陳寅，欒和偉(江蘇省人民醫(yī)院句容分院檢驗科，江蘇句容 212400)

鮑曼不動桿菌是引起醫(yī)院內(nèi)感染的重要條件致病菌之一，容易引起醫(yī)院內(nèi)和醫(yī)院間的感染暴發(fā)流行和跨地區(qū)的水平傳播。鮑曼不動桿菌感染通常發(fā)生于身患嚴重疾病、正在接受侵襲性操作和免疫抑制劑治療以及抵抗力低下的患者，可引起呼吸道感染、傷口及術(shù)后感染、繼發(fā)性腦膜炎、敗血癥和尿路感染等。β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物特別是碳青霉烯類抗菌藥物，曾被認為是有效的治療藥物，廣泛用于控制鮑曼不動桿菌感染[1]。然而，近年來鮑曼不動桿菌對其耐藥率不斷上升，耐藥菌株在院內(nèi)甚至地區(qū)間存在播散，為醫(yī)院感染防控帶來挑戰(zhàn)。本研究通過對碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌耐藥基因和耐藥性進行分析，以期為碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌的有效治療提供參考。

1 資料與方法

1.1菌株來源 收集江蘇省人民醫(yī)院句容分院2019年1月—2020年12月臨床分離的對亞胺培南耐藥的鮑曼不動桿菌47例，質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853、鮑曼不動桿菌ATCC19606，均來源于衛(wèi)生部臨床檢驗中心?；颊吣挲g為26～96歲；其中，男性35例(74.5%)，女性12例(25.5%)；大于60歲患者33例(70%)。47株碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌來源于痰標本43株(91%)，來源于胸水、血液、尿液以及傷口分泌物各1株；來源于重癥監(jiān)護病房(ICU)23例(48.94%)，呼吸內(nèi)科10例(21.28%)，神經(jīng)外科6例(12.77%)，神經(jīng)內(nèi)科5例(10.64%)，骨科2例(4.26%)，腫瘤科1例(2.13%)。

1.2主要儀器與試劑 Vitek 2 Compact 全自動微生物分析系統(tǒng)及配套革蘭陰性菌鑒定GN卡和藥敏GN335卡(法國生物梅里埃公司)，血平板、麥康凱平板及巧克力平板(鄭州安圖生物公司)，PCR擴增儀(美國ABI公司)，電泳分析成像系統(tǒng)(上海復(fù)日科技公司)；細菌基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技公司)，PCR試劑、引物合成(上海邁浦生物科技有限公司)。

1.3細菌培養(yǎng)和藥敏試驗 菌株的分離、培養(yǎng)參照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》(第4版)[2]進行。微生物的鑒定和藥敏分析用Vitek 2 Compact全自動微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)及配套革蘭陰性菌鑒定GN卡和藥敏GN335卡。結(jié)果判定參照美國臨床和實驗室標準協(xié)會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)M100 2020年標準。

1.4耐藥基因檢測 引物設(shè)計參考文獻[3]，合成鮑曼不動桿菌耐藥基因blaKPC-2、blaNDM-1、blaIMP、blaVIM、blaGES、blaOXA-23、blaOXA-24、blaOXA-51和blaOXA-58引物，引物信息見表1。用細菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA。采用多重PCR法檢測菌株攜帶耐藥基因。PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括2×Taq Master Mix (Dye Plus)預(yù)混液10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，細菌模板2 μL，加雙蒸水補足體系至20 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳后，用凝膠成像系統(tǒng)分析。

表1 碳青霉烯酶基因的引物序列及擴增產(chǎn)物大小

1.5統(tǒng)計學分析 采用WHONET5.6軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，用Excel表進行最終敏感、中介和耐藥的計算。

2 結(jié)果

2.1藥敏試驗結(jié)果 47株碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌對亞胺培南等16這種臨床常用抗菌藥物的藥敏試驗結(jié)果見表2。所有菌株對碳青霉烯類抗菌藥物(亞胺培南和美羅培南)、β-內(nèi)酰胺酶抑制劑類抗菌藥物(替卡西林/克拉維酸、哌拉西林/他唑巴坦)、單環(huán)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物(氨曲南)以及三代頭孢菌素類(頭孢他啶)具有耐藥性。所有菌株對多肽類抗菌藥物黏菌素敏感；只有2株對四環(huán)素類替加環(huán)素有抗性(耐藥性4.2%)；磺胺類復(fù)方磺胺甲噁唑?qū)话氲木幸种菩Ч?敏感性46.8%)。

