劉潮 韓利紅 吳麗芳 代小波 劉婕

摘要：為揭示辣椒基因組密碼子偏性形成的影響因素，了解密碼子偏性對(duì)基因表達(dá)的影響，以辣椒基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為研究?jī)?nèi)容，利用CodonW和EMBOSS等軟件對(duì)基因組密碼子使用偏性進(jìn)行分析。分析結(jié)果顯示，辣椒編碼基因平均GC含量為42.27%，偏好A/T作為密碼子的第3位核苷酸，基因平均ENC值偏大;GC3與GC12相關(guān)性較弱，大部分基因遠(yuǎn)離ENC-plot曲線，近50%的基因ENC比值分布在GC3s的0.05～0.15組中;發(fā)現(xiàn)21個(gè)最優(yōu)密碼子，均以T、A或G結(jié)尾，大部分最優(yōu)密碼子在組織器官表達(dá)數(shù)據(jù)中得到驗(yàn)證。表明辣椒基因密碼子使用偏性較低，除堿基突變外，較多地受到物種進(jìn)化和人工選擇等因素的影響。研究結(jié)果可為辣椒的分子進(jìn)化和遺傳育種研究提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：辣椒;基因組;最優(yōu)密碼子;基因表達(dá)

中圖分類號(hào)： S641.301文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2022）05-0016-07

收稿日期：2021-10-16

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：32060710、31860005）;云南省地方本科高?；A(chǔ)研究聯(lián)合專項(xiàng)（編號(hào)：202001BA070001-017）。

作者簡(jiǎn)介：劉 潮（1980—），男，河北景縣人，博士，副教授，主要從事植物逆境生物學(xué)研究。E-mail：liuchao_80@163.com。

通信作者：韓利紅，博士，副教授，主要從事植物譜系地理學(xué)研究。E-mail：hanlihong9527@126.com。

密碼子使用偏性（codon usage bias，簡(jiǎn)稱CUB）廣泛存在于基因組中，反映了密碼子在基因編碼中的不均勻使用，在基因調(diào)控中起重要作用。遺傳密碼的兼并性不改變蛋白質(zhì)氨基酸的構(gòu)成，但同義突變通常會(huì)對(duì)表型和適應(yīng)性產(chǎn)生影響。最優(yōu)密碼子的偏好在特定物種基因組中存在整體一致性，往往對(duì)應(yīng)豐度較高的tRNAs，高表達(dá)基因的高頻密碼子比其他密碼子豐富度更高，表明CUB與翻譯過程存在關(guān)聯(lián)[1-2]。通過對(duì)2個(gè)果蠅（Drosophila melanogaster）種群同義密碼子的偏性分析，發(fā)現(xiàn) 10%～20%的高頻密碼子受到較強(qiáng)的選擇作用影響，同時(shí)CUB相關(guān)的密碼子多型性以及可變剪切和轉(zhuǎn)錄因子都與選擇作用有關(guān)[3]。南方菟絲子（Cuscuta australis）的基因組編碼基因高頻密碼子第3位偏好A/T，而最優(yōu)密碼子偏好G/C，這種高頻密碼子和最優(yōu)密碼子的不一致可能與其寄生生活有關(guān)[4]?？馆椛浼?xì)菌基因組編碼基因密碼子第3位堿基偏好G和C，這與細(xì)菌抗輻射能力有直接關(guān)系[5]。農(nóng)業(yè)病原真菌柄銹菌屬（Puccinia）的高表達(dá)基因偏好使用富含GC的最優(yōu)密碼子[6]?；蚪M尺度密碼子使用性分析將有助于理解物種的進(jìn)化及其對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性，對(duì)研究物種進(jìn)化、mRNA翻譯和新基因發(fā)現(xiàn)都有重要意義[7]。

辣椒（Capsicum annuum）作為全球范圍內(nèi)重要的蔬菜和調(diào)味品，具有廣闊的開發(fā)利用價(jià)值。隨著辣椒基因組數(shù)據(jù)的公布[8]，有關(guān)辣椒抵御脅迫環(huán)境的轉(zhuǎn)錄組和代謝組研究[9-11] 被大量開展，尤其一些重要功能基因的研究為辣椒品種選育提供了參考[12-13]。利用分子生物學(xué)方法開展辣椒關(guān)鍵功能基因的研究具有重要的應(yīng)用價(jià)值，這就需要了解基因組水平上的密碼子使用性。然而，目前未見辣椒基因組密碼子使用偏性的報(bào)道。本研究以公布的辣椒基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，對(duì)辣椒基因組密碼子使用偏性及其影響因素進(jìn)行分析，以了解基因的表達(dá)潛力，為辣椒種質(zhì)資源開發(fā)和遺傳育種提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取

