羅建興 劉國強 其勒木格 郭梁

摘要：采用羧基熒光素（FAM）和六氯熒光素（HEX）熒光基團標記探針，建立針對農(nóng)作物中常見抗蟲和抗除草劑基因的雙重實時熒光PCR檢測方法，通過特異性、檢出限以及模擬摻假試驗驗證此方法在轉(zhuǎn)基因檢測中的適用性。特異性檢測試驗中僅轉(zhuǎn)基因作物（轉(zhuǎn)基因棉花、轉(zhuǎn)基因水稻、轉(zhuǎn)基因大豆）和陽性質(zhì)粒檢測出相應轉(zhuǎn)基因成分，其余樣品均未出現(xiàn)明顯PCR擴增曲線;檢出限結果表明，雙重實時熒光PCR方法對Cry1A（c）、CP4-EPSPS基因的檢出限分別為1、0.1 ng，所建立的標準曲線r2值均大于0.98，具有對農(nóng)作物中的轉(zhuǎn)基因成分進行定量檢測的能力;模擬摻假檢測顯示此方法可檢測到1%的Cry1A（c）和5%的CP4-EPSPS轉(zhuǎn)基因成分。綜上所述，本試驗建立的雙重實時熒光PCR法適用于對Cry1A（c）和CP4-EPSPS轉(zhuǎn)基因成分的快速檢測和定量分析。

關鍵詞：轉(zhuǎn)基因;Cry1A（c）基因;CP4-EPSPS基因;雙重實時熒光PCR;特異性;檢出限;模擬摻假

中圖分類號：TS207.3 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2022）05-0023-05

收稿日期：2021-04-16

基金項目：錫林郭勒職業(yè)學院重點科研項目（編號：ZD-2020-04、ZD-2019-01）。

作者簡介：羅建興（1993—），男，陜西榆林人，主要從事食品安全檢測和風險評估及轉(zhuǎn)基因成分檢測研究。E-mail：ljxylyh@126.com。

通信作者：郭 梁，博士，主要從事轉(zhuǎn)基因成分檢測和動物源性成分檢測以及微生物資源開發(fā)研究。E-mail：herdman86@163.com。

轉(zhuǎn)基因是指利用現(xiàn)代生物技術，將一些有利于人類生產(chǎn)生活的外源基因?qū)雱游铩⒅参锘蛭⑸镏?，通過對生物體內(nèi)DNA分子修飾改造達到改變原物種遺傳性狀的目的，從而使原物種獲得本不具備的優(yōu)良品質(zhì)和特性[1-2]。1996年轉(zhuǎn)基因煙草的商業(yè)化種植，標志著全球轉(zhuǎn)基因商業(yè)化時代正式到來[3]。由于轉(zhuǎn)基因具有提高產(chǎn)量、改善產(chǎn)品品質(zhì)、抗蟲、抗氧化劑、抗逆、性狀優(yōu)良等特性，全球都加大了對轉(zhuǎn)基因作物的種植[4-6]。有研究表明，截至2018年年底，全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積已達到1917億hm2[7]。據(jù)有關機構預計，2020年轉(zhuǎn)基因食品帶來的生物經(jīng)濟將直接達15萬億美元，從而成為保持經(jīng)濟可持續(xù)發(fā)展的中堅力量[8]。

轉(zhuǎn)基因技術在農(nóng)作物上的廣泛應用不僅帶動了全球經(jīng)濟發(fā)展，同時也產(chǎn)生了巨大社會效益，但任何技術的發(fā)展和進步都離不開風險管理。目前，一些人認為轉(zhuǎn)基因農(nóng)產(chǎn)品在營養(yǎng)成分、毒理性、潛在致敏性等多方面存在食品安全風險，會對環(huán)境及人類健康產(chǎn)生巨大影響[9-11]。20世紀90年代有研究表明，斑蝶幼蟲在食用轉(zhuǎn)基因馬利筋草后，產(chǎn)生了40%以上的死亡率[12]。同時代的英國研究者給大鼠投食轉(zhuǎn)基因馬鈴薯，最終導致大鼠免疫系統(tǒng)受損，身體發(fā)育出現(xiàn)異常[11]。此類事件的發(fā)生間接推動了轉(zhuǎn)基因檢測技術的發(fā)展，目前針對轉(zhuǎn)基因的檢測技術主要分為3個方面，即基于核酸、蛋白[13]及小分子代謝物[14]的檢測。由于核酸本身的穩(wěn)定性相比蛋白和小分子代謝物較強，在各種產(chǎn)品加工過程中穩(wěn)定、不易降解，同時制備過程簡單、成本低[15-16]。因此，目前的檢測技術尤以基于核酸檢測居多，核酸檢測應用較為廣泛的主要是PCR技術。傳統(tǒng)PCR只能對單一基因進行檢測，在一定程度上具有檢測通量低的缺陷，而多重PCR雖具有擴增多重靶標的特點，但在后續(xù)電泳檢測試驗中卻很難對一些大小相近的DNA片段進行區(qū)分[17]。而熒光定量PCR由于特異性強、靈敏度高、無交叉污染且高通量的特點成為目前轉(zhuǎn)基因檢測的有效主流技術[3]。

