王志強(qiáng)，宮彩霞，李振彬

強(qiáng)直性脊柱炎(AS)是一種以骶髂關(guān)節(jié)和脊柱炎癥和結(jié)構(gòu)性損傷為特點(diǎn)的慢性系統(tǒng)性疾病[1]。疾病早期以骶髂關(guān)節(jié)炎、附著點(diǎn)炎和脊柱炎為主要表現(xiàn)，疾病后期因進(jìn)行性脊柱韌帶和小關(guān)節(jié)骨化，導(dǎo)致固定性胸腰椎后凸畸形[2]。目前，AS的主要治療目標(biāo)是通過(guò)控制炎癥和癥狀來(lái)維持患者正常軀體功能，防止進(jìn)行性結(jié)構(gòu)性損傷，改善遠(yuǎn)期生活質(zhì)量[3]。目前，臨床指南推薦AS一線治療藥物為非甾體類抗炎藥(NSAIDs)[4-5]。此外，糖皮質(zhì)激素、抗風(fēng)濕藥也是臨床常用的治療藥物[6]。雖然這些藥物有一定療效，但是長(zhǎng)期治療可能出現(xiàn)多種不良反應(yīng)[6]。臨床研究證實(shí)，中藥具有良好的抗炎、鎮(zhèn)痛效果，能有效緩解AS炎性癥狀、提高生活質(zhì)量[7-8]。本研究基于對(duì)AS不同病理階段的生物信息學(xué)分析，探討AS的發(fā)病機(jī)制，并篩選出可能有效的中藥成分，為進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。

1 研究方法

1.1AS不同病理階段靶點(diǎn)的收集和篩選 分別以“ankylosing spondylitis”、“sacroiliac arthritis(骶髂關(guān)節(jié)炎)”、“enthesitis(附著點(diǎn)炎)”、“spinal ligament ossification(脊柱韌帶骨化)”和“facet joint ossification(小關(guān)節(jié)骨化)”為關(guān)鍵詞，在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)檢索相應(yīng)的疾病靶點(diǎn)?！癮nkylosing spondylitis”、“sacroiliac arthritis”和“enthesitis”靶點(diǎn)取交集，獲得炎癥損傷階段靶點(diǎn)；“ankylosing spondylitis”、“spinal ligament ossification”和“facet joint ossification”靶點(diǎn)取交集，獲得結(jié)構(gòu)性損傷階段靶點(diǎn)。

1.2蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及分析 分別把炎癥損傷和結(jié)構(gòu)性損傷階段靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING平臺(tái)(https://string-db.org/，Version 11.0)[9]，蛋白種屬選擇“人類”，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，各參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置，用Cytoscape軟件(http://www.cytoscape.org/，Version 3.7.2)[10]實(shí)現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)可視化。利用Cytoscape軟件中的MCODE插件對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治觯胏ytoHubba插件獲得PPI網(wǎng)絡(luò)排名前10的核心靶點(diǎn)，各參數(shù)保持默認(rèn)。

1.3功能注釋和通路富集分析 使用R軟件(Version 3.6.1)通過(guò)ClusterProfiler包(Version 3.18.0)[11]對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)中經(jīng)MCODE分析獲得的評(píng)分最高的Cluster靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析，經(jīng)P<0.05、Q<0.05篩選后，取排名前20的生物學(xué)功能和通路進(jìn)行可視化處理。

1.4AS不同病理階段的中藥有效成分篩選 在中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php，Version 2.3)[12]檢索可作用于cytoHubba插件獲得的核心靶點(diǎn)的所有中藥有效成分，并以口服生物利用度(OB)≥30%和類藥性(DL)≥0.18作為進(jìn)一步篩選條件。

1.5分子對(duì)接 將篩選得到的中藥有效成分作為配體，目前指南推薦的NSAIDs、腫瘤壞死因子抑制劑和IL17A單抗的作用靶點(diǎn)PTGS2、TNF和IL17A作為受體，用Discovery Studio軟件(Version 16.1.0)的CDOCKER模式進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。中藥有效成分和靶點(diǎn)的3D結(jié)構(gòu)分別從PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)[13]和RCSB數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.rcsb.org/)[14]下載。

