林青松，呂燕霞，朱國慶，宮本法，馮四洲(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所，實驗血液學(xué)國家重點實驗室，國家血液病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津 300020)

半乳甘露聚糖(galactomannan, GM)為曲霉細胞壁的主要成分，是曲霉快速增長并釋放入血的標志性抗原，其釋放量和菌量呈正比，可以反映感染程度。2016年美國感染學(xué)會(IDSA)指南推薦，GM抗原檢測為惡性血液病和造血干細胞移植患者侵襲性曲霉病(invasive aspergillosis, IA)的精確標志物，敏感性和特異性均為70%～80%[1]。根據(jù)2019版歐洲癌癥研究和治療組織侵襲性真菌感染協(xié)作組/美國國立變態(tài)反應(yīng)和感染研究院真菌病研究組(EORTC/MSG)侵襲性真菌病指南的增刊，綜合考慮GM試驗敏感性和特異性，推薦血清GM檢測最佳閾值為1.0，并且對中性粒細胞減少的血液病患者敏感性最高，對兒科患者敏感性為81%，特異性為88%，與成人患者相似[2]。然而，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院血液病患者GM檢測陽性率僅有2%～3%，不能滿足臨床需求，這可能與血液病患者多經(jīng)驗治療給予廣譜三唑類抗真菌藥物預(yù)防有關(guān)[3]。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)曲霉IgG抗體檢測可以覆蓋多種曲霉感染類型，包括侵襲性肺曲霉病(invasive pulmonary aspergillosis, IPA)、慢性肺曲霉病(chronic pulmonary aspergillosis, CPA)和過敏性支氣管性肺曲霉病(allergic bronchopulmonary aspergillosis, ABPA)[4]。研究顯示，在非粒細胞缺乏的IPA患者中，曲霉IgG抗體陽性率為48.65%，顯著高于健康人對照組的16%[5]。為探討血清曲霉IgG抗體在血液病/惡性腫瘤患者IPA的臨床價值，進一步提高臨床IPA診斷準確率，本研究探討分析GM和曲霉IgG抗體檢測在IPA患者中的診斷價值。

1 材料與方法

1.1研究對象 收集2018年1月至2021年9月收集的中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院IPA臨床診斷患者24例作為疾病組。IPA診斷符合2008/2019年EORTC/MSG的標準及2017年“血液病/惡性腫瘤患者侵襲性真菌病的診斷標準與治療原則(第五次修訂版)”標準。IPA臨床診斷標準為：(1)具有至少一項宿主因素，例如中性粒細胞缺乏、異基因造血干細胞移植等；(2)CT檢查肺部影像學(xué)改變，符合感染特征；(3)痰培養(yǎng)曲霉、鏡下觀察有隔菌絲和G試驗檢測至少一項檢查結(jié)果為陽性；(4)在抗真菌治療后病情轉(zhuǎn)歸。臨床排除IPA感染的血液病/惡性腫瘤患者35例作為對照組，均無肺部影像學(xué)改變和微生物學(xué)證據(jù)。其中，疾病組男性16例，女性8例，年齡中位數(shù)(25分位數(shù)，75分位數(shù))為47.50(28.75，64.50)歲；對照組男性21例，女性14例，年齡30.00(19.00，46.00)歲。

1.2方法 抽取患者靜脈血5 mL，3 500 r/min離心10 min，取血清用于檢測。如24 h內(nèi)送檢，可置4 ℃保存，否則置-20 ℃保存，避免反復(fù)凍融。用ELISA法檢測曲霉GM抗原，試劑盒購自Bio-Rad公司；用ELISA法檢測曲霉IgG抗體，試劑盒購自丹娜(天津)生物科技股份有限公司。操作按照試劑盒說明書進行，每次試驗均設(shè)陽性、陰性對照。曲霉IgG抗體檢查結(jié)果判斷：抗體濃度≥80 AU/mL定為陽性；抗體濃度<80 AU/mL定為陰性。GM抗原結(jié)果判斷：≥0.5 μg/L為陽性，<0.5 μg/L為陰性。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 22.0和GraphPad 8統(tǒng)計軟件進行。不滿足正態(tài)分布的數(shù)值變量以中位數(shù)(25分位數(shù)，75分位數(shù))表示，組間差異比較采用非參數(shù)Mann-WhitneyU檢驗。ROC曲線下面積為95%置信區(qū)間(95%CI)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1臨床資料 24例臨床診斷的IPA患者中，急性髓系白血病為10例(占41.67%)；嗜中性粒細胞缺乏患者18例(占75%)。35例對照組患者中，再生障礙貧血患者16例(占45.71%)。見表1。

表1 疾病組和對照組患者基本資料[n(%)]

2.2曲霉IgG抗體和GM檢測結(jié)果 疾病組曲霉IgG抗體水平[98.12(47.29，407.92)AU/mL]顯著高于對照組[45.59(31.25，72.34)AU/mL]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-3.424，P<0.05)。疾病組GM抗原水平[0.23(0.13,0.52)μg/L]與對照組[0.15(0.12，0.24)μg/L]比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(Z=-1.777，P>0.05)。

