陳光建 覃悅 韓長(zhǎng)志

摘要：希金斯炭疽菌是一種半活體營(yíng)養(yǎng)型植物炭疽病原真菌，能夠侵染多種十字花科植物引起的炭疽病，特別是引起蔬菜炭疽病的重要病原。胞吞在真菌侵染植物過程中發(fā)揮著重要作用，該作用一般同具有NPFxD基序的蛋白受體介導(dǎo)有關(guān)，然而，目前有關(guān)該炭疽菌中胞吞作用相關(guān)蛋白尚未明確。基于前人已報(bào)道的構(gòu)巢曲霉中NPFxD蛋白序列，通過關(guān)鍵詞搜索以及Blastp比對(duì)等方法對(duì)希金斯炭疽菌蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行NPFxD蛋白找尋，明確該菌中存在2個(gè)NPFxD蛋白序列，根據(jù)蛋白同源性，分別命名為ChMYO1、ChGBP2。同時(shí)，對(duì)這2個(gè)蛋白序列開展了保守結(jié)構(gòu)域及跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)理化性、信號(hào)肽、亞細(xì)胞定位以及二級(jí)結(jié)構(gòu)等生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，ChMYO1、ChGBP2蛋白亞細(xì)胞定位情況不同，前者定位在質(zhì)膜，后者定位在核內(nèi);兩者在親疏水性、最高氨基酸殘基和其位置等均有著一定差異;兩者均無明顯的信號(hào)肽序列;兩者均含有無規(guī)則卷曲、α螺旋、β卷曲，而缺乏TM螺旋。此外，對(duì)多個(gè)不同真菌中NPFxD基序同源蛋白序列開展遺傳關(guān)系分析，明確希金斯炭疽菌中的NPFxD基序蛋白與炭疽菌屬中其他病菌中的蛋白具有較高的同源性，本研究為進(jìn)一步研究炭疽菌屬NPFxD基序蛋白的功能提供了理論參考。

關(guān)鍵詞：胞吞作用;希金斯炭疽菌;NPFxD基序蛋白;生物信息學(xué)

中圖分類號(hào)： S436.3;S432.4+4文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2022）05-0035-06

收稿日期：2021-06-08

基金項(xiàng)目：云南省“興滇英才支持計(jì)劃”青年人才專項(xiàng)（編號(hào)：YNWR-QNBJ-2020-188）;國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31960211）。

作者簡(jiǎn)介：陳光建（1987—），男，云南大理人，碩士研究生，從事資源利用與植物保護(hù)研究，E-mail：357053147@qq.com;共同第一作者：覃 悅（1992—），男，云南昆明人，碩士研究生，從事資源植物保護(hù)與利用研究，E-mail：453276403@qq.com。

通信作者：韓長(zhǎng)志，博士，教授，從事經(jīng)濟(jì)林木病害生物防治與真菌分子生物學(xué)研究。E-mail：hanchangzhi2010@163.com。

