柯吳堅， 冷欣穎， 劉雅慧， 陳嶸祎， 陳征宇， 張曉輝， 王柳苑， 廖玉英， 梁春梅， 陳慧茹， 龍?，?， 吳育嬌， 楊立剛， 楊斌

南方醫(yī)科大學皮膚病醫(yī)院，廣東 廣州 510091

神經(jīng)梅毒(neurosyphilis, NS)是由梅毒螺旋體(Treponemapallidum, Tp)侵入宿主中樞神經(jīng)系統(tǒng)所致的一組臨床綜合征[1-3]。NS在一般人群中的發(fā)病率為0.47/10萬～2.1/10萬，而在梅毒患者中的患病率是一般人群的857～3 830倍[4-6]。NS確診往往需要行腰椎穿刺術(shù)[7-9]，該方法不僅有創(chuàng)，且手術(shù)成本遠高于抽血檢測費用。因此是否可以通過血液學檢測用于NS診斷，從而減少甚至避免患者接受腰椎穿刺術(shù)成為臨床研究熱點。研究發(fā)現(xiàn)：Tp通過多種黏附蛋白(如TP0136)黏附宿主細胞外基質(zhì)；TP0136蛋白根據(jù)是否含有TprK供體區(qū)的不同，分為含TprK供體區(qū)的Nichols Seattle亞型和不含TprK供體區(qū)的Nichols Houston亞型；不同亞型的TP0136在黏附宿主細胞外基質(zhì)作用中存在差異；不同亞型TP0136在兔皮損中的轉(zhuǎn)錄水平和誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生的抗體水平存在顯著差異[10-16]。結(jié)合前期研究成果，本研究分別選用兩個具有代表性的TP0136亞型Nichols Seattle TP0136(NST)和Nichols Houston TP0136(NHT)作為研究對象，通過建立NS臨床隊列，評估兩種亞型的TP0136在NS血液中的診斷價值，以期發(fā)現(xiàn)潛在的NS血液學診斷標志物，從而實現(xiàn)降低NS患者腰穿率的目的。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2016年1月—2021年12月南方醫(yī)科大學皮膚病醫(yī)院生物樣本庫中收集的門診和住院部NS和非神經(jīng)梅毒的梅毒患者(NNS)血清或血漿樣本180例，其中NS血清或血漿樣本60例、NNS血清或血漿樣本120例。NS和NNS定義參考我國、美國和歐洲梅毒指南[7-9,17]。所有臨床實驗均經(jīng)南方醫(yī)科大學皮膚病醫(yī)院臨床管理及使用委員會批準(GDDHLS-20171004)，并參照臨床試驗管理和使用指南進行操作。

1.2 方法

1.2.1 兩種不同亞型TP0136序列分析和引物設(shè)計 序列分析和引物設(shè)計具體方法[14]如下：應(yīng)用引物設(shè)計軟件：Primer 3:WWW primer tool(http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi)對GenBank查詢的NST和NHT的開放閱讀框架(open reading frame,ORF)全長分別進行引物設(shè)計。用SignalP4.1 Server軟件(http://www.cbs. dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測NST和NHT信號肽，將NST和NHT ORF引物設(shè)計成不含信號肽引物。用Restriction Mapper(http://www.restric-tionmapper.org/)和NEBcutter V2.0. (http://tools.neb.com/NEBcutter2/)預(yù)判待擴增的DNA序列不被HindⅢ限制性內(nèi)切酶酶切。NST、NHT正向引物：5′-ATGACGTGCGATTTCACTGG-3′；NST反向引物：5′-ACTACGTAGATTTTCTGCAC-3′；NHT反向引物：5′-CTCGCGGTTCCAGGAGCACG-3′。NST和NHT的PCR擴增產(chǎn)物大小分別為1 260 bp和1 389 bp。

1.2.2 NST和NHT ORF擴增和鑒定 常規(guī)PCR法擴增南方醫(yī)科大學皮膚病醫(yī)院生物樣本庫中經(jīng)兔睪丸傳代培養(yǎng)[16]獲得的NST和NHT ORF DNA。50 μL PCR擴增反應(yīng)試劑含：5 μL待檢測DNA樣本、200 μM dNTPs、5 μL 10 ×Go Taq PCR緩沖液(Promega)、1.5 mM MgCl2、0.6 μM NST或NHT引物、0.5 U熱啟動Taq PCR聚合酶(Promega)。擴增條件：95 ℃變性10 min；95 ℃ 1 min、60 ℃ 2 min、72 ℃ 1 min，共45個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。擴增PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。成功擴增的NST和NHT ORF PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)雙向DNA測序法(上海生工)進行測序驗證。測序結(jié)果用BIOEDIT軟件(http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html)與GenBank中的TP0136氨基酸和核苷酸序列進行比對分析。

