蔡鑫 唐芳 馬武開 蔣總 金澤旭 樊梅

1.貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽(yáng) 550002

2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，貴州 貴陽(yáng) 550003

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性全身性自身免疫性疾病，其病理特征是滑膜的對(duì)稱性炎癥，尤其在手、足小關(guān)節(jié)部位。慢性滑膜炎癥引起RA患者關(guān)節(jié)壓痛和關(guān)節(jié)損傷，導(dǎo)致功能障礙、生活質(zhì)量下降和預(yù)期壽命縮短[1]。RA臨床表現(xiàn)不局限于關(guān)節(jié)炎癥，大約40%的RA患者存在類風(fēng)濕結(jié)節(jié)、血管炎、肺纖維化、心包炎等關(guān)節(jié)外表現(xiàn)[2]。RA的另一個(gè)重要特征是局部骨質(zhì)丟失，也稱為關(guān)節(jié)周圍骨質(zhì)減少，研究發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)周圍骨量丟失是炎癥細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素-6(IL-6)或腫瘤壞死因子(TNF)對(duì)關(guān)節(jié)周圍持續(xù)影響的結(jié)果，更常見于抗瓜氨酸蛋白抗體(ACPA)陽(yáng)性的RA患者[3-4]。在RA臨床發(fā)作前數(shù)年，ACPA就已經(jīng)存在，因此部分患者局部骨量丟失在RA的臨床前階段就已經(jīng)出現(xiàn)[5]。

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是一種肌肉骨骼疾病，其特征是骨骼強(qiáng)度受損，導(dǎo)致骨折風(fēng)險(xiǎn)增加。RA患者脊柱和髖部的平均骨密度值降低，隨著疾病進(jìn)展而繼發(fā)OP，同時(shí)由于長(zhǎng)期接受糖皮質(zhì)激素治療，療程超過6個(gè)月的RA患者中近30%將發(fā)展為OP[6]。與OP相關(guān)的脆性骨折，無論是椎體還是非椎體，都是RA患者的一種嚴(yán)重并發(fā)癥，與年齡和性別匹配的對(duì)照組相比，RA髖部和椎體骨折的發(fā)生率更高，并且隨著病程、活動(dòng)減少和頻繁使用糖皮質(zhì)激素而增加[7-8]。

RA與OP的關(guān)系尚不完全清楚，本研究通過檢索獲得RA與OP的共同基因，構(gòu)建疾病共同基因的蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)并篩選出關(guān)鍵靶點(diǎn)基因，對(duì)關(guān)鍵基因進(jìn)行GO和KEGG富集分析，為闡述RA與OP的共同發(fā)病機(jī)制及今后治療藥物的研發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 疾病靶點(diǎn)獲取

在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)(https://omim.org/)、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)(http://db.idrblab.net/ttd/)、DRUGBANK數(shù)據(jù)庫(kù)(https://go.drugbank.com/)、CTD數(shù)據(jù)庫(kù)(https://ctdbase.org/)和DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.disgenet.org/)中以“rheumatoid arthritis”和“osteoporosis”為關(guān)鍵詞分別進(jìn)行檢索，獲得RA及OP的疾病基因。利用Venny2.1軟件對(duì)RA和OP疾病基因進(jìn)行去重和取交集，得到RA與OP的共同靶點(diǎn)基因。

1.2 PPI網(wǎng)絡(luò)分析與關(guān)鍵靶基因篩選

將獲得的RA與OP共同靶點(diǎn)基因?qū)隨TRING在線數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/cgi/)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，物種設(shè)置為“Homo sapiens”，使用Cytoscap3.7.2軟件繪制PPI可視化網(wǎng)絡(luò)圖，借助R軟件篩選出PPI網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因。

1.3 基因富集分析

借助DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/)對(duì)RA與OP的共同靶點(diǎn)基因進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析，并繪制富集結(jié)果氣泡圖，利用Cytoscape3.7.2軟件繪制疾病基因-信號(hào)通路相互作用關(guān)系圖。

2 結(jié)果

2.1 RA與OP基因收集結(jié)果

通過檢索相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)獲得RA相關(guān)基因5 388個(gè)、OP相關(guān)基因4 587個(gè)，通過取交集后獲得1 899個(gè)RA與OP共同靶點(diǎn)基因。見圖1。

2.2 PPI網(wǎng)絡(luò)及關(guān)鍵靶點(diǎn)基因

通過STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建RA與OP共同靶點(diǎn)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)圖中包括1 773個(gè)節(jié)點(diǎn)和69 267條邊(有126個(gè)基因未產(chǎn)生相互作用)。見圖2。為確定RA與OP的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因，利用R軟件篩選出PPI網(wǎng)絡(luò)中度值(Degree)前30位的節(jié)點(diǎn)，包括IL-6、TNF、胰島素(INS)、AKT絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1(AKT1)、p53腫瘤蛋白(TP53)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGFA)及表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)等。見圖3。