基因組數(shù)據(jù)由辣椒基因組數(shù)據(jù)庫（http：//peppersequence.genomics.cn/）下載。編碼序列（coding sequence，簡(jiǎn)稱CDS）的篩選遵循以下原則：（1）以ATG開始，以終止密碼子結(jié)束;（2）序列長(zhǎng)度大于300 bp[14]。從NCBI網(wǎng)站GEO DataSets數(shù)據(jù)庫下載相應(yīng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（GEO登錄號(hào)GSE45037）[15]。選取遵辣（ZL1）的根、莖、葉、花蕾和花，以及果實(shí)發(fā)育的9個(gè)時(shí)期（F-Dev1～F-Dev9）的基因表達(dá)數(shù)據(jù)。

1.2 分析方法

1.2.1 密碼子使用偏性分析 應(yīng)用CodonW軟件和EMBOSS網(wǎng)站的CUSP程序獲得CDS序列的密碼子使用偏性參數(shù)。包括有效密碼子數(shù)（effective number of codons，簡(jiǎn)稱ENC）、GC含量、A3s、T3s、G3s、C3s、GC3s（第3位同義密碼子上堿基的出現(xiàn)頻率）和相對(duì)同義密碼子使用性（relative synonymous codon usage，簡(jiǎn)稱RSCU）。應(yīng)用Mega X[16]對(duì)辣椒基因序列進(jìn)行核苷酸和氨基酸組成分析。

1.2.2 中性繪圖 分別以GC12和GC3作縱坐標(biāo)和橫坐標(biāo)繪制圖，分析密碼子使用偏性的影響因素。GC12與GC3相關(guān)性越強(qiáng)，密碼子使用性受堿基突變的影響越大，反之，受選擇壓力影響越大。

1.2.3 ENC-plot繪圖 ENC期望值計(jì)算公式為ENC=2+GC3s+29/[GC3s2+（1-GC3s）2]。ENC比值=（ENC期望值-ENC觀察值）/ENC期望值。ENC值越靠近理論曲線，GC3s決定密碼子使用性的影響越大，反之，自然選擇對(duì)密碼子使用偏性影響越大[17]。ENC比值越接近零，表明基因密碼子受堿基突變的影響越大[18]。

1.2.4 奇偶偏性分析（Parity Rule 2，簡(jiǎn)稱PR2） 分別計(jì)算G3/（G3+C3）和A3/（A3+T3）的比值，繪制PR2-plot。數(shù)值點(diǎn)的分布中心的坐標(biāo)靠近05，表明堿基的使用不存在突變或選擇偏性 [19]。

1.2.5 對(duì)應(yīng)性分析（correspondence analysis，簡(jiǎn)稱COA） 以59個(gè)密碼子（除了起始密碼子、終止密碼子和Trp密碼子之外）的RSCU值作為變量，得到每個(gè)基因的超維空間分布。不同向量代表每個(gè)基因密碼子使用模式的相關(guān)性。

1.2.6 最優(yōu)密碼子分析 ENC值最低和最高2端各選取5%的基因，分別構(gòu)成高表達(dá)基因（high expression genes，簡(jiǎn)稱HEG）和低表達(dá)基因（low expression genes，簡(jiǎn)稱LEG），基因組基因RSCU值≥120時(shí)，該密碼子定義為高頻密碼子，如果同時(shí)滿足ΔRSCU（高表達(dá)組RSCU值-低表達(dá)組RSCU 值）≥0.20，該密碼子定義為最優(yōu)密碼子。

1.2.7 密碼子使用性與基因表達(dá)的相關(guān)性 以NCBI基因表達(dá)數(shù)據(jù)（GEO登錄號(hào)GSE45037）為依據(jù)，從以下2個(gè)方面了解CUB與基因表達(dá)的關(guān)系[4]：（1）序列水平，以ENC值50為界限，將所有序列分為2組;（2）密碼子水平，根據(jù)密碼子第3位的偏好性，將所有序列分為4組。使用各組基因的器官FPKM（fragments per kilobase of transcript per million）的平均值代表基因表達(dá)豐度。

2 結(jié)果與分析

2.1 密碼子使用性

辣椒（Zunla 1 Ref_v1.0）基因組大小為 2 909.15 Mb，GC含量為35.30%[8]，包含35 336個(gè)基因序列，經(jīng)篩選后得到34 986個(gè)CDS序列用于后續(xù)分析。分析顯示，辣椒編碼基因平均GC含量為42.27%，高于基因組GC含量，而GC3s值與基因組GC含量非常接近，均為35.30%左右（表1）。4種核苷酸中，T3s最高，其次為A3s，而C3s最低，說明辣椒基因偏好A/T作為密碼子的第3位核苷酸。編碼序列中，平均ENC值為50.79，其中ENC值小于35.00的有233個(gè)序列，占比0.67%，大于55的有21 549個(gè)序列，占比61.59%，表明辣椒基因密碼子使用偏性較低，大部分基因表達(dá)潛力較低。