Cry1A（c）和CP4-EPSPS分別是轉(zhuǎn)基因植物中常見的抗蟲和抗除草劑基因[18]，在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)生活中對農(nóng)作物的優(yōu)良品質(zhì)和高產(chǎn)等起著非常重要的作用。其中，Cry1A（c）是蘇云金芽孢桿菌的一種殺蟲晶體蛋白，自然界的一些敏感幼蟲在吞食附帶有該蛋白的農(nóng)作物后會形成活性毒素，最終導致昆蟲因滲透壓失衡死亡，該轉(zhuǎn)基因技術目前已廣泛應用于現(xiàn)代農(nóng)林衛(wèi)生害蟲防治[19]。CP4-EPSPS是一種抗除草劑草甘膦基因，能夠消除田間雜草，降低人工成本[20]，目前沒有Cry1A（c）和CP4-EPSPS同步檢測的研究和應用。因此，本試驗通過建立雙重實時熒光PCR檢測方法對植物中Cry1A（c）和CP4-EPSPS轉(zhuǎn)基因成分進行檢測，以期為轉(zhuǎn)基因食品安全檢測提供高效的檢測手段和方法，從而保證食品的安全性和民眾知情權。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

3種轉(zhuǎn)基因試驗樣品（轉(zhuǎn)基因棉花、轉(zhuǎn)基因大豆、轉(zhuǎn)基因水稻）由從事轉(zhuǎn)基因基礎研究的實驗室提供;8種普通非轉(zhuǎn)基因作物（棉花、水稻、大豆、玉米、小麥、苜蓿、白菜及煙草）于錫林浩特市本地農(nóng)貿(mào)市場及超市采購。

TransStart Probe qPCR SuperMix購自北京全式金生物技術有限公司;qPCR引物和探針委托北京睿博興科生物技術有限公司進行合成;DNA提取試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司。

高速臺式離心機（型號為5418R），德國艾本德股份公司（Eppendorf AG公司）;核酸蛋白測定儀（型號為Nanodrop 2000c），美國Thermo Fisher Scientific;實時熒光PCR儀（型號為7300Plus），美國ABI公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物和探針的設計與合成 參考GB/T 19495.4—2018[21]用熒光基團FAM和HEX分別標記Cry1A（c）和CP4-EPSPS探針并委托北京睿博興科公司合成引物和探針，2種基因引物與探針序列見表1。

1.2.2 試驗樣品基因組DNA的提取與純化 采用溴化十六烷三甲基銨（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）法提取DNA，并加適量的滅菌雙蒸水溶解樣品DNA。經(jīng)核酸蛋白分析儀測定濃度后，將試驗樣品DNA終濃度稀釋至約100 ng/μL，且使D260 nm/D280 nm為1.8～2.0，保存于-20 ℃冰箱備用。

1.2.3 陽性質(zhì)粒DNA的提取 本實驗室具有事先經(jīng)過驗證且特異性及可靠性檢測結果均良好的陽性質(zhì)粒pCry1A（c）和pCP4-EPSPS，能夠在試驗中起到陽性對照的作用，按DNA提取試劑盒所述步驟提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)核酸蛋白分析儀測定濃度后，將其終濃度稀釋為0.5 ng/μL，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 實時熒光PCR反應體系及條件 反應體系（總體系20 μL）：上下游引物各1 μL，探針1 μL，模板DNA1 μL，TransStart Probe qPCR SuperMix 10 μL，補水至20 μL。反應條件：94 ℃預變性30 s;94 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，40個循環(huán)，在每次循環(huán)退火時采集熒光信號。

