王海生 馬濤 張敏 陶周善

1. 皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院弋磯山醫(yī)院手足踝外科，安徽 蕪湖 241000

2. 皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院弋磯山醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，安徽 蕪湖 241000

骨質(zhì)疏松癥是一種嚴(yán)重威脅健康的全身性骨骼疾病，其特征是骨量減少和骨小梁結(jié)構(gòu)破壞，是骨折的最重要危險(xiǎn)因素之一[1]。隨著世界范圍內(nèi)老年人口的不斷增加，骨質(zhì)疏松癥的出現(xiàn)越來越普遍，有研究預(yù)測50歲以上的女性和男性中有50%和20%的人會(huì)在今后的人生中經(jīng)歷一次或多次骨質(zhì)疏松骨折，這也給骨質(zhì)疏松的預(yù)防和治療帶來了巨大的挑戰(zhàn)[2]。盡管目前用于治療骨質(zhì)疏松癥的藥物確實(shí)療效顯著，但可能出現(xiàn)與這些藥物有關(guān)的各種不良反應(yīng)使其推廣使用遠(yuǎn)未達(dá)到理想[3]。麥角甾苷(MJZG)又稱馬鞭草苷、毛蕊花糖苷，是存在于包括馬鞭草屬、肉蓯蓉屬植物在內(nèi)的數(shù)十種藥用植物中具有代表性的苯乙醇苷成分之一。近年來的研究發(fā)現(xiàn)其有多種優(yōu)異的生物活性，包括抗氧化[4]、抗炎[5]、神經(jīng)保護(hù)和改善肌肉萎縮特性[6]，因此受到更多的關(guān)注。RANKL/TRAF6/NF-κB和PI3K/AKT信號(hào)通路在骨代謝中對(duì)破骨細(xì)胞活性調(diào)控可發(fā)揮重要作用[7]。有研究[8]還發(fā)現(xiàn)MJZG可以通過阻斷破骨細(xì)胞的激活來減少骨丟失。所有上述證據(jù)都與我們的假設(shè)一致，即MJZG可能具有骨保護(hù)和減少骨量丟失的作用，且可能和RANKL/TRAF6/NF-κB和PI3K/AKT信號(hào)通路有關(guān)。因此，本研究通過去卵巢模型旨在探討MJZG對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥可能作用并探索對(duì)RANKL/TRAF6/NF-κB和PI3K/AKT信號(hào)通路影響。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物分組和治療

由南京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的30只雌性SD 大鼠(12周齡)，初始體重為(206±21)g，被安置在標(biāo)準(zhǔn)無病原體的規(guī)范實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境中[溫度控制在(24.0±0.5) ℃，45 %～50%的濕度和12/12小時(shí)明暗照明循環(huán)]。允許所有大鼠自由獲得自來水和飲食。適應(yīng)環(huán)境1周后，在無菌條件下通過腹腔內(nèi)注射7 %水合氯醛(100 mg/kg)麻醉大鼠。然后對(duì)大鼠打開腹腔進(jìn)行不切除卵巢手術(shù)(假手術(shù)，Sham)，或進(jìn)行雙側(cè)卵巢摘除術(shù)(去卵巢手術(shù)，OVX)；隨后大鼠分為3組：Sham組、OVX組和麥角甾苷治療組(MJZG)，每組10只大鼠。其中MJZG組每天給予100 mg/kg麥角甾苷(成都格利普生物科技有限公司提供，純度>98%)灌胃治療。所有大鼠均不間斷治療12周，并根據(jù)體重每周調(diào)整一次劑量，本實(shí)驗(yàn)使用的劑量參考國外研究中100 mg/kg麥角甾苷可以取得較好的療效[9]，因此使用該劑量。在治療12周后，所有大鼠在過量麻醉下進(jìn)行處死，收集血液以4 000 r/min離心15 min收集血清，解剖出雙側(cè)股骨并保存在-80 ℃冰箱備測。本研究得到醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(LLSC-2020-082)。

1.2 生物力學(xué)測試

使用生物力學(xué)機(jī)(3220, Bose corporation, Endura TEC systems group, Minnetonka, MN, USA)通過三點(diǎn)彎曲測試測量大鼠股骨的生物力學(xué)特性，包括最大載荷和剛度。測量過程中需要用V型彎曲夾具固定股骨的遠(yuǎn)端和近端，將完整的股骨水平放置，正面朝上，然后在間隔20 mm的兩個(gè)支架上以0.02 mm/s的恒定加載速度加載股骨，并在此過程中記錄載荷和位移曲線，直到股骨骨折。通過對(duì)荷載位移曲線的分析，得到最大荷載和最大剛度。