希金斯炭疽菌（Colletotrichum higginsanum Sacc）是半活體營(yíng)養(yǎng)型植物炭疽病原真菌，能夠侵染多種十字花科蔬菜引起炭疽病，是生產(chǎn)上危害蔬菜產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重要病原菌[1]。前人研究主要集中在生物防治菌株篩選、外源酚酸類物質(zhì)對(duì)羥基苯甲酸（PHBA）控制進(jìn)化轉(zhuǎn)化以及一些不同營(yíng)養(yǎng)元素（氮、硅、鉀等）控制病害等方面[2]。近年來，隨著該菌全基因序列的公布[3]，國(guó)內(nèi)外學(xué)者展開了絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)路徑相關(guān)蛋白的研究，同時(shí)，筆者所在研究團(tuán)隊(duì)前期也對(duì)該菌中的PITP[4]、RGS[5]、14-3-3[6]、septin[7]、AC[8]以及CAZymes等蛋白進(jìn)行找尋及其生物信息學(xué)分析等研究工作[9]。此外，國(guó)內(nèi)諸多學(xué)者對(duì)該菌中的轉(zhuǎn)化子基因功能開展了研究[10-11]。對(duì)于希金斯炭疽菌在侵染十字花科植物過程中，上述效應(yīng)分子或分泌蛋白如何發(fā)揮作用尚不清楚。前人研究發(fā)現(xiàn)，胞吞（endocytosis）在生物細(xì)胞內(nèi)部和周圍環(huán)境之間進(jìn)行信號(hào)通訊過程中發(fā)揮著重要作用[12]。不同生物可以釋放出一組不同的外膜囊泡，這些囊泡作為運(yùn)輸載體，將效應(yīng)分子和毒力因子傳遞給宿主細(xì)胞。囊泡的形態(tài)情況是通過各種蛋白質(zhì)模塊（復(fù)合物）的形成而實(shí)現(xiàn)[13]，通過釀酒酵母中NPFxD基序蛋白突變?cè)囼?yàn)，明確Stex22p是實(shí)現(xiàn)物質(zhì)攝取的重要蛋白[14]。因此，推測(cè)NPFxD基序蛋白在希金斯炭疽菌侵染植物過程中具有重要的作用，特別是對(duì)于不同效應(yīng)分子或分泌蛋白輸出到植物中具有重要的功能。

本研究基于前人已報(bào)道的構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans）中NPFxD基序蛋白序列[15]，利用關(guān)鍵詞搜索及同源序列比對(duì)等方法，在希金斯炭疽菌蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中開展序列找尋，同時(shí)，利用SMART、TMHMM以及Protscale、SignalP、TargetP等生物信息學(xué)分析軟件，明確該菌中NPFxD基序蛋白的保守結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、理化性質(zhì)、信號(hào)肽以及亞細(xì)胞定位情況，此外，對(duì)不同真菌中與希金斯炭疽菌中NPFxD基序蛋白同源蛋白序列開展遺傳關(guān)系分析，以期為進(jìn)一步開展該菌中胞吞作用研究提供重要的理論基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)核桃炭疽病病菌相關(guān)胞吞蛋白研究提供重要的理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

構(gòu)巢曲霉中NPFxD基序蛋白myo5、gbp2的序列。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 希金斯炭疽菌中NPFxD基序蛋白找尋

在炭疽菌屬蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)“NPFxD”和“NPFxD-mediated endocytosis”等關(guān)鍵詞進(jìn)行搜索，并以構(gòu)巢曲霉中NPFxD基序?yàn)閰⒖迹x擇默認(rèn)的參數(shù)用Blastp進(jìn)行比對(duì)分析，然后，在NCBI上明確該菌中NPFxD的蛋白登錄號(hào)等基本信息。

1.2.2 保守結(jié)構(gòu)域及跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

利用SMART網(wǎng)站[16]對(duì)NPFxD基序蛋白中所具有的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，利用TMHMM Server v. 2.0[17]和HMMTOP version 2.0[18]等分析跨膜結(jié)構(gòu)域。

1.2.3 理化性質(zhì)分析

根據(jù)Protscale[19]對(duì)NPFxD基序蛋白開展理化性質(zhì)分析。

1.2.4 蛋白質(zhì)信號(hào)序列分析

利用SignalP 5.0[20]開展蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè);利用TargetP 1.1[21]明確蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)肽。

1.2.5 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用PHD[22]預(yù)測(cè)程序明確蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成情況。

1.2.6 亞細(xì)胞位置分析

利用ProtComp v9.0[23]預(yù)測(cè)蛋白的亞細(xì)胞定位情況。

1.2.7 系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

基于希金斯炭疽菌（C. higginsanum）中NPFxD基序蛋白序列，利用Blastp軟件進(jìn)行同源序列比對(duì)，獲得不同真菌中同源蛋白序列，然后，利用ClustalX[24]軟件開展多重比對(duì)分析研究，再利用MEGA X[25]采用鄰近法構(gòu)建發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 希金斯炭疽菌中NPFxD基序蛋白找尋