2 結(jié)果

2.1AS不同病理階段靶點(diǎn)的篩選 在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)獲得相應(yīng)靶點(diǎn)2123、251、241、1174和458個(gè)。取交集后，獲得炎癥損傷階段靶點(diǎn)103個(gè)，結(jié)構(gòu)性損傷階段靶點(diǎn)109個(gè)，見圖1。

圖1 AS不同病理階段靶點(diǎn)的篩選

2.2PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及分析 炎癥損傷階段的PPI網(wǎng)絡(luò)包括99個(gè)節(jié)點(diǎn)和1267條連線，結(jié)構(gòu)性損傷階段的PPI網(wǎng)絡(luò)包括107個(gè)節(jié)點(diǎn)和1916條連線，見圖2。經(jīng)MCODE插件進(jìn)行拓?fù)浞治龊?，炎癥損傷階段的PPI網(wǎng)絡(luò)共獲得7個(gè)Cluster，結(jié)構(gòu)性損傷階段的PPI網(wǎng)絡(luò)共獲得3個(gè)Cluster，見表1。利用cytoHubba插件獲得2個(gè)PPI網(wǎng)絡(luò)排名前10的核心靶點(diǎn)，其中炎癥損傷階段的核心靶點(diǎn)為IL6、TNF、IL10、CSF2、IL17A、IL1B、CXCL8、IFNG、TLR4、IL18，結(jié)構(gòu)性損傷階段的核心靶點(diǎn)為IL6、GAPDH、VEGFA、INS、CXCL8、CCL2、STAT3、TNF、IL1B、PTGS2。

表1 AS 2個(gè)病理階段PPI網(wǎng)絡(luò)的MCODE拓?fù)浞治鼋Y(jié)果

圖2 AS 2個(gè)病理階段的PPI網(wǎng)絡(luò)和核心靶點(diǎn)

2.3功能注釋和通路富集分析 對(duì)AS 2個(gè)病理階段PPI網(wǎng)絡(luò)經(jīng)MCODE拓?fù)浞治龊螅@得分值最高的43、42個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析。炎癥損傷階段靶點(diǎn)分別富集到生物過(guò)程(BP)1020個(gè)、細(xì)胞組分(CC)13個(gè)、分子功能(MF)30個(gè)、通路66條；結(jié)構(gòu)性損傷階段分別富集到BP 1866個(gè)、CC 16個(gè)、MF 47個(gè)、通路139條。2個(gè)病理階段排名前20的生物學(xué)功能和通路見圖3。在富集分析得到的信號(hào)通路中，AS 2個(gè)病理階段有高達(dá)65條相同的信號(hào)通路，其中排名前20的相同信號(hào)通路包括細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、炎性腸病、瘧疾、結(jié)核、甲型流感、百日咳、Chagas病、IL17、Th17細(xì)胞分化等。

圖3 AS 2個(gè)病理階段靶點(diǎn)的GO和KEGG通路富集分析

2.4AS不同病理階段核心靶點(diǎn)的中藥有效成分篩選 在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索，可作用于“2.2”中獲得的AS不同病理階段核心靶點(diǎn)的所有中藥有效成分。可同時(shí)作用于炎癥損傷階段5個(gè)以上核心靶點(diǎn)的中藥有效成分為槲皮素(6個(gè))和白藜蘆醇(5個(gè))，可同時(shí)作用于結(jié)構(gòu)性損傷階段5個(gè)以上核心靶點(diǎn)的中藥有效成分包括白藜蘆醇(8個(gè))、金雀異黃素(8個(gè))、槲皮素(7個(gè))、尼古丁(7個(gè))、熊果酸(6個(gè))、黃體酮(6個(gè))、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(5個(gè))、蘆丁(5個(gè))、漢黃芩素(5個(gè))、漆黃素(5個(gè))、楊梅黃酮(5個(gè))、雷公藤甲素(5個(gè))。上述中藥有效成分經(jīng)OB≥30%和DL≥0.18篩選后，槲皮素、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、漢黃芩素、漆黃素和雷公藤甲素符合要求。

