李建良 張濛 麥嘉樂 何琪 張罡瑜 陳偉堅 肖嘉聰 潘兆豐 宮大偉,4 王海彬,5*

1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510405

2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)嶺南醫(yī)學(xué)研究中心中醫(yī)骨傷科實驗室，廣東 廣州 510405

3. 河南省人民醫(yī)院，鄭州大學(xué)人民醫(yī)院，河南大學(xué)人民醫(yī)院骨科, 河南 鄭州 450003

4.山東省文登整骨醫(yī)院，山東 威海 264400

5. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405

骨質(zhì)疏松癥( osteoporosis，OP)作為目前一種影響眾多老年人口以及包括絕經(jīng)后婦女在內(nèi)的重要疾病之一，是以骨骼強度變低、骨小梁微結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞、骨質(zhì)脆性增加為特點，最終容易引發(fā)骨質(zhì)疏松性骨折和疼痛，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量的一種疾病[1-2]。針對骨質(zhì)疏松癥的治療是醫(yī)療界的一大難題，新型靶向藥物的研發(fā)及應(yīng)用是目前醫(yī)療界研究的重點。因此，針對骨質(zhì)疏松新靶點的研究是目前研究熱點之一。

骨質(zhì)疏松的發(fā)生發(fā)展，根本原因在于骨穩(wěn)態(tài)的破壞，具體表現(xiàn)為成骨細(xì)胞分化受到抑制，破骨細(xì)胞分化活動進(jìn)一步加強。成骨細(xì)胞是骨形成的主要功能細(xì)胞，具有負(fù)責(zé)新骨形成的功能。在成骨分化這一重要的過程中，其基本的生物學(xué)特征包括骨小梁基本單位——骨基質(zhì)合成、分泌、礦化及成熟。成骨細(xì)胞首先合成I型膠原(collagen-I, COL-I)、骨鈣素(osteocalcin, OC)、骨橋蛋白(osteopontin, OPN)等胞外基質(zhì)，并通過基質(zhì)小泡釋放鈣離子和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)等酶類物質(zhì)，鈣離子在堿性磷酸酶作用下沉淀在膠原纖維絲上，完成基質(zhì)礦化過程，最終形成骨組織。堿性磷酸酶是成骨細(xì)胞分化的早期標(biāo)志物，骨基質(zhì)合成期開始出現(xiàn)，礦化期達(dá)巔峰；礦化結(jié)節(jié)是成骨細(xì)胞分化成熟的標(biāo)志，同時也是成骨細(xì)胞行使成骨功能的主要形態(tài)學(xué)特征，觀察成骨細(xì)胞的礦化結(jié)節(jié)是研究成骨細(xì)胞分化的常用技術(shù)方法之一。

組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶2(SET and MYND domain containing protein 2，SMYD2)基因位于1號染色體GRCh38.p13，屬于組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SMYD家族。SMYD2是一種含有SET結(jié)構(gòu)域的組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶。SMYD2在正常組織、腫瘤組織中分布廣泛。SMYD2的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在心、腦、肝、腎、卵巢和骨骼肌等部位高表達(dá)，對維持骨骼肌的功能和結(jié)構(gòu)有著重要的意義[4]。SMYD2作用蛋白廣泛，不僅可以甲基化組蛋白，而且還可以甲基化非組蛋白，如p23和Hsp90[5-6]。目前有相關(guān)的文獻(xiàn)[4,7-12]表明，SMYD2蛋白的過度表達(dá)與腫瘤增殖、腫瘤浸潤、淋巴管侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素密切相關(guān)，是癌癥預(yù)后不良的一個重要因素。但SMYD2在腫瘤細(xì)胞中的具體作用機制尚未完全闡明。LLY-507是目前針對SMYD2的新型抑制劑，能有效地抑制SMYD2對p53肽段和對H4的甲基化。LLY-507對SMYD2的選擇性比對其他蛋白或DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(包括相關(guān)的家族成員SMYD3, SUVH420H1, SUV420H2)高100倍[13]。LLY-507能使多種激酶、蛋白偶聯(lián)受體以及細(xì)胞核激素受體失活。LLY-507以劑量依賴方式抑制食管、肝臟、乳腺癌細(xì)胞株的增殖[14]。但目前SMYD2及其抑制劑LLY-507在骨質(zhì)疏松領(lǐng)域及細(xì)胞株的應(yīng)用尚未有相關(guān)文獻(xiàn)報導(dǎo)。本研究通過先期對hMSCs進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，分別取第3天、第7天、第14天收取RNA樣品進(jìn)行高通量測序，發(fā)現(xiàn)SMYD2在成骨誘導(dǎo)過程中變化較大，且在成骨過程中呈現(xiàn)高表達(dá)，相應(yīng)測序后FPKM值見結(jié)果圖1B。本研究首次通過對小鼠前成骨細(xì)胞及hMSCs應(yīng)用SMYD2抑制劑LLY-507干預(yù)，觀察對其成骨分化能力的影響，揭示了SMYD2對其維持成骨分化具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1主要材料、試劑和儀器：小鼠顱頂前骨細(xì)胞亞克隆14(MC3T3-E1)細(xì)胞系和hMSCs(hMSCs)分別購自武漢普諾賽生命科技有限公司和賽業(yè)公司；組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SMYD2抑制劑LLY-507(Selleck，美國)，分子量：574.76，分子式：CHNO，分子結(jié)構(gòu)式見圖1A；α-MEM培養(yǎng)基(Gibco，美國)；胎牛血清(Gibco，美國)；0.5%胰蛋白酶-EDTA(Gibco，美國)；青霉素/鏈霉素(Gibco，美國)；地塞米松(Sgima-Alrich，美國)；抗壞血酸(Sgima-Alrich，美國)；β-甘油磷酸鈉(Sgima-Alrich，美國)；CCK-8試劑盒(碧云天，上海)；堿性磷酸酶顯色試劑盒(碧云天，上海)；堿性磷酸酶活性測定試劑盒(碧云天，上海)；0.2%茜素紅S染色液(賽業(yè)，美國)；氯化十六烷基吡啶(Sgima-Alrich，美國)；PCR引物(生工，上海)；熒光定量PCR試劑盒(Takara，日本)；Trizol(Takara，日本)；PrimeScrpitTMRT Master Mix(Takara，日本)；SYBR,RPremix EX TaqTM(Takara,日本)。