首先，利用EMBOSS fuzzpro軟件開展希金斯炭疽菌中NPFxD基序蛋白序列的找尋[26]，得到34條含有NPFxD的蛋白序列。然后，基于構(gòu)巢曲霉中NPFxD基序蛋白序列[27]，利用Blastp比對(duì)已經(jīng)獲取的NPFxD基序蛋白開展比對(duì)分析，篩選得出共 1 177 條同源序列，同時(shí)，利用關(guān)鍵詞搜索，并未得到相關(guān)蛋白序列。對(duì)上述所獲得序列，進(jìn)一步整合分析，并去除重復(fù)數(shù)據(jù)和對(duì)比篩選，結(jié)果表明，與構(gòu)巢曲霉（A. nidulans）同源的C. higginsanum中含有NPFxD基序蛋白質(zhì)序列共2條（表1），其蛋白ID分別為CH063_04448、CH063_04465。根據(jù)同源序列相互關(guān)系的分析結(jié)果，將上述序列分別命名為ChMYO1、ChGBP2。

2.2 保守結(jié)構(gòu)域及跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

對(duì)上述2個(gè)NPFxD基序蛋白開展保守結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果表明，ChMYO1含有MYSc保守結(jié)構(gòu)域，而ChGBP2含有RRM保守結(jié)構(gòu)域（圖1）。進(jìn)一步分析，MYSc結(jié)構(gòu)域作為ATP酶分子馬達(dá)，肌肉收縮由肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白之間的周期性相互作用組成，推測(cè)該結(jié)構(gòu)域?qū)τ诎套饔玫膶?shí)現(xiàn)發(fā)揮著重要功能;RRM結(jié)構(gòu)域則是在許多已知的或應(yīng)該結(jié)合單鏈RNA的真核蛋白質(zhì)都包含一個(gè)或多個(gè)拷貝的大約90個(gè)氨基酸的推定RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。同時(shí)，開展TMHMM跨膜結(jié)構(gòu)域分析，明確上述2個(gè)NPFxD基序蛋白均不含有跨膜結(jié)構(gòu)域，而根據(jù)HMMTOP分析，明確ChMYO1具有1個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，起始位置為71、終止位置為90。由于不同的跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)軟件所的結(jié)果不盡相同，有待于進(jìn)一步通過試驗(yàn)驗(yàn)證得以明確。

2.3 亞細(xì)胞定位分析

對(duì)C. higginsanum中NPFxD基序蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，結(jié)果表明，ChMYO1亞細(xì)胞定位在質(zhì)膜，而ChGBP2蛋白定位在核內(nèi)（表2）。一般而言，生物中發(fā)揮胞吞作用的蛋白經(jīng)過質(zhì)膜內(nèi)陷并形成膜包被的囊泡， 進(jìn)而實(shí)現(xiàn)生理功能，本研究中ChMYO1亞細(xì)胞定位在質(zhì)膜可以較好地解釋其功能，而ChGBP2蛋白定位在核內(nèi)，尚不清楚胞吞作用蛋白定位在核內(nèi)的原因，推測(cè)其還具有其他生物學(xué)功能，從而更好地發(fā)揮其內(nèi)吞作用的實(shí)現(xiàn)。

2.4 理化性質(zhì)及疏水性預(yù)測(cè)

ChMYO1與ChGBP2蛋白在酸堿性氨基酸組成和不帶電荷的極性R基氨基酸、非極性R基氨基酸組成方面均存在著一定差異，其中，前者中堿性氨基酸殘基K（賴氨酸）、不帶電荷的極性R基氨基酸殘基G（甘氨酸）的比例較高，均為11.30%，而后者中不帶電荷的極性R基氨基酸殘基G所占比例最高，為27.30%（表3）。