2.5中藥有效成分與3種靶點(diǎn)蛋白的分子對(duì)接 將“2.4”中篩選得到的中藥有效成分作為配體，PTGS2、TNF和IL17A作為受體，Discovery Studio軟件分析結(jié)果顯示，所有配體均可穩(wěn)定地對(duì)接到受體的對(duì)接口袋中，見圖4。

圖4 篩選到的治療強(qiáng)直性脊柱炎有效中藥成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的對(duì)接模式圖

3 討論

在疾病后期，AS患者通常會(huì)出現(xiàn)脊柱固定性畸形，隨著進(jìn)行性胸椎后凸增大、腰椎前凸減小，最終導(dǎo)致全脊柱矢狀面失衡。對(duì)于AS患者來(lái)說(shuō)，嚴(yán)重的脊柱畸形不僅是一種外表和心理困擾，而且嚴(yán)重影響患者日常生活和工作質(zhì)量。近年研究發(fā)現(xiàn)，炎癥和結(jié)構(gòu)性損傷是AS脊柱活動(dòng)障礙的2個(gè)重要的生物學(xué)機(jī)制[1]。OASIS研究顯示，AS功能損傷受到患者疾病活動(dòng)性和腰頸椎結(jié)構(gòu)性損傷程度的影響[1]。脊柱的可逆性炎癥和不可逆性結(jié)構(gòu)性損傷導(dǎo)致AS患者脊柱活動(dòng)障礙。AS早期，脊柱活動(dòng)障礙更多歸因于炎癥，而結(jié)構(gòu)性損傷是后期病變的主要原因，脊柱韌帶和小關(guān)節(jié)進(jìn)行性骨化最終導(dǎo)致嚴(yán)重的脊柱后凸畸形[1]。然而，脊柱炎癥和結(jié)構(gòu)性損傷對(duì)AS最終脊柱畸形的“貢獻(xiàn)度”仍不明確[1]。

最近研究表明，IL23/IL17信號(hào)通路激活與附著點(diǎn)炎和附著點(diǎn)新骨形成有關(guān)[15-16]，IL17可以增強(qiáng)T細(xì)胞活化并刺激多種細(xì)胞產(chǎn)生促炎介質(zhì)[17]。NOD樣受體家族和NLRP3炎癥小體活性在多種炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，且NLRP3炎癥小體與AS易感性相關(guān)[18]。干擾素-γ(IFN-γ)是已知的Th1型細(xì)胞因子，是唯一的Ⅱ型干擾素。IFN-γ可拮抗Th2型細(xì)胞因子IL4和IL10的分泌，從而抑制Th2細(xì)胞反應(yīng)。有研究表明，IFN-γ表達(dá)與rs2430561基因多態(tài)性明顯相關(guān)，提示rs2430561等位基因可能調(diào)節(jié)IFN-γ表達(dá)，從而導(dǎo)致AS發(fā)生[19]。IL4通過(guò)調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化抑制AS發(fā)病[20]。因此，Th1/Th2細(xì)胞失衡也參與了AS的發(fā)病。骨代謝高度依賴于JAK2/STAT3介導(dǎo)的成骨細(xì)胞調(diào)控[21]。核因子-κB(NF-κB)參與了機(jī)體炎癥、免疫、細(xì)胞增殖和存活等多種重要過(guò)程[22]。NF-κB信號(hào)通路高活性會(huì)增加AS的患病風(fēng)險(xiǎn)[23]。TNF在AS發(fā)病中的作用尚未完全闡明，這是因其在AS炎癥損傷和結(jié)構(gòu)性損傷中的作用并不完全一致[24]。在炎癥損傷階段，TNF與NF-κB受體活化因子配體(RANKL)協(xié)同刺激破骨細(xì)胞形成，增強(qiáng)調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化和活性的蛋白酶降解從而抑制骨形成，同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞外消化酶表達(dá)。MMPs和蛋白聚糖酶可降解膠原蛋白、聚集蛋白聚糖及其他軟骨和椎間盤成分，促進(jìn)局部骨質(zhì)侵蝕。在結(jié)構(gòu)性損傷階段，TNF可同時(shí)激活NF-κB及其下游的BMPs、osterix、矮小相關(guān)基因2、骨鈣素和堿性磷酸酶促進(jìn)成骨分化。TNF對(duì)成骨細(xì)胞形成的作用取決于反應(yīng)細(xì)胞的濃度、暴露時(shí)間和分化狀態(tài)。此外，TNF還能通過(guò)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)直接或間接激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路。Wnt/β-catenin信號(hào)通路是一條調(diào)控成骨細(xì)胞分化的骨穩(wěn)態(tài)調(diào)控通路[24]。本研究生物信息學(xué)分析顯示，炎癥損傷階段和結(jié)構(gòu)性損傷階段均涉及上述重要信號(hào)通路，且2個(gè)階段富集通路有高達(dá)65條相同的通路，提示炎癥機(jī)制貫穿著AS的始終，炎癥長(zhǎng)期控制似乎是避免因結(jié)構(gòu)性損傷而導(dǎo)致殘疾的關(guān)鍵[25]。

