梁倩欣 董家銘 謝曼琳 鄒艷芳 涂興明,2 趙可偉,2*

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510006

2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510378

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種骨量低下，骨組織微結(jié)構(gòu)損壞，導(dǎo)致骨脆性增加的疾病[1]。隨著世界人口的老齡化，OP發(fā)病率逐年上升，骨折是其導(dǎo)致的嚴(yán)重后果，給人民的健康帶來(lái)巨大傷害。目前臨床上治療OP的藥物以鈣劑和雌激素類藥物等為主，具有一定的臨床療效但有副作用不宜長(zhǎng)期服用[2]。而中藥具有良好的臨床診療效果，并且其來(lái)源廣泛、成本低廉和不良反應(yīng)較小，實(shí)驗(yàn)研究也表明中藥可提高骨密度，緩解疼痛等癥狀，在治療OP方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

方劑是由多種中藥組成，具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，不同中藥的配伍有著不同的功效，目前大多數(shù)的研究方法仍是選取某個(gè)中藥或成分進(jìn)行研究，不能精準(zhǔn)解釋方劑發(fā)揮療效的物質(zhì)基礎(chǔ)及組方規(guī)律等問(wèn)題[3]，而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的出現(xiàn)，可作為疾病與中藥方劑之間的橋梁，整體、系統(tǒng)地對(duì)方劑進(jìn)行研究。方劑配伍組成的基本原則是君臣佐使，因此君臣佐使各藥物的配伍決定方劑治療及作用的方向。我院經(jīng)驗(yàn)方骨康方，在臨床上可顯著緩解OP患者腰腿痛及腎陽(yáng)虛癥狀，并且已有研究[4]證明骨康方具有抑制骨吸收和促進(jìn)骨形成的雙重作用。骨康方中君藥(補(bǔ)骨脂)、臣藥(淫羊藿、肉蓯蓉、熟地黃、菟絲子和白芍)、佐藥(黃芪、丹參和當(dāng)歸)和使藥(大棗)，據(jù)文獻(xiàn)檢索可知已有部分單味藥的機(jī)制研究，但骨康方藥整體的靶點(diǎn)機(jī)制異同并未進(jìn)行系統(tǒng)研究。因此，本研究主要通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)來(lái)探討骨康方藥治療OP相關(guān)靶點(diǎn)及通路的異同，為深入研究骨康方中君臣佐使各藥組成的具體意義奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，同時(shí)也可為尋找骨康方的最佳組成提供參考的方向。

1 材料和方法

1.1 藥物活性成分及潛在靶點(diǎn)的篩選

通過(guò)中藥綜合數(shù)據(jù)庫(kù)(TCMID)獲得骨康方君藥(補(bǔ)骨脂)的成分，使用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(TCMSP)篩選其活性成分及其靶點(diǎn)(OB≥30%、DL≥0.18)；在TCMSP以相同條件分別篩選臣藥(淫羊藿、肉蓯蓉、熟地黃、菟絲子和白芍)、佐藥(黃芪、丹參和當(dāng)歸)和使藥(大棗)的活性成分及其靶點(diǎn)；同時(shí)，通過(guò)文獻(xiàn)檢索補(bǔ)充不在篩選納入范圍內(nèi)但已有研究表明對(duì)OP有明確療效的活性成分及靶點(diǎn)。通過(guò)uniprot (2020年8月3日更新)進(jìn)行Gene symbol的轉(zhuǎn)化，刪除非人類及無(wú)數(shù)據(jù)靶點(diǎn)。使用Cytoscape軟件構(gòu)建活性成分-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.2 OP靶點(diǎn)的獲取

分別在OMIM(2020年9月15日更新)、 TTD (2020年6月1日更新)以及DisGeNET (version:7.0)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索疾病關(guān)鍵詞“Osteoporosis”，得到相應(yīng)的靶點(diǎn)，匯總?cè)齻€(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的靶點(diǎn)，去除重復(fù)靶點(diǎn)，得到OP靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集。

1.3 中藥-疾病交集靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)的構(gòu)建

通過(guò)Venny 2.1將中藥靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)進(jìn)行比對(duì)，分別篩選君藥-OP交集靶點(diǎn)、臣藥-OP交集靶點(diǎn)、佐藥-OP交集靶點(diǎn)和使藥-OP交集靶點(diǎn)。利用STRING(version 11.0)分析交集基因間的相互作用，設(shè)置置信度>0.9并隱藏游離單結(jié)點(diǎn)，分別構(gòu)建交集靶點(diǎn)之間的PPI。