2.3 GO和KEGG富集分析

將RA與OP共同靶點(diǎn)基因?qū)隓AVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析。GO功能主要富集在受體配體活性(receptor ligand activity)、細(xì)胞因子受體結(jié)合(cytokine receptor binding)、細(xì)胞因子活性(cytokine activity)、肽結(jié)合(peptide binding)、囊泡(vesicle lumen)、T細(xì)胞活化(T cell activation)、肽分泌的調(diào)節(jié)(regulation of peptide secretion)及調(diào)節(jié)造血功能(regulation of hemopoiesis)等方面。見圖4。KEGG通路包括PI3K-Akt信號(hào)通路(PI3K-Akt signaling pathway)、JAK-STAT信號(hào)通路(JAK-STAT signaling pathway)、破骨細(xì)胞分化(osteoclast differentiation)、細(xì)胞凋亡(apoptosis)、Th17細(xì)胞分化(Th17 cell differentiation)、HIF-1信號(hào)通路(HIF-1 signaling pathway)及Wnt信號(hào)通路(Wnt signaling pathway)等信號(hào)通路。見圖5。運(yùn)用Cytoscape3.7.2軟件繪制RA與OP共同靶基因-信號(hào)通路相互作用圖，圖中紅色節(jié)點(diǎn)表示疾病基因、綠色節(jié)點(diǎn)表示富集的KEGG信號(hào)通路，節(jié)點(diǎn)間連線數(shù)量表示相互作用頻率，節(jié)點(diǎn)越大，富集的疾病靶點(diǎn)基因越多。見圖6。

3 討論

RA是一種自身免疫介導(dǎo)的慢性炎癥性關(guān)節(jié)疾病，活化的滑膜細(xì)胞和滑膜巨噬細(xì)胞產(chǎn)生多種炎癥介質(zhì)引起關(guān)節(jié)破壞[9]。OP是RA的常見并發(fā)癥，骨質(zhì)疏松性骨折進(jìn)一步加重了RA患者精神、心理負(fù)擔(dān)，對(duì)生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響，目前發(fā)現(xiàn)炎癥因子在RA繼發(fā)OP的病理機(jī)制中具有重要作用[10-11]。本研究應(yīng)用生物信息學(xué)方法對(duì)RA與OP的共同疾病基因進(jìn)行分析，篩選出兩者的共同關(guān)鍵靶點(diǎn)基因和主要涉及的信號(hào)通路，為闡明RA與OP之間的聯(lián)系及今后研究提供參考。

通過構(gòu)建RA與OP共同靶基因的PPI網(wǎng)絡(luò)，篩選出IL-6、TNF、INS、AKT1、TP53、VEGFA、EGFR等關(guān)鍵蛋白。IL-6、TNF等促炎細(xì)胞因子在RA患者血清和關(guān)節(jié)滑液中表達(dá)明顯升高，對(duì)炎癥引起的骨質(zhì)流失起著關(guān)鍵作用，能夠刺激成纖維樣滑膜細(xì)胞和成骨細(xì)胞分泌核因子κB受體活化因子配體(receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)來誘導(dǎo)破骨細(xì)胞成熟和活化，從而促進(jìn)骨吸收并抑制成骨細(xì)胞功能。應(yīng)用IL-6抑制劑能增加RA患者股骨骨密度[12]，對(duì)伴有骨量降低的活動(dòng)性RA患者進(jìn)行抗TNF-α治療，可以有效阻止腰椎和髖部骨密度繼續(xù)下降[13]。INS通過與成骨細(xì)胞表面的功能性胰島素受體結(jié)合，促進(jìn)其增殖、分化，當(dāng)體內(nèi)INS缺乏或發(fā)生胰島素抵抗時(shí)，成骨細(xì)胞的成骨能力明顯下降[14]。AKT1與RA成纖維樣滑膜細(xì)胞凋亡有關(guān)[15]，敲減該基因可導(dǎo)致小鼠骨化能力下降[16]。TP53(又稱P53)基因突變引起RA滑膜細(xì)胞異常增殖，加重疾病進(jìn)展[17]。P53在OP患者血清中表達(dá)上調(diào)，抑制P53能夠部分逆轉(zhuǎn)骨密度降低[18]。VEGFA是血管發(fā)育形成的關(guān)鍵因素，使用VEGFA拮抗劑可阻斷RA新生血管形成并抑制營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)向炎癥部位傳輸[19]。與RA不同的是，VEGFA能增強(qiáng)骨血管生成，促進(jìn)體外成骨細(xì)胞的存活、分化及礦化[20]，具有積極作用。EGFR可促進(jìn)RA滑膜血管新生，EGFR抑制劑能夠減輕小鼠自身免疫性關(guān)節(jié)炎，減少滑膜和血管翳的形成[21]。而EGFR對(duì)于骨祖細(xì)胞的維持和新骨形成至關(guān)重要，敲減EGFR基因或應(yīng)用EGFR特異性抑制劑會(huì)引起骨質(zhì)丟失[22]。