根據(jù)AS 2個(gè)病理階段PPI網(wǎng)絡(luò)的核心靶點(diǎn)，本研究初步篩選出可用于炎癥損傷階段的中藥有效成分是槲皮素，可用于結(jié)構(gòu)性損傷階段的中藥有效成分包括槲皮素、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、漢黃芩素、漆黃素和雷公藤甲素。槲皮素能減輕關(guān)節(jié)炎小鼠的關(guān)節(jié)癥狀并降低TNF-α、IL1β、IL17和單核細(xì)胞趨化蛋白-1水平，還可通過(guò)調(diào)控NF-κB信號(hào)通路減輕炎癥反應(yīng)[26]。此外，槲皮素通過(guò)對(duì)RANKL/NF-κB受體活化因子/骨保護(hù)素信號(hào)通路、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路、Wnt/β-Catenin信號(hào)通路、BMPs和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)信號(hào)通路的調(diào)控來(lái)影響成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的發(fā)育和功能[27]。表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯可通過(guò)TLR4/NF-κB信號(hào)通路抑制脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)[28]，并能糾正AS模型大鼠Th1/Th2免疫失衡和促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡[29]；其還可能通過(guò)與雌激素受體相互作用進(jìn)而激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和骨向分化[30]。漢黃芩素可通過(guò)調(diào)控NF-κB、MAPK、TGF-β1/Smad3信號(hào)通路抑制炎癥反應(yīng)[31-32]，同時(shí)對(duì)破骨細(xì)胞分化有一定影響[33]。漆黃素通過(guò)上調(diào)RUNX2轉(zhuǎn)錄活性促進(jìn)成骨細(xì)胞分化[34]，通過(guò)阻斷RANKL誘導(dǎo)活性氧簇產(chǎn)生抑制破骨細(xì)胞分化[35]。雷公藤甲素是中藥雷公藤的主要活性成分，雷公藤甲素的抗炎和免疫抑制特性使其成為治療炎癥性疾病非常有前途的藥物。雷公藤甲素可減少炎性介質(zhì)的產(chǎn)生，減輕動(dòng)物模型及相關(guān)細(xì)胞系受損器官的氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞活性，還可通過(guò)對(duì)RANKL/RANK/OPG和NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控抑制破骨細(xì)胞炎癥活性[36]。因此，篩選出這些中藥有效成分對(duì)炎癥和骨形成過(guò)程有干預(yù)作用。經(jīng)初步的分子對(duì)接驗(yàn)證，上述中藥有效成分均可與目前指南推薦藥物的靶點(diǎn)穩(wěn)定對(duì)接。

綜上，根據(jù)AS不同病理階段生物信息學(xué)分析，初步篩選出一些潛在的中藥有效成分，為進(jìn)一步的藥物研發(fā)和疾病治療提供有意義的參考。