李姣玉，邢玉薪，姚悅璠，劉開(kāi)創(chuàng)，康少博，楊 艷

（1.太原科技大學(xué) 化學(xué)與生物工程學(xué)院，山西 太原 030006；2.福建農(nóng)林大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350000；3.哈爾濱醫(yī)科大學(xué) 生命信息學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150000）

植物組織中總RNA 的提取是分子生物學(xué)研究的基本手段之一，基因獲得、cDNA 文庫(kù)、Northern 印跡、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控等現(xiàn)代生物技術(shù)手段均需以高質(zhì)量的RNA 為前提。目前的RNA提取方法有Trizol、CTAB法、SDS-酚等，但目前桑科植物總RNA 提取報(bào)道相對(duì)較少[1-2]。桑果中含有大量的花色素苷類物質(zhì)，該物質(zhì)具有防止UV、病原菌對(duì)植物產(chǎn)生傷害，調(diào)節(jié)生長(zhǎng)素在植物體內(nèi)的運(yùn)輸，消除動(dòng)植物細(xì)胞內(nèi)氧自由基、消炎、抗癌等多種功能[3]。

研究表明，類黃酮等花色素的生物合成途徑包含3 個(gè)階段。首先，苯丙氨酸脫氫酶（Phenylalanine dehydrogenase,PAL）催化苯丙氨酸為肉桂酸，經(jīng)肉桂酸-4-羥基化酶（Cinnamic acid 4 hydroxylase,C4H）、4-香豆酰輔酶A 連接酶（4-Coumarate coenzyme A ligase,4CL）催化，生成香豆酰輔酶A（P-Coumaroyl-CoA）；其次，查爾酮合成酶（Chalcone synthase,CHS）催化香豆酰輔酶A 和丙二酰輔酶A（Malonyl-CoA）生成柚皮素查爾酮，即查爾酮，查爾酮再經(jīng)查爾酮異構(gòu)酶（Chalcone isomerase,CHI）催化轉(zhuǎn)化成柚皮素；最后，黃烷酮3-羥化酶（Flavanone 3-hydroxylase,F3H）進(jìn)一步催化為二氫黃酮醇化合物，在二氫黃酮醇還原酶（Dihydroflavonol 4-reductase,DFR）、花青素合成酶（Anthocyanidin synthase,ANS）催化作用下，分別形成天竺葵素、矢車菊素和翠雀素等物質(zhì)。報(bào)道表明，CHS、CHI 和F3H 是花青素形成所必需，其抑制或過(guò)表達(dá)均會(huì)影響植物最終的花色及抗逆性狀態(tài)等[3]，見(jiàn)圖1。

圖1 花青素生物合成途徑Fig.1 The biosynthesis pathway of anthocyanins

本研究以桑葉及果實(shí)為試驗(yàn)材料，通過(guò)改進(jìn)和優(yōu)化的Trizol 法提取其RNA 并克隆桑葉MCHS基因或類似MCHS基因本研究以桑葉及果實(shí)為試驗(yàn)材料，并改進(jìn)優(yōu)化Trizol 法提取RNA 及克隆桑葉MCHS基因，其不僅有助于從分子水平研究桑科類黃酮代謝機(jī)制，還為研究MCHS的進(jìn)化、桑葚花青素提取、合成與鑒定等提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料及試驗(yàn)用品處理

樣品：新鮮桑葉及其果實(shí)。5 月底—7 月初，采集于太原科技大學(xué)南校區(qū)，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?，用于總RNA提取。

試驗(yàn)所用試劑均由滅菌的0.1%DEPC水配制；研缽、玻璃器皿等由0.1%DEPC 水處理24 h后，進(jìn)行20～30 min的高壓滅菌；氯仿、苯酚等藥品均為分析純；Trizol 試劑為上海生物工程有限公司產(chǎn)品；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）購(gòu)自寶生生物有限公司。

本試驗(yàn)所用PCR引物根據(jù)收錄于NCBI上的桑科CHE設(shè)計(jì)，NCBI 登錄號(hào)：KT630885，具體序列見(jiàn)表1，引物序列由北京華大基因有限公司合成。

