯示, miRNA不僅可介導腫瘤細胞增殖、凋亡、遷移等生物學行為，在腫瘤發(fā)生放化療抵抗、耐藥等過程中亦發(fā)揮重要作用。miR-338-3p是miR-338家族成員，在食道癌、頭頸部鱗狀細胞癌、腎嫌色細胞癌、腎乳頭狀腎細胞癌、肺鱗癌及甲狀腺癌中表達顯著下調(diào)，而在肝細胞癌、結(jié)腸腺癌及腎透明細胞癌中表達顯著上調(diào)[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn), PC-9/GR細胞中miR-338-3p表達水平較PC-9細胞顯著降低，提示miR-338-3p在EGFR-TKI耐藥的PC-9細胞中差異表達，其低表達可能參與PC-9細胞發(fā)生EGFR-TKI耐藥的機制。通過轉(zhuǎn)染miR-338-3p模擬物，上調(diào)miR-338-3p在PC-9/GR細胞中的表達水平后, PC-9/GR細胞增殖率顯著降低，凋亡率顯著升高，細胞中Bcl-2家族促凋亡成員Bax蛋白表達水平顯著升高，抑凋亡成員Bcl-2蛋白水平[19]顯著降低，提示上調(diào)miR-338-3p可一定程度逆轉(zhuǎn)PC-9/GR細胞的EGFR-TKI耐藥，抑制細胞增殖，并誘導細胞凋亡。PD-L1是在多種腫瘤細胞表面高表達的因子，可幫助腫瘤細胞發(fā)生免疫逃逸，其高表達往往與腫瘤預后不良呈正相關(guān)[20-22]。上調(diào)miR-338-3p表達后, PC-9/GR細胞中PD-L1表達水平顯著降低，提示miR-338-3p可能抑制PC-9/GR細胞發(fā)生免疫逃逸，進而促進細胞凋亡。

STAT1是一種信號傳導與轉(zhuǎn)錄活化因子蛋白，能從各個角度參與對細胞生長、分化、存活及凋亡的調(diào)控，目前多被認為是腫瘤抑制因子[23-24]。孫思博等[25]研究表明, STAT家族成員在NSCLC獲得性耐藥過程中發(fā)揮重要作用。本研究顯示, miR-338-3p表達上調(diào)后, PC-9/GR細胞中p-STAT1/STAT1蛋白表達水平顯著升高，提示STAT1激活參與miR-338-3p逆轉(zhuǎn)PC-9/GR細胞的EGFR-TKI耐藥過程。在miR-338-3p表達上調(diào)基礎(chǔ)上，加入STAT1抑制劑抑制STAT1激活后, miR-338-3p表達無顯著變化，細胞增殖率顯著升高，凋亡率顯著降低，細胞中Bax蛋白表達水平顯著降低, PD-L1、Bcl-2蛋白表達水平顯著升高，進一步提示miR-338-3p逆轉(zhuǎn)PC-9/GR細胞的EGFR-TKI耐藥過程可能與激活STAT1有關(guān)。

綜上所述, miR-338-3p表達上調(diào)可激活STAT1, 抑制EGFR-TKI耐藥肺癌細胞株P(guān)C-9/GR細胞中PD-L1表達，并誘導細胞凋亡，這可能為臨床解決EGFR-TKI耐藥問題提供理論依據(jù)。