1.2.3 NST和NHT ORF pEXP-5-CT表達載體的構(gòu)建 成功擴增并經(jīng)測序鑒定合格的NST和NHT ORF PCR擴增產(chǎn)物克隆至pEXP-5-CT的表達載體(Invitrogen)，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到TOP10感受態(tài)細胞(Invitrogen)。挑選10個菌落，用常規(guī)PCR法(同步驟2)驗證轉(zhuǎn)化子。取轉(zhuǎn)化正確的轉(zhuǎn)化子搖菌過夜，Plasmid Mini試劑盒(Qiagen)提取質(zhì)粒。雙向DNA測序法(同步驟2)對質(zhì)粒進行測序驗證。

1.2.4 NST和NHT ORF重組蛋白的表達和純化 將經(jīng)測序驗證正確的NST和NHT 全長ORF pEXP-5-CT表達載體轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌Rosetta細胞(MerckKGaA)。取轉(zhuǎn)化正確的轉(zhuǎn)化子搖菌過夜。用SDS-PAGE和含6×His標簽的Western Blot檢測表達蛋白。將不可溶性蛋白NST和NHT分別經(jīng)超聲波處理器GEX130(Cole-Parmer)對重懸沉淀進行超聲處理。超聲處理后，離心去上清，加 6 M鹽酸胍進行重懸。在4 ℃磁力攪拌器上孵育過夜。用Sorvall RC-5B冷凍超高速離心機(Thermo Scientific)離心回收上清液。上清液經(jīng)含Ni-NTA瓊脂糖(Qiagen)的親和層析柱(Bio-Rad)純化。將SDS-PAGE驗證最純凈的不含污染物洗脫液置于透析盒(Thermo Scientific)透析。透析液為含有逐漸減小濃度的鹽酸胍(從3、1.5、1、0.5到0 M)的1×PBS緩沖液。通過離心分離將透析后再次重折疊的可溶性蛋白從沉淀中分離出。NST和NHT ORF重組蛋白經(jīng)BCA定量測定后儲存于-80 ℃。

1.2.5 NS和NNS患者NST和NHT抗體測定 采用ELISA法檢測:96孔酶標板分別經(jīng)NST和NHT重組蛋白包被后，用3%脫脂牛奶封閉。每孔分別加入NS或NNS患者血清或血漿，每個樣本重復(fù)檢測3次。陰性對照為非梅毒感染患者血清，陽性對照為梅毒感染者血清。4 ℃孵育后PBST洗板。每孔加羊抗人IgG堿性磷酸酶結(jié)合物二抗(Sigma)，室溫孵育后PBST洗板。加入顯影緩沖液pNPP(Sigma)后，酶標儀MAX250(Molecular Devices)405 nm讀板。

2 結(jié)果

2.1 NS和NNS患者一般情況比較

由表1可見，60例NS患者與120例NNS患者兩組之間年齡、性別、來源地、職業(yè)均無統(tǒng)計學差異(均P>0.05)；而婚姻狀況、神經(jīng)系統(tǒng)癥狀、血清或血漿TRUST和TPPA 滴度、血清或血漿TP-IgM陽性率、腦脊液TRUST和TPPA 滴度均有統(tǒng)計學差異(均P<0.05)。

2.2 NST和NHT重組蛋白在NS、NNS患者血清或血漿中TP0136抗體水平比較

NST和NHT ORF重組蛋白經(jīng)Western Blot檢測，分別在46 100 Da和51 700 Da可見NST和NHT全長ORF蛋白。應(yīng)用ELISA法檢測兩組重組蛋白在NS和NNS患者血清或血漿的TP0136抗體水平，經(jīng)獨立樣本t檢驗分析(表2)，NST在NS組和NNS組抗體水平無統(tǒng)計學差異(t=0.15，P=0.920)；NHT在NNS組抗體水平高于NS患者，差異有統(tǒng)計學意義(t=3.68，P=0.021)。

表1 NS和NNS的人口統(tǒng)計學和臨床特征Table 1 Demographic and clinical characteristics of the patients with neurosyphilis and non-neurosyphilis

表2 NST和NHT重組蛋白在NS、NNS患者血清或 血漿中TP0136抗體水平比較 (mean±SD)Table 2 Comparison of TP0136 antibody levels of NST and NHT recombinant proteins in the serum or plasma of patients with neurosyphilis and non-neurosyphilis (mean±SD)