1.1.2細(xì)胞培養(yǎng)與分組：MC3T3-E1和hMSCs細(xì)胞在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中采用含有10%胎 血清、100 U/mL青霉素和 100 μg/mL鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，每3天換液1次，細(xì)胞密度約為80%時進(jìn)行傳代。細(xì)胞分組：細(xì)胞分為陰性對照組(CON)、陽性對照組(OIM)、25、50、100 nmol/L LLY-507的干預(yù)組。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞增殖測定：CCK-8細(xì)胞增殖試驗：取生長狀態(tài)良好的MC3T3-E1細(xì)胞和hMSCs，以每孔150 μL培養(yǎng)基以5 000個細(xì)胞密度種于96孔板中，每個實驗組設(shè)置6個復(fù)孔；24 h后加藥干預(yù)，96，h后，每孔加入10 μL的CCK-8檢測液，37 ℃孵育2 h，用酶標(biāo)儀檢測OD 450 nm的吸光值并計算細(xì)胞存活率。

1.2.2堿性磷酸酶染色及活性檢測細(xì)胞成骨分化能力：將第5～7代的MC3T3-E1和hMSCs以2×104/孔密度接種于24孔板中，培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁、形態(tài)穩(wěn)定后，陰性對照組加入普通完全培養(yǎng)基，陽性對照組加入不含LLY-507的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基(β-sodium glycerophosphate 10 mmol/L、Vitamin C 50 μg/mL、Dexamethasone 100 nmol/L)；將LLY-507干預(yù)組培養(yǎng)液更換為含有25、50、100 nmol/L不同濃度的LLY-507的成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基；培養(yǎng)基每48 h更換1次。于培養(yǎng)第7天進(jìn)行染色及活性檢測，吸走培養(yǎng)基后，PBS沖洗兩遍，加入4%多聚甲醛固定15 min，去除固定液，PBS沖洗1次，按照說明書配制堿性磷酸酶染色工作液，染色1 h，除去工作液，加入PBS終止反應(yīng)，顯微鏡下拍照。每孔加入50 μL的Ripa裂解液裂解細(xì)胞，離心后收集上清液作為樣品。按照說明書配制標(biāo)準(zhǔn)品及活性測定工作液，充分震蕩混勻后，96孔板中每孔加入50 μL底物、30 μL緩沖液和20 μL樣品，總體積共100 μL，每組設(shè)置3個復(fù)孔。37 ℃孵育15 min，酶標(biāo)儀檢測405 nm處的吸光度值，根據(jù)吸光度值繪制ALP活性酶測定標(biāo)準(zhǔn)曲線，單位為二乙醇胺(diethanolamine, DEA)酶活力單位。

1.2.3茜素紅染色及半定量測定檢測細(xì)胞礦化能力：細(xì)胞接種和培養(yǎng)方法同上，連續(xù)培養(yǎng)14 d，染色步驟中用茜素紅染液染色，余同ALP染色，染30 min，超純水洗滌后顯微鏡下拍照；然后在每孔中加入200 μL 10%氯化十六烷基吡啶于37 ℃孵箱內(nèi)充分溶解30 min，取10 μL的洗脫液加入含有40 μL PBS的96孔板中，在562 nm測定吸光度，進(jìn)行半定量檢測。