同時(shí)，ChMYO1與ChGBP2蛋白在相對(duì)分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)、正電荷氨基酸殘基數(shù)、負(fù)電荷氨基酸殘基數(shù)、原子質(zhì)量以及分子式不穩(wěn)定性系數(shù)、總的平均親水性脂肪族氨基酸指數(shù)等方面也具有一定的差異，盡管如此，兩者仍具有一定的相似性，其中，兩者在不穩(wěn)定性系數(shù)方面數(shù)值均小于40，為穩(wěn)定蛋白;兩者的總平均親水性（GRAVY）數(shù)值均小于0，屬于親水性蛋白（表4）。此外，C. higginsianum中ChMYO1與ChGBP2蛋白在親疏水性、最高氨基酸殘基和其位置等均有著一定差異，前者親水性最強(qiáng)氨基酸殘基、疏水性最強(qiáng)氨基酸殘基分別為D（天冬氨酸）、V（纈氨酸），后者親水性最強(qiáng)氨基酸殘基、疏水性最強(qiáng)氨基酸殘基分別為S（半胱氨酸）、F（苯丙氨酸）（表5）。

2.5 轉(zhuǎn)運(yùn)肽及信號(hào)序列特征

經(jīng)過TargetP分析，C. higginsianum中ChMYO1、ChGBP2均未獲得有效的轉(zhuǎn)運(yùn)肽定位情況（表6），通過SignalP分析發(fā)現(xiàn)，ChMYO1、ChGBP2均沒有明顯的信號(hào)序列（表7）。轉(zhuǎn)運(yùn)肽（transit peptide）作為一種12～60個(gè)氨基酸殘基的前導(dǎo)序列，其作用在于引導(dǎo)在細(xì)胞溶質(zhì)中合成的蛋白質(zhì)輸入線粒體和葉綠體。本研究中并未獲得ChMYO1、ChGBP2有效的轉(zhuǎn)運(yùn)肽定位情況，表明上述蛋白并不具有輸入到線粒體和葉綠體等功能，這與胞吞作用發(fā)揮的功能相一致。同時(shí)，作為發(fā)揮胞吞作用的蛋白而言，并不具有分泌蛋白特性，因此，與此次所預(yù)測(cè)的結(jié)果——不含有明顯的信號(hào)肽的預(yù)測(cè)結(jié)果相符合。

2.6 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

對(duì)C. higginsianum中ChMYO1、ChGBP2的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成情況進(jìn)行分析，結(jié)果表明，上述NPFxD基序蛋白均含有明顯的無規(guī)則卷曲、α螺旋、β卷曲，且均沒有TM螺旋，進(jìn)一步對(duì)上述蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)組成展開分析，明確ChMYO1中含有α螺旋的比例高達(dá)39%，而ChGBP2中則含有比較多的無規(guī)則卷曲，占比為60%（圖2）。蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)指多肽主鏈骨架原子沿一定的軸盤旋或折疊而形成的特定的構(gòu)象，即肽鏈主鏈骨架原子的空間位置排布，不涉及氨基酸殘基側(cè)鏈。對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，有助于明確其發(fā)揮重要作用的構(gòu)象結(jié)構(gòu)，本研究發(fā)現(xiàn)ChMYO1與ChGBP2并不具有相同或相似的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)組成，推測(cè)其具有不同的功能。

2.7 遺傳關(guān)系分析

以C. higginsianum的ChMYO1、ChGBP2蛋白序列作為“種子序列”，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中開展同源序列搜索，并下載，進(jìn)一步利用Clust X及MEGA X軟件對(duì)上述序列進(jìn)行遺傳關(guān)系分析，結(jié)果顯示，在與ChMYO1、ChGBP2同源的18條蛋白序列中，分別以ChMYO1、ChGBP2為中心，明顯地分為兩大類（圖3），說明上述NPFxD基序蛋白序列存在明顯的異源關(guān)系，這與上述所開展的保守結(jié)構(gòu)域、亞細(xì)胞定位以及理化性質(zhì)分析結(jié)果相一致。同時(shí)，從遺傳關(guān)系中可以看出，該菌中的NPFxD基序蛋白與來自于C. tofieldiae、C. sublineola等病菌中的蛋白具有較近的親緣關(guān)系（圖3）。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