2.2基因檢測結(jié)果 47株碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌中，blaKPC-2、blaIMP、blaVIM以及blaGES基因檢測結(jié)果為陰性，2株檢出blaOXA-24(4.3%)，32株檢出blaOXA-58基因(68.1%)，38株檢出blaNDM-1基因(80.9%)，42株檢出blaOXA-23(89.4%)，47株檢出blaOXA-51基因(100%)。部分電泳結(jié)果見圖1、圖2。

表2 碳青酶烯類耐藥鮑曼不動桿菌對臨床常用抗菌藥物的耐藥性(%)

注：M，DL 2 000 DNA marker;1～2,空白對照;2～6，blaNDM-1基因陽性擴增產(chǎn)物，大小為982 bp。

注：M，DL 2 000 DNA marker;1，空白對照;2～5，blaOXA-51基因陽性擴增產(chǎn)物，大小為353 bp；6，ATCC 19606標準菌株。

3 討論

對碳青霉烯類藥物耐藥的鮑曼不動桿菌在世界范圍內(nèi)的廣泛流行，被世界衛(wèi)生組織列為對現(xiàn)代醫(yī)學構(gòu)成最大威脅的耐藥菌之一[4]。根據(jù)2018年CHINET數(shù)據(jù)顯示，鮑曼不動桿菌對亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別為77.1%和78.1%，是2006年耐藥率的近2倍[5]。本研究中耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌除黏菌素(耐藥率0)、替加環(huán)素(耐藥率4.2%)和米諾環(huán)素(耐藥率48.9%)外，對其他抗菌藥物的耐藥率>50%，建議使用聯(lián)合用藥，亞胺培南+多黏菌素E和米諾環(huán)素+多黏菌素E兩種組合對CRAB具有更好的抑菌效果[6]。本研究中的菌株70%為60歲以上患者，91%來源于痰標本，這可能與其傳播途徑和鮑曼不動桿菌的致病機制有關(guān)，因為鮑曼不動桿菌自身黏附能力極強，可以黏附在人體的不同組織和器官中引起感染，尤其是對人體的肺支氣管上皮細胞的親和力最高，因此極易通過外界氣體傳播或在支氣管插管、氣管切開等操作過程中進入呼吸道[7]，引起上呼吸道的感染[8]。文獻報道，老年多重耐藥鮑曼不動桿菌肺炎患者采用替加環(huán)素輔助治療，可有效改善患者的臨床癥狀，降低患者的炎癥因子水平，同時具有較高的藥物安全性[9]。

臨床分離耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌的耐藥機制復(fù)雜，與產(chǎn)生碳青霉烯酶、外排泵基因、整合子基因的大量表達均有關(guān)[3]。鮑曼不動桿菌耐藥機制中以產(chǎn)碳青霉烯酶為主。在耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌分離菌株中，與碳青霉烯水解酶相關(guān)的有A、B和D類碳青霉烯酶，A類中blaGES型分布中東地區(qū)，而blaKPC型罕見；B類為金屬β-內(nèi)酰胺酶，具有更強的水解活性[10]，其中blaIMP、blaVIM、blaNDM型在鮑曼不動桿菌中均有檢出；D類blaOXA型酶在對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥性中具有更重要的作用[11]。本研究中38株檢出blaNDM-1基因(80.9%)，42株檢出blaOXA-23基因(89.4%)，碳青霉烯酶流行情況同上述研究結(jié)果相同。blaOXA-51基因是鮑曼不動桿菌染色體攜帶的天然耐藥基因，多數(shù)學者認為blaOXA-51基因可以作為快速確定鮑曼不動桿菌的一個分子標記[12]，本研究結(jié)果也支持上述觀點，所有菌株均檢出blaOXA-51基因。此次分析的47株耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌blaOXA-23檢出率為89.4%，高于四川地區(qū)某院48 株碳青霉烯類鮑曼不動桿菌blaOXA-23檢出率70.8%[13]，說明不同區(qū)域、不同等級醫(yī)院耐藥基因的檢出率存在一定的差異，這可能于各個醫(yī)院的用藥習慣、抗菌藥物的限制和菌株流行情況有關(guān)。另外，本研究中38株檢出blaNDM-1基因，而攜帶blaNDM-1的細菌具有強大的致病力和耐藥性，對碳青霉烯類、β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類等抗菌藥物耐藥，需合理選擇抗菌藥物治療。在鮑曼不動桿菌中，blaNDM-1基因位于可移動元件質(zhì)粒上，攜帶blaNDM-1的鮑曼不動桿菌可通過質(zhì)粒接合，使其獲得部分耐藥性，該基因具有跨種屬轉(zhuǎn)移的能力，需加強對產(chǎn)blaNDM-1細菌的檢測，預(yù)防其暴發(fā)流行[14]。