1.2.5 特異性檢測試驗 以“1.1”節(jié)所示試驗樣品的DNA及“1.2.3”節(jié)提取的2種轉(zhuǎn)基因陽性質(zhì)粒DNA為模板，按照上述PCR反應體系加樣，對設計和合成引物及探針進行特異性檢測試驗。根據(jù)典型擴增曲線和各反應體系循環(huán)閾值的差異驗證Cry1A（c）和CP4-EPSPS這2種基因引物和探針對于不同樣品DNA模板的特異性。

1.2.6 檢出限檢測試驗及定量分析 將質(zhì)量濃度同為10 ng/μL的轉(zhuǎn)基因棉花和轉(zhuǎn)基因大豆等體積混合，加滅菌雙蒸水對混合DNA原液進行10倍梯度稀釋，使各梯度DNA模板質(zhì)量濃度分別為10、1、0.1、0.01、0.001、0.000 1、0.000 01 ng/μL，然后按照反應體系加樣進行熒光定量PCR擴增反應，通過反應測定試驗的檢出限。根據(jù)檢出限分析結果制作標準曲線，對DNA樣品中的轉(zhuǎn)基因成分作定量分析。

1.2.7 模擬摻假檢測試驗 將同濃度轉(zhuǎn)基因作物DNA與其非轉(zhuǎn)基因作物DNA（轉(zhuǎn)基因棉花+普通非轉(zhuǎn)基因棉花、轉(zhuǎn)基因大豆+普通非轉(zhuǎn)基因大豆）按不同體積進行混合，使轉(zhuǎn)基因作物成分百分含量分別為0.1%、1%、5%、10%，然后按照實時熒光PCR反應體系及程序進行模擬摻假試驗檢測，以檢驗引物和探針在轉(zhuǎn)基因作物摻假檢測試驗中的適用性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

通過試驗儀器自帶軟件處理和分析檢測結果，數(shù)據(jù)均以“平均值±標準差”表示。

2 結果與分析

2.1 特異性檢測

利用雙重實時熒光PCR技術對Cry1A（c）和CP4-EPSPS基因引物和探針進行特異性檢測，檢測結果如表2和圖1所示?？梢钥闯觯D(zhuǎn)基因棉花和轉(zhuǎn)基因水稻中均檢測出Cry1A（c）基因，轉(zhuǎn)基因大豆中檢測出CP4-EPSPS基因，在混合陽性質(zhì)粒中2種基因均有檢出，以上試驗結果循環(huán)數(shù)（CT值）的標準差均在0.1～1之間，且擴增曲線具有很好的平行度（每個樣品3個平行反應），說明試驗檢測結果較好，而對于其他樣品的檢測無明顯特異性擴增曲線，進一步說明設計引物及探針對于不同檢測樣品的特異性。

2.2 檢出限檢測與定量分析

特異性檢測試驗表明，轉(zhuǎn)基因棉花和轉(zhuǎn)基因大豆中分別含有Cry1A（c）和CP4-EPSPS基因，將上述2種樣品DNA進行同濃度等體積混合，并進行梯度稀釋，得到質(zhì)量濃度分別為10、1、0.1、0.01、0001、0.000 1、0.000 01 ng/μL的樣品，以不同濃度樣品DNA為模板（每個濃度樣品6個平行反應），通過雙重實時熒光PCR檢測以測定引物和探針的檢出限，相應的CT檢測結果如表3所示，擴增曲線見圖2，以擴增結果CT≤35次時判定為確認檢出?？梢钥闯觯珻ry1A（c）、CP4-EPSPS基因在混合DNA中的檢出限分別為1、0.1 ng，試驗使用△CT法進行相對定量，檢出限試驗結果顯示DNA濃度的對數(shù)值與其對應的CT值呈線性關系，然后以模板DNA濃度的對數(shù)值為橫軸、CT值為縱軸得到回歸方程，結果見圖3。既得2種基因的標準曲線方程如下：Cry1A（c），y=-3.682x+53.86，r2=0983 6;CP4-EPSPS，y=-2.616x+47.69，r2=0.987 2。由于雙重擴增2個基因的r2顯示標準曲線呈明顯線性相關，說明該方法可適用于轉(zhuǎn)基因作物中Cry1A（c）和CP4-EPSPS這2種基因的雙重檢測。

