高碩，朱宏，周輝，周萬青，沈瀚(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院檢驗科，南京 210008)

腸球菌屬細(xì)菌為院內(nèi)感染的重要條件病原菌之一，可引起臨床尿路感染、菌血癥、軟組織及外科感染等[1]。臨床檢出的腸球菌以糞腸球菌和屎腸球菌為主，以尿液標(biāo)本分離為主[2]。萬古霉素耐藥、利奈唑胺耐藥腸球菌不斷檢出[3-4]。盡管國內(nèi)萬古霉素耐藥腸球菌(vancomycin resistantEnterococci，VRE)菌株的臨床檢出率近幾年有下降的趨勢[5]，但其致病強度、多重耐藥及院內(nèi)傳播等問題仍給臨床治療帶來挑戰(zhàn)。腸球菌所攜帶的多種毒力基因(esp、gelE、asa1、cylA、hyl等)決定了菌株的致病性，同時也與生物膜形成有關(guān)[6]。為探討萬古霉素耐藥屎腸球菌(vancomycin resistantEnterococcusfaecium，VREfm)耐藥機制及毒力基因的攜帶情況，本研究對臨床尿液樣本分離屎腸球菌攜帶的耐藥基因及毒力基因進(jìn)行檢測，并與敏感菌株進(jìn)行毒力基因攜帶差異分析，為腸球菌感染的治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1菌株來源 收集南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院2013—2019年臨床分離的中段尿來源非重復(fù)屎腸球菌株88株，使用Vitek 2 Compact全自動微生物分析儀進(jìn)行菌種鑒定并經(jīng)Vitek MS復(fù)核。依據(jù)菌株對萬古霉素最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC)分為萬古霉素耐藥菌株(MIC≥32 μg/mL)和敏感菌株(MIC≤4 μg/mL)，分別為37株和51株。

1.2主要儀器和試劑 Vitek 2 Compact全自動鑒定藥敏分析儀及配套GP鑒定卡、GP67藥敏卡、Vitek MS及配套試劑(法國生物梅里埃公司)；萬古霉素、替考拉寧E-test條(鄭州安圖生物公司)；2×Taq Mix(上海近岸公司)；2720 Thermal Cycler PCR擴增儀(ABI公司)；蛋白酶K(Merck公司)；2 000 bp DNA marker(北京擎科生物公司)；Gelrad染色液(美國BIOTIUM公司)；電泳儀及GelDoc XR型凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；PCR引物合成由上海生工生物公司完成。

1.3藥敏試驗 采用Vitek 2 Compact及配套GP67卡進(jìn)行常規(guī)藥物敏感性檢測；采用E-test法復(fù)核萬古霉素和替考拉寧MIC值。結(jié)果判讀依據(jù)CLSI 2019標(biāo)準(zhǔn)[7]進(jìn)行。

1.4耐藥基因擴增及序列分析 采用加熱煮沸法提取細(xì)菌DNA[8]，挑取純培養(yǎng)菌落加入含200 ng/mL蛋白酶K溶液的1.5 mL離心管內(nèi)，56 ℃ 水浴2 h后置95 ℃ 水浴10 min，13 000×g離心30 s，取上清液即為DNA模板。參照文獻(xiàn)[9]合成介導(dǎo)萬古霉素耐藥決定基因vanA、vanB、vanD及vanM引物，見表1。采用多重PCR法進(jìn)行基因擴增分析。反應(yīng)體系為50 μL，包括2×Taq Mix 25 μL，DNA模板2 μL，上游引物(10 μmol/L)4 μL，下游引物(10 μmol/L)各1 μL，ddH2O 15 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30個循環(huán)；72 ℃ 7 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，Gelrad染色后經(jīng)GelDoc XR型凝膠成像分析系統(tǒng)觀察結(jié)果。選取部分陽性檢出菌株，采用單獨引物運用上述條件擴增，并由上海生工生物公司采用ABI 3730XL基因測序儀進(jìn)行單向測序，結(jié)果經(jīng)BLAST與GenBank比對。

表1 本文所用的引物序列

1.5毒力基因PCR擴增 參照文獻(xiàn)[10-11]合成腸球菌毒力基因cylA、esp、asal、hyl、gelE和agg擴增引物，引物序列見表1。采用PCR法進(jìn)行目的基因檢測。cylA、esp、asa1、hyl和gelE反應(yīng)體系為50 μL多重體系，包括2×Taq Mix 25 μL，DNA模板2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，ddH2O 13 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 7 min。agg反應(yīng)體系為20 μL，包括2×Taq Mix 10 μL，DNA模板2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，ddH2O 6 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 7 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠電泳，Gelrad染色后經(jīng)GelDoc XR型凝膠成像分析系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.6統(tǒng)計學(xué)分析 用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，率的比較采用卡方檢驗或Fisher檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1藥敏結(jié)果 37株初篩萬古霉素耐藥菌對萬古霉素MIC均≥256 μg/mL。其中,27株對替考拉寧MIC≥256 μg/mL(73.0%，27/37)，9株MIC為8 μg/mL，1株MIC為24 μg/mL。VREfm菌株對青霉素、氨芐西林、左氧氟沙星及高水平慶大霉素的耐藥率分別為100%(37/37)、97.3%(36/37)、100%(37/37)和59.5%(22/37)，對利奈唑胺均敏感。

2.2耐藥基因結(jié)果 37株VREfm中35株檢出vanA基因，其余2株檢出vanM基因；9株對替考拉寧敏感的VREfm均為vanA基因型。所有耐藥菌株均未檢出vanB、vanD基因。部分菌株耐藥基因擴增結(jié)果見圖1。