1.2.4qPCR檢測hMSCs成骨相關(guān)基因表達(dá)：提取細(xì)胞總RNA后進(jìn)行濃度以及純度檢測，采用Takara試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA。于95 ℃預(yù)變性30 min，同溫度下變性5 s，于60 ℃退火30 s，在72 ℃延伸30 s，反復(fù)擴增40個循環(huán)。采用GAPDH作為內(nèi)參進(jìn)行定量分析，每組設(shè)置3個復(fù)孔，引物序列見表1。待RT-PCR反應(yīng)結(jié)束后，分析其擴增曲線和熔解曲線，對結(jié)果采用2-ΔΔCt進(jìn)行統(tǒng)計分析。

表1 引物序列Table 1 Primers for quantitative real-Time PCR

1.2.5Western blot檢測hMSCs成骨相關(guān)蛋白的表達(dá)：取不同時間點干預(yù)后的細(xì)胞，Ripa裂解液冰上裂解30 min，細(xì)胞刮下，離心，取上清，BCA法測定蛋白濃度，加入相應(yīng)體積的5× loading buffer煮蛋白10 min；將蛋白樣品按要求加入SDS-PAGE 凝膠中，100 V 60 min進(jìn)行電泳，230 mA 120 min轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h，去掉封閉液后，加入足量TBST洗膜，每次10 min，洗3次。加入一抗4 ℃過夜孵育，加入足量TBST 洗膜，每次10 min，洗3次。加入對應(yīng)的二抗，室溫下孵育1 h，加入足量的TBST洗膜3 次，每次10 min,洗3次。配制ECL發(fā)光液，用顯影儀顯影曝光。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 LLY-507對MC3T3-E1和hMSCs細(xì)胞增殖的影響

分別使用不同濃度的LLY-507處理MC3T3-E1和hMSCs細(xì)胞96 h，與對照組相比，當(dāng)藥物濃度在800 nmol/L以下時，MC3T3-E1和hMSCs細(xì)胞活性無明顯影響，當(dāng)藥物濃度為1.6 μmol/L時，MC3T3-E1和hMSCs細(xì)胞活力顯著降低，細(xì)胞增殖受到抑制(見圖2A、2B)。

2.2 LLY-507抑制MC3T3-E1和hMSCs細(xì)胞的成骨礦化能力

使用不同濃度的LLY-507處理MC3T3-E1和hMSCs細(xì)胞7 d后進(jìn)行ALP染色，結(jié)果表明，LLY-507處理組ALP染色明顯淺于對照組，且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性；第7天的ALP活性測性測定結(jié)果與ALP染色結(jié)果相一致。表明LLY-507能夠抑制MC3T3-E1和hMSCs細(xì)胞的早期成骨分化。第14天的茜素紅染色結(jié)果顯示，LLY-507處理組茜素紅染色明顯淺于對照組，說明LLY-507能夠明顯抑制MC3T3-E1和hMSCs鈣結(jié)節(jié)的形成，表明LLY-507能夠抑制MC3T3-E1和hMSCs細(xì)胞的礦化(P<0.05)。見圖3。

2.3 qPCR檢測LLY-507對成骨分化相關(guān)基因的表達(dá)

結(jié)果表明LLY-507對抑制成骨基因表達(dá)呈現(xiàn)一定劑量梯度依賴性。加入100 nmol/L的LLY-507干預(yù)7 d后能夠明顯抑制hMSCs和MC3T3-E1成骨分化相關(guān)基因Runx2、Osterix、OPG、OPN的mRNA表達(dá)(P<0.05)。干預(yù)14 d后，結(jié)果表明加入50、100 nmol/L劑量的LLY-507能夠明顯抑制hMSCs和MC3T3-E1成骨分化相關(guān)基因Runx2、Osterix、OPG、OPN的mRNA表達(dá)(P<0.05)。見圖4。

2.4 Western Blot檢測LLY-507對hMSCs的Runx2和SMYD2蛋白的表達(dá)

結(jié)果表明加入LLY-507干預(yù)7 d和14 d后均能夠明顯抑制hMSCs的Runx2蛋白的表達(dá)，同時LLY-507作為SMYD2的抑制劑，能夠有效抑制SMYD2蛋白的表達(dá)，從而證實了LLY-507是SMYD2的高效抑制劑，同時也說明SMYD2在成骨分化過程中起著重要作用。見圖5。