1.4 中藥-疾病關(guān)鍵靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析

將PPI導(dǎo)入Cytoscape，分別以degree、closeness和betweenness分析PPI網(wǎng)絡(luò)，取其大于或等于中位數(shù)部分的交集，即為中藥-疾病的關(guān)鍵靶點(diǎn)，其中君藥的關(guān)鍵靶點(diǎn)不做篩選。使用David(version:6.8)對(duì)君臣佐使的關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 通路分析，去除非骨相關(guān)的具體疾病名稱相關(guān)通路，使用Venny 2.1軟件對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)的KEGG通路結(jié)果進(jìn)行交集。取P<0.05為顯著富集的閾值，在R語(yǔ)言中使用ggplot2軟件進(jìn)行處理。結(jié)果按P值大小順序排列，取前24的結(jié)果，氣泡大小代表通路的基因數(shù)量，P值代表富集的顯著程度。

2 結(jié)果

2.1 骨康方中藥的活性成分及作用靶點(diǎn)

通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)和文獻(xiàn)檢索分別篩選得到君藥的活性成分4個(gè)，潛在靶點(diǎn)40個(gè)；臣藥的成分40個(gè)，靶點(diǎn)254個(gè)；佐藥的成分75個(gè)，靶點(diǎn)242個(gè)；使藥的成分19個(gè)，靶點(diǎn)202個(gè)。見(jiàn)圖1。

2.2 骨康方中藥-OP的交集靶點(diǎn)

通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)OP進(jìn)行檢索，其中OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)檢索獲得42個(gè)OP靶點(diǎn)，TTD數(shù)據(jù)庫(kù)34個(gè)，DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)1 098個(gè)，匯總?cè)ブ睾蠊驳玫絆P靶點(diǎn)1 152個(gè)。分別將骨康方中藥的潛在靶點(diǎn)與OP靶點(diǎn)進(jìn)行交集，獲得君藥-OP的交集靶點(diǎn)12個(gè)、臣藥87個(gè)、佐藥86個(gè)、使藥80個(gè)。結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.3 骨康方中藥-OP交集靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)

君藥-OP交集靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)，具有6節(jié)點(diǎn)、8個(gè)作用關(guān)聯(lián)；臣藥-OP交集靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)，具有78節(jié)點(diǎn)、288個(gè)作用關(guān)聯(lián)；佐藥-OP交集靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)，具有76節(jié)點(diǎn)、328個(gè)作用關(guān)聯(lián)；使藥-OP交集靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)，具有72節(jié)點(diǎn)、258個(gè)作用關(guān)聯(lián)。見(jiàn)圖3。

2.4 骨康方中藥-OP關(guān)鍵靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析

利用Cytoscape軟件獲得君藥-OP關(guān)鍵靶點(diǎn)有6個(gè)、臣藥有30個(gè)、佐藥有31個(gè)和使藥有30個(gè)，結(jié)果按degree大小順序排列，見(jiàn)表1。然后分別對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，結(jié)果見(jiàn)圖4。將君臣佐使各藥關(guān)鍵靶點(diǎn)的KEGG通路結(jié)果進(jìn)行交集后發(fā)現(xiàn)共同通路有9條、君藥特有的通路有7條、臣藥有2條和使藥有1條，而佐藥無(wú)特有的通路。結(jié)果見(jiàn)表2、圖5。

表2 KEGG通路交集結(jié)果Table 2 Intersection results of KEGG pathway

3 討論

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)骨康方中君臣佐使各藥的具體靶點(diǎn)及通路進(jìn)行探討，以對(duì)比君臣佐使各藥對(duì)OP具體作用的異同，試圖通過(guò)中藥分子作用機(jī)制解釋君臣佐使組成及配伍的具體意義。通過(guò)構(gòu)建不同交集靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)后分別篩選出關(guān)鍵靶點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)君藥的部分關(guān)鍵靶點(diǎn)在臣佐使藥中也分別存在，說(shuō)明臣佐使藥可能通過(guò)這些共同的關(guān)鍵靶點(diǎn)輔佐君藥發(fā)揮其主要的作用治療OP，同時(shí)我們對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行degree排序后發(fā)現(xiàn)君臣佐使的共同關(guān)鍵靶點(diǎn)排序有所不同，那么君臣佐使各藥可能治療OP的側(cè)重點(diǎn)有所不同，符合君臣佐使在方劑中負(fù)責(zé)的部分不同。