2.3 模擬摻假檢測

試驗將同濃度轉(zhuǎn)基因作物DNA與非轉(zhuǎn)基因作物DNA按一定比例混合來模擬摻假檢測，摻假組合為轉(zhuǎn)基因棉花+非轉(zhuǎn)基因棉花（組合1）、轉(zhuǎn)基因大豆+非轉(zhuǎn)基因大豆（組合2），按比例混合使混DNA中轉(zhuǎn)基因成分含量為0.1%、1%、5%、10%，利用雙重實時熒光PCR技術進行檢測，檢測結果見表4。以擴增結果CT≤35次時判定為確認檢出，由此可知，組合1中針對Cry1A（c）基因的檢測在摻假試驗中能夠檢測到1%的轉(zhuǎn)基因棉花成分，針對CP4-EPSPS基因的檢測因組合1樣品中不含有該轉(zhuǎn)基因成分，因此未檢測到（圖4）。綜上所述，本試驗建立的雙重實時熒光PCR方法適用于對摻假樣品中的轉(zhuǎn)基因成分檢測。同理，組合2中針對CP4-EPSPS基因的檢測在試驗中能夠檢測到5%的轉(zhuǎn)基因大豆成分，相較組合1，其檢測結果較差。

3 結論與討論

本試驗在特異性檢測過程中以水作為空白對照，并且增加了提取空白的特異性檢測，進一步加強了試驗檢測的完整性，在對試驗材料的檢測中，僅在陽性質(zhì)粒及轉(zhuǎn)基因作物檢出轉(zhuǎn)基因成分，其他普通非轉(zhuǎn)基因樣品中并未檢出轉(zhuǎn)基因外源基因，說明試驗引物和探針具有較好的特異性，能夠滿足對轉(zhuǎn)基因定性檢測。對樣品原液梯度稀釋進行檢出限檢測，結果表明，Cry1A（c）、CP4-EPSPS基因在混合DNA中的檢出限分別為1、0.1 ng，以CT值為縱軸、模板DNA濃度的對數(shù)值為橫軸制作標準曲線，線性回歸方程r2均大于0.98，說明檢測結果能夠較好地對外源轉(zhuǎn)基因進行定量分析。模擬摻假在一定程度能夠?qū)z測方法或技術的適用性進行評估和檢驗，本試驗顯示，雙重實時熒光PCR法對轉(zhuǎn)基因成分的檢測分別為1%[Cry1A（c）]和5%（CP4-EPSPS），一定程度上能滿足實際檢測需求。

2017年的國際農(nóng)業(yè)生物技術應用服務組織（ISAAA）數(shù)據(jù)顯示，1996—2016年20年間轉(zhuǎn)基因共使農(nóng)作物增產(chǎn)6.576億t[22]，全球轉(zhuǎn)基因種植面積的逐年增加使得轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品在市場上的份額也越來越大，這都給轉(zhuǎn)基因檢測帶來了巨大的挑戰(zhàn)。同時，由于基因元件的復雜性和轉(zhuǎn)基因作物的多樣性加大了轉(zhuǎn)基因檢測的難度和需求。2009年，吳珊等對大豆產(chǎn)品外源基因做了普通PCR、熒光定量PCR及微流控芯片等3種方法的靈敏度檢測比較，結果顯示，普通PCR對于個別基因存在無法檢測到或凝膠條帶較弱的情況，根據(jù)普通PCR和凝膠檢測結果容易造成假陰性。熒光PCR和微流體芯片技術檢測則不存在此類問題，且檢測結果更好，靈敏度和檢測效率也更高[23]。王穎等也對普通PCR和熒光PCR檢測轉(zhuǎn)基因成分進行了比較[24]，得出了相同的結論。尹全等利用多重PCR對進口轉(zhuǎn)基因玉米進行篩查檢測，通過構建的基因元件信息矩陣表得出，必須檢測2個或2個以上基因才能夠?qū)ν晃锓N不同品系的轉(zhuǎn)基因作物達到檢測的目的[25]。相比常規(guī)PCR技術，多重PCR可以對多個靶基因片段進行檢測，不僅打破常規(guī)PCR因引物受限只能檢測1個目的片段的局限，還大幅提高了檢測的效率，能夠較好地滿足對多個轉(zhuǎn)基因品種的檢測需求。本試驗雙重實時熒光PCR技術對農(nóng)作物中Cry1A（c）和CP4-EPSPS轉(zhuǎn)基因成分檢測方法，相比于多重PCR不僅檢測準確性、靈敏度更高且能夠根據(jù)標準曲線進行相對定量。

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