植物病原絲狀真菌中的胞吞作用，對(duì)于其菌絲尖部的快速沿伸具有重要作用。前人研究表明，稻瘟菌中的內(nèi)吞作用，一般是通過運(yùn)輸Pmk1 MAPK途徑的上游膜受體而作用于黏附細(xì)胞的產(chǎn)生和侵染等[28]，作為同為半活體營(yíng)養(yǎng)型的希金斯炭疽菌，推測(cè)其也采用該胞吞作用機(jī)制從而調(diào)控著菌絲生長(zhǎng)。隨著希金斯炭疽菌全基因組序列的公布[3]，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)其致病相關(guān)基因開展了諸多解析工作，主要涉及G蛋白信號(hào)途徑中相關(guān)蛋白，如PITP[4]、PLC[29]、RGS[5]、septin[7]、GPCR[30]等蛋白找尋及其基本理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)以及功能特征等。然而，對(duì)于上述蛋白如何實(shí)現(xiàn)其功能作用的發(fā)揮，尚未見學(xué)術(shù)報(bào)道。本研究利用NPFxD基序搜索，共獲得了34個(gè)蛋白序列，并進(jìn)一步基于構(gòu)巢曲霉中的胞吞作用蛋白進(jìn)行同源比對(duì)，最終獲得ChMYO1、ChGBP2 2個(gè)NPFxD基序蛋白，這2個(gè)蛋白在保守結(jié)構(gòu)域、亞細(xì)胞定位以及理化性質(zhì)、遺傳關(guān)系方面均具有明顯的差異性，其在功能上除具有胞吞作用外，是否也具有其他功能方面的差異性，均有待于后續(xù)生物學(xué)試驗(yàn)驗(yàn)證。同時(shí)，其他32個(gè)具有NPFxD基序蛋白是否具有胞吞作用，其功能如何，尚不清楚，有待于進(jìn)一步研究明確。特別是在希金斯炭疽菌侵染植物過程中，具有NPFxD基序蛋白如何協(xié)同發(fā)揮其功能，均有待于今后進(jìn)一步明確。

3.2 結(jié)論

本研究通過關(guān)鍵詞搜索以及Blastp比對(duì)找尋，明確了C. higginsianum中具有2個(gè)與構(gòu)巢曲霉中胞吞作用蛋白同源的NPFxD基序蛋白，其蛋白ID分別為CH063_04448、CH063_04465。同時(shí)，根據(jù)HMMTOP、TMHMM程序?qū)λ@取的NPFxD基序蛋白開展跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)解析，結(jié)果表明，ChMYO1含有MYSc保守結(jié)構(gòu)域，而ChGBP2則含有RRM保守結(jié)構(gòu)域。對(duì)上述蛋白的理化性質(zhì)、二級(jí)結(jié)構(gòu)以及親疏水性等特征進(jìn)行分析，明確了上述2個(gè)NPFxD基序蛋白在理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位、二級(jí)結(jié)構(gòu)組成以及親疏水性方面均存在著一定的差異性。ChMYO1與ChGBP2蛋白在親疏水性、最高氨基酸殘基和其位置等均有著一定差異，前者親水性最強(qiáng)氨基酸殘基、疏水性最強(qiáng)氨基酸殘基分別為D（天冬氨酸）、V（纈氨酸），后者親水性最強(qiáng)氨基酸殘基、疏水性最強(qiáng)氨基酸殘基分別為S（半胱氨酸）、F（苯丙氨酸）。ChMYO1亞細(xì)胞定位在質(zhì)膜，而ChGBP2蛋白定位在核內(nèi)。上述NPFxD基序蛋白均含有明顯的無規(guī)則卷曲、α螺旋、β卷曲，且均沒有TM螺旋，進(jìn)一步對(duì)上述蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)組成展開分析，明確ChMYO1中含有α螺旋的比例高達(dá)39%，而ChGBP2中則含有比較多的無規(guī)則卷曲，比例為60%。此外，對(duì)于上述蛋白同源序列開展遺傳關(guān)系分析明確希金斯炭疽菌中上述NPFxD基序蛋白與C. tofieldiae、C. sublineola等炭疽菌屬病菌中的同源蛋白之間的親緣關(guān)系比較相近。上述研究為今后進(jìn)一步解析該菌以及其他炭疽菌屬中的NPFxD基序蛋白功能打下了理論基礎(chǔ)。

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