3 討論

骨形成與骨吸收的動態(tài)平衡是維持骨穩(wěn)態(tài)的重要因素。當(dāng)骨吸收能力高于骨形成的能力時，骨穩(wěn)態(tài)的平衡被打破，誘發(fā)骨質(zhì)疏松癥[15]。MSCs是一種多能細(xì)胞，具有向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞多向分化的能力。而成骨分化為成骨細(xì)胞是骨生長和重建過程的重要組成部分[16]。hMSCs已被廣泛用作骨組織工程的成骨細(xì)胞來源[17]。目前已知成骨細(xì)胞通過OPG/RANKL和Fas/FasL途徑影響破骨細(xì)胞的形成、分化或凋亡[18]。Osterix和Runx2是成骨分化關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，能夠上調(diào)堿性磷酸酶的表達(dá)，并促進(jìn)鈣鹽的沉積及骨小梁的形成。堿性磷酸酶是成骨分化早期的關(guān)鍵標(biāo)志物，可以促進(jìn)相關(guān)成骨分化基因骨鈣蛋白BGP表達(dá)。成骨分化的晚期，主要表現(xiàn)為骨細(xì)胞外基質(zhì)形成，鈣鹽沉積在骨小梁的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中[19-20]。本研究表明低濃度的LLY-507可以有效減少ALP及相關(guān)成骨分化因子的表達(dá)，從而進(jìn)一步削弱成骨細(xì)胞的礦化及鈣鹽沉積活動，說明在成骨分化過程中SMYD2起促進(jìn)作用。

破骨細(xì)胞的分化受到成骨細(xì)胞分泌的骨保護(hù)素(OPG)和核因子κB受體活化因子配體(RANKL)兩種因子的影響。RANKL通過與核因子κB受體活化因子(RANK)的受體結(jié)合從而激活破骨細(xì)胞參與調(diào)節(jié)骨吸收的過程。而成骨細(xì)胞分泌的OPG可以阻斷RANKL和RANK的結(jié)合，從而抑制破骨細(xì)胞的活性，維持骨穩(wěn)態(tài)的動態(tài)平衡[21]。當(dāng)骨質(zhì)疏松癥發(fā)生時，骨吸收增強、骨形成減弱，因此OPG是衡量骨穩(wěn)態(tài)的一種重要指標(biāo)[22]。為了進(jìn)一步證實SMYD2在成骨分化過程中的作用，本研究通過qPCR和Western Blot檢測了不同劑量LLY-507對hMSCs成骨分化標(biāo)志物Runx2、Osterix、OPG、OPN基因的mRNA和Runx2、SMYD2蛋白的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)LLY-507作為SMYD2抑制劑，在降低SMYD2表達(dá)后，可以顯著抑制hMSCs成骨分化特異性基因的表達(dá)，從mRNA和蛋白表達(dá)水平說明SMYD2在成骨分化過程中的作用不可或缺。

相關(guān)文獻(xiàn)[12,23]表明，SMYD2 在腎囊腫組織中呈高表達(dá)狀態(tài)，其抑制劑AZ-505可以誘導(dǎo)SMYD2的小鼠囊腫內(nèi)細(xì)胞凋亡，減輕囊腫組織生長速度。具體機制為SMYD2通過STAT3和NF-κB的p65亞基的甲基化和激活來發(fā)揮其功能使其磷酸化活化，促進(jìn)囊性上皮細(xì)胞分泌多囊蛋白和炎性細(xì)胞因子，進(jìn)而促進(jìn)囊腫的生長。由此可見NF-κB信號通路參與了SMYD2的活化。而NF-κB信號通路與細(xì)胞的炎癥、凋亡等表型變化密切相關(guān)。Li 等[24]在三陰性乳腺癌TNBC細(xì)胞系中發(fā)現(xiàn)，IL-6-STAT3和TNFα-NF-κB信號傳導(dǎo)可上調(diào)SMYD2的表達(dá)，后者將表觀遺傳調(diào)控整合到TNBC細(xì)胞系的炎癥中，并且確定了一個新的SMYD2轉(zhuǎn)錄靶基因PTPN13，可將SMYD2連接到由PTPN13介導(dǎo)的磷酸化作用的ERK、mTOR和Akt信號通路中。說明SMYD2可能是NF-κB信號通路和PI3K的一個重要的交互(crosstalk)節(jié)點。既往SMYD2在骨質(zhì)疏松領(lǐng)域的具體功能尚未有報導(dǎo)，本研究通過應(yīng)用SMYD2的抑制劑LLY-507對體外細(xì)胞MC3T3-E1和hMSCs的實驗表明，SMYD2抑制劑LLY-507在低濃度下即可以作用于抑制成骨分化。本研究首次證實SMYD2能夠維持hMSCs向成骨方面分化。但其SMYD2在抗骨質(zhì)疏松領(lǐng)域體內(nèi)實驗和具體作用靶點以及相關(guān)的分子作用機制，需要進(jìn)一步深入研究。