注：M，2 000 bp DNA marker；1，vanA基因；2，vanM基因；3，esp基因；4，hyl基因；5，esp-hyl雙基因攜帶；6，asa1-gelE雙基因攜帶；7，空白對照。

2.3毒力基因結(jié)果 88株屎腸球菌檢出asa11株、esp71株、hyl18株、gelE1株，未檢出cylA和agg基因。37株VREfm菌株以esp基因檢出率最高(89.2%)，其次為hyl(8.1%)，其中esp-hyl雙基因攜帶菌株2株，asa1-gelE雙基因攜帶1株。51株萬古霉素敏感菌株中，esp基因檢出率最高(74.5%)，其次為hyl基因(29.4%)，未檢出其余4種毒力基因。部分菌株毒力基因擴增結(jié)果見圖1。VREfm菌株中hyl基因檢出率低于敏感菌株，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

介導(dǎo)腸球菌耐糖肽類抗菌藥物的決定基因包括vanA、vanB、vanC、vanD、vanE、vanG、vanL、vanM和vanN，不同基因型對萬古霉素和替考拉寧耐藥性有所不同，耐藥基因型在不同的地域、人群及環(huán)境中存在差異[12]。vanA、vanB基因可介導(dǎo)細(xì)菌產(chǎn)生含D-丙氨酸-D-乳酸(D-Ala-D-Lac)末端的新的細(xì)胞壁前體，使萬古霉素與結(jié)合靶位的親和力下降從而產(chǎn)生耐藥性。VanA型對萬古霉素和替考拉寧均耐藥，VanB型基因簇的編碼蛋白VanS僅能被萬古霉素激活，因此VanB型對萬古霉素耐藥而對替考拉寧敏感[13]。本調(diào)查分析發(fā)現(xiàn)，37株VREfm具有多重耐藥表型，其中35株檢出vanA基因，另2株檢出vanM基因。由此可見，本院尿液分離VREfm主要由vanA介導(dǎo)，表現(xiàn)為對萬古霉素和替考拉寧高水平耐藥，與國內(nèi)報道較為一致[14]。檢出2株VREfm攜帶vanM基因，該基因最先于2006年在上海發(fā)現(xiàn)并具有地區(qū)分布性[15]。vanM基因耐藥性表型與vanA基因型相似，為萬古霉素和替考拉寧均高水平耐藥。但目前經(jīng)典的vanA基因型與VanA表型已發(fā)生變化。本研究中檢出的vanA基因型VREfm中存在9株對替考拉寧敏感，即存在VanB表型-vanA基因型菌株。有研究表明Tn1546轉(zhuǎn)座子vanY和vanZ缺失伴隨vanX-vanY間插入IS1216V或orf2-vanR間插入ISEfa4是導(dǎo)致VanB表型-vanA基因型中替考拉寧抗性受損的可能原因[16]，是否van基因簇中其他位點發(fā)生一些插入及缺失變異使得細(xì)菌對替考拉寧敏感性變化還有待進(jìn)一步研究。本研究中VanB表型-vanA基因型耐藥屎腸球菌比例較高，今后也將對此類菌株的vanA基因周圍序列進(jìn)行進(jìn)一步分析，以揭示表型和基因型不一致菌株的序列特征。

腸球菌所攜帶的毒力因子在其致病過程中發(fā)揮重要作用，主要基因有腸球菌表面蛋白基因esp、透明質(zhì)酸酶基因hyl、膠原蛋白黏附素基因ace、明膠酶基因gelE、 溶細(xì)胞素基因cyl、聚集物質(zhì)基因asa1及膠原黏附蛋白基因agg等[17]。本文對尿路分離屎腸球菌攜帶毒力基因的調(diào)查分析發(fā)現(xiàn)，esp單基因和esp-hyl雙基因為主要攜帶模式。以esp的攜帶率最高，其次為hyl。VREfm菌株esp和hyl的攜帶率分別為89.2%和8.1%。與北京地區(qū)醫(yī)院數(shù)據(jù)存在差異，尿路來源VREfm菌株esp和hyl的攜帶率為76.2% 和66.7%[14]。國外對于尿路感染VREfm研究中發(fā)現(xiàn)，esp的攜帶率達(dá)到91.1%，表明esp毒力基因在腸球菌所致尿路感染過程中的關(guān)鍵作用[18]。此外，檢出1株同時攜帶asa1和gelE基因的VREfm。與萬古霉素敏感菌株相比，發(fā)現(xiàn)VREfm菌株hyl基因攜帶率顯著低于敏感菌株，而esp基因攜帶率在兩者間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。這一結(jié)果提示，敏感菌株與耐藥菌株相比所攜帶的毒力基因更多，其致病性可能更強。研究發(fā)現(xiàn)，臨床多種來源樣本及醫(yī)院環(huán)境中分離的VREfm菌株hyl攜帶率高于敏感株(28.7% vs 5%)[19]，這與本研究分析結(jié)果不一致。一方面可能由于樣本來源的不同和地域差異，另一方面尿液來源的VREfm菌株在獲得萬古霉素耐藥的同時，可能丟失部分的毒力基因?qū)е戮曛虏⌒詼p弱。當(dāng)然對于這一發(fā)現(xiàn)，本調(diào)查分析仍存在菌株數(shù)量較少的局限，具體的機制還有待深入研究。

綜上所述，本文尿路分離屎腸球菌對萬古霉素耐藥主要由vanA基因介導(dǎo)；VREfm菌株攜帶的毒力基因主要為esp和hyl，其中hyl基因攜帶率低于敏感菌株。臨床上應(yīng)加強對萬古霉素等糖肽類抗菌藥物的使用管理，以期對VRE的傳播進(jìn)行早期預(yù)防。對VRE產(chǎn)生的分子機制和致病性的深入研究，也將為臨床感染的有效治療提供依據(jù)。