辣椒基因組編碼的氨基酸中，亮氨酸、絲氨酸所占比例較高，半胱氨酸、色氨酸所占比例較低（圖1）。

2.2 密碼子使用性影響因素

中性繪圖顯示，GC3值介于2.78%～88.89%，GC12值介于14.09%-82.33%，二者分布范圍均較廣泛（圖2）。回歸斜率較低（0.06），說明GC3與GC12相關(guān)性很弱，突變對(duì)密碼子第1、2位和第3位堿基使用性的影響不同。表明堿基突變?cè)诶苯坊蛎艽a子偏性形成中作用較小。

ENC-GC3s關(guān)聯(lián)分析顯示，辣椒基因分布較廣泛（圖3）。大部分基因分布在標(biāo)準(zhǔn)曲線下方，有部分GC3s值較高和較低基因的ENC值較低，這部分基因遠(yuǎn)離標(biāo)準(zhǔn)曲線，密碼子使用偏性較強(qiáng)。分析顯示，近50%的基因ENC比值分布在GC3s的0.05～0.15組中，其次是-0.05～0.05組（表2），表明多數(shù)基因ENC觀察值與期望值偏差較大，辣椒密碼子偏性受GC3s影響較小，密碼子偏性受到堿基突變以外的其他因素的影響較大。

PR2-plot用于分析密碼子第3位嘧啶和嘌呤的比例關(guān)系[19]。多數(shù)基因偏向分布在第4象限（圖4），說明密碼子第3位T的使用頻率高于A，G的使用頻率高于C，與基因組編碼基因第3位上4種核苷酸的分布一致，表明辣椒基因密碼子除了受突變影響外，也受到了選擇等其他因素的影響。

對(duì)應(yīng)性分析顯示，數(shù)值較高的第1軸和第2軸分別解釋了6.89%和4.00%的變異，各軸占比均較小，各基因均遠(yuǎn)離0.5的中心位置（圖5），表明密碼子偏性受到多種因素的影響。A和T結(jié)尾的密碼子主要分布在第1和第4象限且靠近坐標(biāo)軸的位置，C結(jié)尾的密碼子主要分布在第3象限，G結(jié)尾的密碼子主要分布在第1和第2象限，表明除堿基突變外，密碼子的使用偏性更多的受到自然選擇等其他因素的影響。

2.3 最優(yōu)密碼子分析

根據(jù)ENC值大小，分別選取5%基因構(gòu)建HEG庫和LEG庫，并對(duì)辣椒全基因組基因、HEG組、 LEG組和各組織器官中高表達(dá)基因（分別選取5%比例）的RSCU進(jìn)行分析（表3）。共發(fā)現(xiàn)22個(gè)高頻密碼子，其中21個(gè)（除甘氨酸密碼子GGA）為最優(yōu)密碼子，分別以T、A或G結(jié)尾，其中以T、A和G結(jié)尾的分別占66.7%、23.8%和9.5%。分析發(fā)現(xiàn)，最優(yōu)密碼子中丙氨酸密碼子GCA、半胱氨酸密碼子TGT、苯丙氨酸密碼子TTT、組氨酸密碼子CAT、天冬氨酸密碼子AAT、蘇氨酸密碼子ACA和絡(luò)氨酸密碼子TAT，在各組織器官和發(fā)育時(shí)期高表達(dá)基因中RSCU值略低于基因組總體密碼子RSCU值，尤其TGT、TTT和TAT的RSCU值低于1.20，表明這些最優(yōu)密碼子使用偏性相對(duì)較弱。而甘氨酸密碼子GGA在各組織器官高表達(dá)基因和基因組編碼基因中RSCU值均大于1.20，然而通過ENC值建庫的方法卻未能識(shí)別為最優(yōu)密碼子。說明僅通過ENC值來鑒定最優(yōu)密碼子的方法存在一定的缺陷，有必要結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行核實(shí)和驗(yàn)證。