本研究通過(guò)對(duì)骨康方中君臣佐使各藥關(guān)鍵靶點(diǎn)的KEGG通路結(jié)果進(jìn)行交集，發(fā)現(xiàn)一共有9條通路為君臣佐使各藥的共同通路，其中雌激素信號(hào)通路與OP過(guò)程密切相關(guān)，有研究表明部分中藥具有類雌激素作用，可通過(guò)雌激素受體作用于相關(guān)的骨代謝過(guò)程進(jìn)而影響OP的進(jìn)程[5]；其他的共同通路雖與OP沒(méi)有直接的關(guān)系，但通過(guò)KEGG官網(wǎng)對(duì)共同通路進(jìn)行搜索發(fā)現(xiàn)，它們大多參與細(xì)胞生長(zhǎng)、死亡及環(huán)境[6-7]、調(diào)控激素影響內(nèi)分泌系統(tǒng)及生長(zhǎng)發(fā)育[8]以及調(diào)節(jié)鈣離子[9]等，特別值得注意的是這些通路與MAPK通路有聯(lián)系，而文獻(xiàn)檢索顯示MAPK通路可調(diào)控成骨細(xì)胞的增殖分化[10]，雌激素受體信號(hào)通路在MAPK信號(hào)通路的上游[11]，所以推測(cè)骨康方的君臣佐使各藥可能通過(guò)MAPK通路對(duì)OP進(jìn)行調(diào)控。同時(shí)交集結(jié)果顯示君藥有7條獨(dú)特的通路、臣藥有2條、使藥有2條，而佐藥無(wú)自己獨(dú)特的通路。其中君藥的7條通路與Ca離子信號(hào)通路有關(guān)[12-13]，鈣是構(gòu)成骨骼的重要物質(zhì)[14]，對(duì)鈣離子通路的調(diào)控可影響骨代謝過(guò)程，有研究表明左歸丸可通過(guò)上調(diào)腎鈣和骨鈣轉(zhuǎn)運(yùn)通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)來(lái)發(fā)揮抗OP的作用[15]，那么君藥可能通過(guò)調(diào)節(jié)鈣離子通路促進(jìn)骨形成從而影響OP的進(jìn)展。臣藥的2條獨(dú)特通路主要與免疫調(diào)節(jié)的相關(guān)通路有關(guān)[16]，淋巴細(xì)胞的部分增殖分化過(guò)程在骨髓內(nèi)進(jìn)行，與骨髓造血共享同一個(gè)微環(huán)境，可共享微環(huán)境中的各種物質(zhì)，所以免疫因子、通路的變化可影響共享的微環(huán)境，從而影響骨細(xì)胞的相關(guān)過(guò)程[17]。使藥的1條獨(dú)特通路與細(xì)胞間粘附連接過(guò)程有關(guān)，這過(guò)程對(duì)維持組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞極性非常重要，并且可以限制細(xì)胞的移動(dòng)和增殖[18]。綜上，君臣佐使各藥具有獨(dú)特的通路，并且它們影響的細(xì)胞過(guò)程也不同。君藥主要集中于鈣離子通路，可能通過(guò)鈣離子通路促進(jìn)骨形成，從而緩解OP的主要癥狀——疼痛；臣藥主要與免疫微環(huán)境相關(guān)，可能通過(guò)調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境間接影響骨代謝過(guò)程，從而輔助君藥緩解疼痛的癥狀；而使藥則是對(duì)基礎(chǔ)的細(xì)胞過(guò)程起作用，起到調(diào)和諸藥的作用，符合君臣佐使的相關(guān)理論。

綜上所述，骨康方的君臣佐使各藥有共同的作用靶點(diǎn)及相關(guān)的通路，證明了它們作用時(shí)密切相關(guān)、相互輔佐，可能通過(guò)MAPK通路共同完成對(duì)OP的治療作用，與此同時(shí)，它們又各自具有一定治療特點(diǎn)的靶點(diǎn)及通路，發(fā)揮自己獨(dú)特的作用。