1.3 骨小梁微觀結(jié)構(gòu)分析

右股骨干骺端的骨小梁微結(jié)構(gòu)是通過使用微型計(jì)算機(jī)斷層掃描(Micro-CT)系統(tǒng)(Micro-CT；Y. Cheetah；YXLON International GmbH，德國)確定，在三個(gè)空間維度上的分辨率為8 μm。選擇遠(yuǎn)離股骨遠(yuǎn)端的感興趣區(qū)域，在生長板開始平掃至生長板材下方2 mm處。骨形態(tài)參數(shù)包括骨密度(BMD)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)、骨小梁數(shù)(Tb.N)和骨小梁分離度(Tb.Sp)，通過使用ABA骨分析軟件分析感興趣區(qū)域來獲得。

1.4 生化參數(shù)分析

使用自動(dòng)分析儀(Ciba-Corning 550 Diagnostics, Corp., Oberlin, OH, USA)檢測血清生化參數(shù)水平。血清DPD、TRACP-5b和骨鈣素均使用Elisa試劑盒(Mountain View, CA, USA)進(jìn)行測量。

1.5 蛋白質(zhì)印跡

股骨在液氮中裂解，隨后將裂解的骨組織使用含有0.5 mmol苯基甲基磺酰氟，蛋白酶和磷酸酶抑制劑的裂解液裂解。接下來，將裂解物離心，并通過10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。在室溫下用5 %脫脂牛奶封閉60 min后，用TRAF6(1∶500)、RANKL(1∶500)、RANK(1∶500)、NF-κB(1∶500)、PI3K(1∶500)、AKT(1∶500)、NFAT2(1∶500)、IKKβ(1∶500)、c-Fos(1∶500)和GPADH(1∶1 000)抗體，然后用這些抗體使膜在4 ℃下培養(yǎng)過夜，然后與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗(1∶2 000)孵育；最后，通過圖像實(shí)驗(yàn)室軟件檢測印跡。重復(fù)蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)3次，將GPADH用作內(nèi)部對(duì)照。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，所有分析均使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行。組間使用單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行；P<0.05表明比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HE切片分析

大鼠股骨干骺端松質(zhì)骨HE染色顯示，與Sham組相比，去卵巢后大鼠骨小梁數(shù)量出現(xiàn)明顯減少、間距顯著增加；大量部位被脂肪細(xì)胞所代替，而麥角甾苷治療后的大鼠則觀察骨小梁明顯增加，且脂肪細(xì)胞重新被骨小梁所代替 (圖1)。

2.2 生物力學(xué)檢測

卵巢切除術(shù)后12周，與Sham組相比，OVX組的最大負(fù)荷和剛度顯著降低(P<0.05)。與OVX組大鼠相比，MJZG給藥時(shí)，最大負(fù)荷和剛度水平顯著增加(P<0.05)。見圖2。

2.3 MJZG預(yù)防去卵巢大鼠的骨量丟失

本研究使用Micro-CT評(píng)估MJZG對(duì)OVX大鼠股骨干骺端骨小梁的微結(jié)構(gòu)。如圖3所示，與Sham組相比，OVX組大鼠BMD、Tb.Th、BV/TV、Tb.N顯著降低，而Tb.Sp明顯升高(P<0.05)。然而，相比于OVX組，用MJZG治療的OVX大鼠劑量依賴性地增加了BMD、Tb.Th、BV/TV、Tb.N并顯著降低Tb.Sp(P<0.05)。

2.4 MJZG對(duì)骨代謝指標(biāo)的影響

骨代謝指標(biāo)堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素 (BGP)、抗酒石酸的酸性磷酸酶5b(TRACP-5b)和脫氧吡啶啉(DPD)檢測結(jié)果如圖4所示，與Sham組相比，卵巢切除術(shù)可顯著升高BGP、ALP、TRACP-5b和DPD的水平(P<0.05)。值得注意的是，與OVX組相比，用MJZG治療后的OVX大鼠中BGP、ALP、TRACP-5b和DPD水平顯著降低(P<0.05)。

2.5 蛋白印記檢測結(jié)果

各組大鼠股骨干骺端骨組織TRAF6、RANKL、NF-κB、NFAT2、PI3K、AKT和c-Fos表達(dá)檢測如圖5所示，和OVX組比較，MJZG組的TRAF6、RANKL、NF-κB和NFAT2的蛋白水平表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，而PI3K、AKT和c-Fos上調(diào)(P<0.05)。MJZG可以通過抑制RANKL/TRAF6/NF-κB和激活PI3K/AKT來防治OVX大鼠骨量丟失。