2.3血清GM和曲霉IgG抗體檢測對血液病/惡性腫瘤患者IPA患者的診斷價值 血清曲霉IgG以80 AU/mL為臨界值時，敏感性、特異性分別為62.5%(15/24)、88.6%(31/35)。血清GM試驗臨界值為0.7 μg/L時，敏感性、特異性分別為12.5%(3/24)、100%(35/35)。血清曲霉IgG和GM檢測在IPA診斷曲線下面積分別為0.762和0.637。見圖1。

圖1 血清GM和曲霉IgG抗體檢測對血液病/惡性腫瘤患者IPA診斷價值的ROC曲線分析

3 討論

本研究顯示，24例納入臨床診斷的IPA患者主要為白血病患者。研究發(fā)現(xiàn)，白血病患者合并IPA的危險比器官移植和淋巴瘤患者高20倍，誘導(dǎo)化療后白細胞減少的患者中7.5%的感染為曲霉感染，且隨白細胞減少時間延長感染概率增加[6]。本研究結(jié)果顯示，18例疾病組患者白細胞和中性粒細胞減少，其中11例患者曲霉IgG抗體檢測陽性；6例患者為白細胞和中性粒細胞正?；蛘咧行粤＜毎?，其中4例患者曲霉IgG抗體均檢測陽性，其余2例患者曲霉IgG抗體檢測值較高(63.4 AU/mL和73.21 AU/mL)，接近陽性閾值(80 AU/mL)。

本研究中1例患者處于粒細胞缺乏狀態(tài)(中性粒細胞計數(shù)0.08×109/L)，曲霉IgG抗體的檢測顯示陽性，同時檢測值>500 AU/mL，遠遠高于檢測閾值，且未受到抗真菌治療的影響。本研究中，另3例曲霉IgG抗體檢測陽性患者中性粒細胞缺乏均1個多月，曲霉IgG抗體檢測值分別為114.62 AU/mL、>500 AU/mL和241.57 AU/mL，平均值為285.40 AU/mL。由此可見，盡管血液病/惡性腫瘤患者存在免疫抑制，但部分患者仍可以檢測出曲霉抗體。

曲霉抗體的產(chǎn)生即機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的過程，當機體受抗原GM刺激后，淋巴細胞特異性識別抗原分子，發(fā)生一系列反應(yīng)以排除抗原[7]。其中，固有免疫細胞(中性粒細胞)、固有免疫分子(補體、細胞因子等)對多種抗原物質(zhì)發(fā)生生理性排斥反應(yīng)。而T/B淋巴細胞對抗原的識別過程產(chǎn)生抗體，GM作為抗原由吞噬細胞吞噬處理后激活B細胞的漿細胞產(chǎn)生抗體或GM作為抗原直接刺激B細胞產(chǎn)生抗體[8]。因此，即使中性粒細胞缺乏或應(yīng)用過T細胞免疫抑制劑的患者也會產(chǎn)生免疫應(yīng)答，產(chǎn)生抗體。2015年版歐洲ERS-ESCMID CPA診斷與治療指南明確指出，曲霉IgG抗體檢測對空洞或結(jié)節(jié)的CPA患者為A級推薦[9]。2016年美國IDSA指南明確指出，曲霉IgG抗體檢測為CPA患者首選的微生物學(xué)證據(jù)[10]?；诖髷?shù)據(jù)研究，曲霉IgG抗體檢測在CPA患者的檢出率可達100%；在IA和ABPA患者的檢出率分別是65%[4]。本研究采用的曲霉IgG抗體檢測在血液病/惡性腫瘤患者IPA的臨床診斷具有重要意義，結(jié)果顯示血液病/惡性腫瘤患者IPA血清曲霉IgG抗體水平顯著高于對照組。

本研究中GM抗原檢測水平在疾病組和對照組中并未顯示出差異，且敏感性較低，只有12.5%，分析原因可能如下。(1)我院血液病患者多經(jīng)驗治療，給予廣譜三唑類抗真菌藥物預(yù)防。棘白菌素類藥物可以通過阻斷葡聚糖合成，唑類通過阻止真菌細胞膜麥角固醇合成，兩性霉素類與真菌細胞膜上的麥角固醇結(jié)合，使膜形成微孔，改變膜的通透性，使GM檢測的敏感性受到影響[11]。(2)入組的患者仍具有一定的免疫能力，GM的抗原被清除，低于試劑的檢測限，從而判定為陰性。相比于血清，肺泡灌洗液的GM檢測可能更適合用于接受抗真菌治療或預(yù)防性治療的患者，研究顯示敏感性和特異性在未經(jīng)治療或未預(yù)防治療的患者中為91%和88%，而在治療過或經(jīng)預(yù)防治療的患者中也高達76%～85%和89%，僅略微下降[2]。然而，本研究存在一定的局限性，樣本量有限并僅為單中心研究，后期將進一步擴大樣本量并開展多中心研究。

綜上，血清曲霉IgG抗體檢測對血液病/惡性腫瘤患者IPA的診斷具有潛在的應(yīng)用價值，特別是在患者接受抗真菌治療后GM檢測結(jié)果不佳時。