3 討論

TP0136蛋白可與血漿纖連蛋白結(jié)合[18-19]，還可黏附細胞纖連蛋白，其中TP0136 NH2端作為保守區(qū)，是重要的黏附作用區(qū)；而在可變的COOH端，Nichols Dallas株和Nichols Seattle株的TP0136氨基酸序列存在TprK插入?yún)^(qū)[12]。該插入?yún)^(qū)含可變區(qū)V3、V6和V7，在Tp免疫逃逸中發(fā)揮重要作用[20]，從而提示不同亞型TP0136異質(zhì)性在Tp免疫逃逸甚至最終形成慢性持續(xù)性感染中具有重要作用。因此，本研究選用具有代表性的NST和NHT作為研究對象，經(jīng)表達純化后發(fā)現(xiàn)，由于NST存在TprK插入?yún)^(qū)，進而引起閱讀框移位和基因編碼提前終止，因此其堿基數(shù)為1 260 bp，少于不含TprK插入?yún)^(qū)NHT的1 389 bp。NST ORF最終表達和純化獲得的分子量為46 100 Da，低于NHT的51 700 Da。

為了明確TP0136是否具有免疫原性和免疫反應(yīng)性，有研究用重組蛋白TP0136對新西蘭白兔進行皮下免疫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TP0136免疫后可產(chǎn)生高滴度抗體[19]。然而不同亞型的TP0136蛋白誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生的特異性抗體是否存在差異以及其差異在臨床診斷中是否具有不同影響目前仍然未知。本研究首先建立NS研究隊列，發(fā)現(xiàn)在NS和NNS兩組患者的一般信息中，除了婚姻狀況存在差異(NS已婚組高于NNS，P<0.05)，年齡、性別、來源地和職業(yè)等信息均無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；而兩組患者的梅毒或NS相關(guān)指標，如有無神經(jīng)系統(tǒng)癥狀、血清或血漿TRUST和TPPA 滴度水平、血清或血漿TP-IgM陽性率、腦脊液TRUST和TPPA 滴度水平在NS組均高于NNS組，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。本研究結(jié)果與既往以有研究結(jié)果[21-23]一致，提示神經(jīng)系統(tǒng)癥狀、血液或腦脊液的高TRUST和TPPA 滴度水平、血液TP-IgM陽性等指標都可能是NS的風險因素。

為了探討TprK供體區(qū)在TP0136基因異質(zhì)性中是否具有臨床診斷價值，本研究采用ELISA法檢測發(fā)現(xiàn)，含有TprK供體區(qū)的NST在NS組和NNS組血清或血漿中抗體水平無差異；而不含TprK供體區(qū)的NHT在NNS組血清或血漿中抗體水平高于NS患者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。由于目前NS缺乏理想的血清學診斷標志物，比較NS與NNS患者血液中梅毒抗體水平，發(fā)現(xiàn)梅毒血清學中TPPA≥1∶10 240可以用于預(yù)測NS[24]。然而另一項研究卻提示血液中TPPA在識別腦脊液異常的敏感性僅為17.1%～22.2%[25]。以上結(jié)果提示，Tp特異性抗體可能具有NS診斷的潛質(zhì)。但其診斷敏感性不高，或許由于TPPA選用的抗原為Tp的超聲裂解物，包含大量Tp蛋白。在早期和晚期梅毒患者中，TP0136抗體水平存在顯著差異;進一步采用早期梅毒兔模型證實，與其他Tp黏附蛋白不同，TP0136轉(zhuǎn)錄水平分別在一期硬下疳和二期梅毒疹出現(xiàn)前兩次高表達[12-16]。以上結(jié)果提示TP0136在Tp感染和播散中具有作用。根據(jù)是否含有TprK供體區(qū)可對TP0136進行分型[15]。Tantalo等[26]通過采用不同Tp菌株感染新西蘭白兔，證實不同Tp菌株的神經(jīng)侵襲性存在差異。本次NS臨床隊列研究結(jié)果也進一步證實該假說，表明不同亞型TP0136蛋白的Tp在神經(jīng)系統(tǒng)侵襲性方面存在差異，最終可能導(dǎo)致疾病病程或轉(zhuǎn)歸的不同，其中不具有TprK供體區(qū)TP0136蛋白的Tp可能存在高神經(jīng)侵襲性作用，因此其誘導(dǎo)產(chǎn)生的特異性血液學抗體或可作為NS診斷的血液學標志物。

綜上所述，本研究通過建立NS隊列，評估NS患者中Tp黏附素蛋白TP0136的NST和NHT亞型抗體水平，初步發(fā)現(xiàn)NHT或可作為潛在NS診斷的血液學標志物，為后續(xù)減少NS患者腰穿率或避免腰穿提供血液學檢測研究基礎(chǔ)，也為進一步研究不同TP0136亞型的神經(jīng)侵襲性提供臨床理論基礎(chǔ)。