2.4 密碼子使用性與基因表達(dá)的關(guān)系

基因序列水平上，ENC值小于50的基因有 13 432 個(gè)，基因平均表達(dá)量為29.89，ENC值大于50的基因有21 554個(gè)，基因平均表達(dá)量為33.59，這2組基因表達(dá)量無顯著差異（圖6-A），一些ENC值較高的基因，其組織表達(dá)水平并不低，表明基于ENC值劃分高表達(dá)基因和低表達(dá)基因存在一定的缺陷。密碼子水平上，T3、C3、A3、G3偏好基因所占比例分別為83.0%、1.2%、12.3%和3.5%，其中C3偏好基因的平均表達(dá)水平顯著較高，T3偏好基因的平均表達(dá)水平顯著較低（圖6-B），這與最優(yōu)密碼子分析結(jié)果不一致，可能是4類堿基第3位偏好基因的比例差異導(dǎo)致的，說明最優(yōu)密碼子只解釋基因組編碼基因的總體表達(dá)水平，而不代表單個(gè)基因的表達(dá)水平。T3偏好基因的平均表達(dá)水平較低，可能是大量不表達(dá)的假基因拉低了基因的平均表達(dá)水平。

3 討論與結(jié)論

密碼子使用偏性是生物體偏愛使用某些同義密碼子的現(xiàn)象，不同物種甚至同一物種的不同家族基因的密碼子使用性存在較大差異[20]。隨著大量物種基因組測(cè)序項(xiàng)目的完成，密碼子使用模式分析的研究引起了全球科學(xué)家的極大興趣[7]。本研究對(duì)辣椒編碼基因的密碼子使用偏性及其影響因素

進(jìn)行分析，以期為辣椒種質(zhì)資源的開發(fā)及遺傳育種提供參考。

堿基組成在植物的進(jìn)化過程中起著非常重要的作用。生物體因內(nèi)在代謝過程、外部環(huán)境條件以及進(jìn)化過程事件等的不同形成了不同的核苷酸組成特征[7]?；騁C含量可以影響密碼子偏性和氨基酸的組成，對(duì)多種植物基因組密碼子使用性分析發(fā)現(xiàn)，單細(xì)胞藻類的GC含量最高，雙子葉植物的GC含量最低，密碼子使用偏性的程度隨物種進(jìn)化而降低[7]。辣椒基因組編碼基因GC含量為4227%，與多數(shù)雙子葉植物一致，明顯低于藻類、禾本科和卷柏等植物，驗(yàn)證了物種間的關(guān)系越密切，GC含量越相似的結(jié)果[7]。大部分辣椒基因ENC值較大，說明辣椒密碼子使用偏性較低。堿基突變和自然選擇是基因密碼子偏性變異的主要進(jìn)化力量。在某種核苷酸含量極高的基因組中，突變壓力是影響同義密碼子使用模式的重要因素[21]。辣椒 ENC-plot、中性繪圖、PR2-plot和COA等密碼子使用性影響因素分析表明，辣椒基因密碼子偏性受到較小的堿基突變影響，可能更多地受到物種進(jìn)化和人工選擇作用等因素的影響。

基因組中，高表達(dá)基因優(yōu)先使用最優(yōu)密碼子以提高翻譯效率，而低表達(dá)基因使用最優(yōu)密碼子以外的密碼子以降低翻譯效率[22]。密碼子堿基組成影響宿主細(xì)胞對(duì)外源基因的表達(dá)，通過密碼子優(yōu)化，基因表達(dá)水平可提高1 000倍以上[23]。不同物種中最優(yōu)密碼子的種類有較大差異，水稻（Oryza sativa）、玉米（Zea mays）等單子葉植物偏好以G或C結(jié)尾，而擬南芥（Arabidopsis thaliana）、煙草（Nicotiana tabacum）等主要以A或T結(jié)尾，有的也以G或C結(jié)尾[24]，寄生植物南方菟絲子高表達(dá)基因傾向于使用G或C結(jié)尾的密碼子[4]。隨著物種的進(jìn)化，基因密碼子偏性降低，低等植物更需要優(yōu)化密碼子，而高等植物需要較少的密碼子優(yōu)化[7]，這是因?yàn)榕c低等植物相比，高等植物的基因表達(dá)受到順式作用元件、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、mRNA穩(wěn)定性、選擇性剪切等多種因素的調(diào)節(jié)[25]。辣椒平均ENC值為50.79，顯示大部分辣椒基因在序列水平上具有較低的表達(dá)潛力，然而，也發(fā)現(xiàn)一些ENC值較高的基因，其組織表達(dá)水平并不低，說明在高等植物中，基因表達(dá)受到多種因素的調(diào)節(jié)，僅以ENC值高低預(yù)測(cè)基因表達(dá)水平存在較大缺陷。辣椒中21個(gè)最優(yōu)密碼子分別以T、A或G結(jié)尾，結(jié)果與大部分雙子葉植物一致。研究也發(fā)現(xiàn)，鑒定的最優(yōu)密碼子TGT、TTT和TAT在各組織器官高表達(dá)基因的RSCU值并未達(dá)到1.20的閾值。因此，對(duì)辣椒進(jìn)行基因工程操作時(shí)，密碼子優(yōu)化還需結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行應(yīng)用。

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