3 討論

本研究結(jié)果表明，麥角甾苷可以增加骨密度和生物力學(xué)性能，并改善大鼠股骨干骺端骨小梁的微結(jié)構(gòu)，并最終防止卵巢切除術(shù)引起的骨質(zhì)疏松大鼠的骨質(zhì)流失。

BMD是診斷骨質(zhì)疏松的主要標(biāo)志之一[10]，Micro-CT檢測還用于提供小梁微體系結(jié)構(gòu)的其他直接信息，以評(píng)估骨的脆性[11]。Micro-CT技術(shù)可以代替組織學(xué)染色，為股骨干骺端骨小梁微結(jié)構(gòu)提供直觀和定量數(shù)據(jù)，并且通過Micro-CT三維重建提供的骨小梁3 D圖像更為直觀，可以觀察到骨小梁的結(jié)構(gòu)，并定量數(shù)據(jù)包括BMD、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp和BV/TV。因此，從Micro-CT獲得的數(shù)據(jù)對(duì)于骨質(zhì)疏松癥診斷和治療更具體和全面。在本研究中，麥角甾苷治療顯著改善了OVX大鼠的BMD，骨微觀參數(shù)也得到了明顯改善，包括Tb.N、Tb.Th和BV/TV；而Tb.Sp的明顯降低；此外，麥角甾苷治療還能顯著提高了包括最大負(fù)荷和剛度在內(nèi)的生物力學(xué)參數(shù)。

骨代謝指標(biāo)是血液和/或尿液中在骨形成或骨吸收過程中釋放的生化標(biāo)志物，可以及時(shí)準(zhǔn)確地反映全身骨代謝。骨代謝指標(biāo)的檢查并不昂貴且無創(chuàng)，并且骨代謝指標(biāo)可以重復(fù)測量。治療后骨代謝指標(biāo)的變化可能比通過雙能X射線吸收法測量的BMD的變化更有意義[12]。骨代謝指標(biāo)對(duì)骨質(zhì)疏松癥的治療可能顯示出巨大而快速的反應(yīng)，這可能是最佳劑量和劑量頻率選擇[12]。在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的過程中，股骨骨密度的降低和股骨干骺端骨微結(jié)構(gòu)的破壞總是伴隨著包括ALP、BGP、TRACP-5b和DPD在內(nèi)的骨重塑標(biāo)志物的顯著變化[13]。TRACP-5b和DPD是骨吸收的典型標(biāo)志物，而ALP和BGP是廣泛使用的骨形成指標(biāo)[14]。麥角甾苷的治療可顯著降低OVX大鼠的ALP、BGP、TRACP-5b和DPD的水平，這表明麥角甾苷能顯著降低去卵巢大鼠提高的骨轉(zhuǎn)換速度。

骨骼的重建和重塑是一個(gè)復(fù)雜的生理過程，需要有破骨細(xì)胞的功能[15]。由于雌激素水平急劇下降，破骨細(xì)胞的活性和分化能力在絕經(jīng)后顯著增加[15]。RANKL及其受體RANK是破骨細(xì)胞祖細(xì)胞的兩個(gè)關(guān)鍵分化因子，能夠刺激破骨細(xì)胞分化，然后介導(dǎo)破骨細(xì)胞形成[16-17]。此外，RANKL與RANK的結(jié)合可激活多種下游信號(hào)通路，包括NF-κB和PI3K /AKT，以及一些轉(zhuǎn)錄因子，包括NFAT2和c-Fos[7]，從而刺激了破骨細(xì)胞的發(fā)展和破骨細(xì)胞生成。然而，除非募集了TNF-受體相關(guān)因子(TRAF)，并且下游信號(hào)級(jí)聯(lián)被轉(zhuǎn)導(dǎo)，否則RANK受體蛋白缺乏固有的酶活性，因此認(rèn)為TRAF6是主要的銜接子分子，可能對(duì)破骨細(xì)胞的功能和分化有用[18]。因此，RANKL/TRAF6/NF-κB信號(hào)通路認(rèn)為是解釋破骨細(xì)胞形成的重要機(jī)制。在本研究中，麥角甾苷降低了RANKL、TRAF6和NF-κB，導(dǎo)致PI3K/AKT被激活，最終，NFAT2的水平減少和c-Fos的表達(dá)增加。

綜上，麥角甾苷可能通過RANKL/TRAF6/NF-κB和PI3K/AKT信號(hào)通路介導(dǎo)對(duì)OVX大鼠骨量流失產(chǎn)生保護(hù)作用，但是本研究未進(jìn)一步進(jìn)行陽性對(duì)照實(shí)驗(yàn)和通路抑制和激活來證實(shí)其潛在的機(jī)制，后期會(huì)通過激動(dòng)劑和抑制劑研究觀察麥角甾苷對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖分化以及成骨和破骨細(xì)胞的影響。