通過對(duì)RA與OP共同靶基因進(jìn)行GO和KEGG分析發(fā)現(xiàn)，GO功能主要富集在在受體配體活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合、細(xì)胞因子活性、T細(xì)胞活化、肽分泌的調(diào)節(jié)等方面。KEGG富集結(jié)果表明，PI3K-Akt信號(hào)通路、JAK-STAT信號(hào)通路、破骨細(xì)胞分化、HIF-1信號(hào)通路及Wnt信號(hào)通路等可能是RA與OP病理機(jī)制中的共同信號(hào)通路。IL-17通過誘導(dǎo)IL-6、TNF-α等促炎因子參與RA滑膜炎癥，PI3K-Akt通路激活可上調(diào)IL-17表達(dá)，使用該信號(hào)通路抑制劑渥曼青霉素能部分或完全阻斷IL-17產(chǎn)生[23]。RA滑膜細(xì)胞中PI3K表達(dá)增加，可活化PI3K-Akt通路而抑制滑膜細(xì)胞凋亡[24]。對(duì)于OP來說，PI3K-Akt是骨形成中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)途徑，LY294002(PI3K抑制劑)降低了MC3T3-E1細(xì)胞的成骨能力[25]。JAK-STAT信號(hào)通路由JAK酪氨酸蛋白激酶家族(包括JAK1、JAK2、JAK3等)和轉(zhuǎn)錄因子STAT家族(包括STAT1、STAT2、STAT3、STAT4等)構(gòu)成，下調(diào)STAT3有助于抑制滑膜細(xì)胞存活，該信號(hào)通路抑制劑在RA患者中已被證實(shí)有效[26]。在OP中IL-6通過調(diào)控JAK2/STAT3信號(hào)通路影響骨密度及骨小梁生成，阻斷該通路后OP模型大鼠骨密度得到明顯提升[27]。破骨細(xì)胞異?；罨且餜A骨質(zhì)破壞的關(guān)鍵因素，RA患者的破骨細(xì)胞分化和骨吸收能力明顯增強(qiáng)[28]。成骨細(xì)胞骨形成和破骨細(xì)胞骨吸收之間保持動(dòng)態(tài)平衡能夠維持骨骼的強(qiáng)度，當(dāng)骨吸收增強(qiáng)時(shí)可導(dǎo)致OP[29]。關(guān)節(jié)缺氧被認(rèn)為是RA的重要微環(huán)境特征，HIF-1在RA滑膜中大量表達(dá)，HIF-1陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量與RA滑膜組織中血管的數(shù)量密切相關(guān)，抑制HIF-1表達(dá)可誘導(dǎo)RA成纖維樣滑膜細(xì)胞凋亡[30-31]。缺氧可抑制大鼠成骨細(xì)胞的骨形成能力及分化，HIF-1過表達(dá)能抑制成骨分化和C3H10T1/2細(xì)胞中骨鈣素的表達(dá)[32]。TNF-α可誘導(dǎo)RA滑膜細(xì)胞中DKK1的表達(dá)，DKK1通過抑制經(jīng)典Wnt信號(hào)通路參與RA骨吸收過程[33]。激活破骨細(xì)胞前體中的Wnt通路可以抑制破骨細(xì)胞分化，Wnt6、Wnt10a和Wnt10b等能夠抑制間充質(zhì)干細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化和促進(jìn)其向成骨細(xì)胞分化[34]。

本研究所得RA與OP的關(guān)鍵靶點(diǎn)及信號(hào)通路中，IL-6、TNF及JAK-STAT通路抑制劑已在臨床中用于治療RA患者，并取得了良好療效。IL-6、TNF等炎性細(xì)胞因子介導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化增強(qiáng)引起的骨代謝失衡，在RA與OP骨質(zhì)流失中具有一致性。盡管經(jīng)典Wnt通路對(duì)于調(diào)節(jié)RA與OP骨代謝具有相同意義，但關(guān)于拮抗該信號(hào)途徑對(duì)RA患者骨質(zhì)破壞方面的獲益尚缺乏研究。HIF-1信號(hào)通路的激活不僅引起RA滑膜細(xì)胞病理性增殖，也抑制了成骨細(xì)胞的骨形成能力，針對(duì)該調(diào)節(jié)通路的研究可能作為治療RA與OP的重要靶點(diǎn)。VEGFA與EGFR在RA與OP中的作用并不一致，其過表達(dá)加重了RA滑膜炎癥和血管翳生成，而上調(diào)其表達(dá)又是促進(jìn)成骨細(xì)胞生成的關(guān)鍵，對(duì)于VEGFA和EGFR一方面加重RA病理改變、另一方面RA患者卻出現(xiàn)骨質(zhì)丟失這一矛盾值得進(jìn)行深入研究。

本研究初步探討了RA與OP之間存在的相同致病基因和相關(guān)的信號(hào)調(diào)節(jié)途徑，為探索RA與OP的治療靶點(diǎn)提供了一定理論參考。由于未對(duì)上述疾病靶點(diǎn)基因和信號(hào)通路進(jìn)行驗(yàn)證，本文亦存在一定局限性，需今后進(jìn)一步研究以明確其具體機(jī)制。