表1 擴(kuò)增MCHS基因引物序列Tab.1 Primer of MCHS gene

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 Trizol法提取總RNA

取0.1 g新鮮樣品放入液氮預(yù)冷的研缽中，邊加液氮邊研磨，直至細(xì)粉狀為止；預(yù)先在離心管中加入1 mL Trizol 溶液，迅速將研磨好的細(xì)粉加入離心管中；立即用振蕩器振蕩2 min，隨后在室溫下振蕩10 min，靜止數(shù)秒后，放入冰箱冷藏，使溫度降為4℃，離心5 min，轉(zhuǎn)速為12 000 rpm；預(yù)先在新離心管中加入200 μL 氯仿，將上清液迅速轉(zhuǎn)移至離心管，立即振蕩2 min，隨后在室溫下振蕩5 min，靜置2 min后，放入冰箱冷藏，使溫度降為4 ℃，然后離心10 min，轉(zhuǎn)速為12 000 rpm；于新離心管中加入200 μL 氯仿，將上清液迅速轉(zhuǎn)移至離心管，快速振蕩15 s，放入冰箱冷藏，使溫度降為4℃，然后離心10 min，轉(zhuǎn)速為12 000 rpm；預(yù)先在新的離心管中加入500 μL異丙醇，將上清液迅速轉(zhuǎn)移至離心管，緩慢顛倒離心管；-80℃下沉淀1h；從冰柜中取出含有RNA 沉淀的離心管，在4℃的條件下離心10 min，轉(zhuǎn)速為12 000 rpm，小心棄上清；隨后加入1 mL 75%乙醇，振蕩器振蕩，在4℃下離心5 min，轉(zhuǎn)速為12 000 rpm，小心棄上清，短暫離心后用移液槍吸去剩余上清，超凈臺(tái)自然干燥2 min，加入16 μL DEPC 處理后重新溶解。

1.2.2 RT-PCR擴(kuò)增MCHS基因

使用Takara 公司的PrimeScript ?RT reagent Kit with g DNA Eraser 試劑盒，將所提取的桑葉總RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA并以該cDNA 為模板進(jìn)行PCR 檢測(cè)，PCR 引物為反應(yīng)體系為（20 μL）為：10×PCR buffer 4.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 2.0 μL，上游引物（10 μmol/L）2.0 μL，下游引物（10 μmol/L）2.0 μL，Taq DNA 聚合酶（5U/μL）0.5 μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μL，ddH2O 9 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min，95℃變性1 min，55℃退火30 s，72℃延伸1 min 20 s，30 個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存?zhèn)溆?。? μL 擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，觀察記錄結(jié)果。

1.3 總RNA的完整性及質(zhì)量檢測(cè)

1.3.1 電泳檢測(cè)

DEPC 水稀釋TAE 后，取2 μL 的RNA 樣品與1 μL 溴酚藍(lán)混合后進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳，電泳時(shí)間為30 min，電壓為100 V，在紫外凝膠成像系統(tǒng)上對(duì)RNA 條帶的清晰度和完整性進(jìn)行觀察，并拍照記錄。

1.3.2 RNA質(zhì)量檢測(cè)

參照奧斯伯等的方法，取10 μL總RNA溶液，加DEPC 水稀釋至1 mL，分別在230 nm、260 nm 和280 nm 處測(cè)量吸光值。并計(jì)算A260/A280、A260/A230的比值。

RNA產(chǎn)量（μg）=RNA濃度（μg/mL）×VDEPC－H2O（mL）

2 結(jié)果與討論

2.1 Trizol法提取的桑葉及果實(shí)中總RNA的質(zhì)量分析

見(jiàn)圖2，使用Trizol 法從桑葉及桑葚中均可以提取出總RNA，但通過(guò)電泳分析發(fā)現(xiàn)，在條帶完整性和強(qiáng)度上，從葉和果中獲得的RNA 存在差別。果實(shí)中因糖、酚含量較高，28 s和18 s 條帶較模糊，且無(wú)5.8 s，同時(shí)放置一周后，樣品組織中RNA大部分降解。

圖2 桑葉與桑果總RNA電泳檢測(cè)Fig.2 Electrophoresis for total RNA of mulberry leaves and mulberry

桑葉中提取的RNA 條帶完整，帶型較好，未發(fā)生明顯的降解，28 s 的亮度是18 s 的2 倍左右，并且5.8 s 亮度較弱，說(shuō)明該樣品的完整性良好。

2.2 Trizol法提取的總RNA純度和得率

從表2 可以看出，提取自桑葉中的RNA，其OD260 nm/OD280 nm 的值在1.8～2.0，可說(shuō)明未受蛋白質(zhì)或酚類污染；而提取自桑果中的RNA，其OD260 nm/OD280 nm 的值＜1.8，說(shuō)明受蛋白質(zhì)及其他有機(jī)物污染較明顯。在后續(xù)的RTPCR 試驗(yàn)中，使用無(wú)污染的桑葉RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄及MCHS基因擴(kuò)增。

表2 Trizol法提取的RNA的純度及得率Tab.2 Isolated RNA purity and yield by Trizol methods

2.3 桑葉MCHS基因的鑒定

以提取的桑葉總RNA 為模板進(jìn)行RT-PCR 檢測(cè)，引物是根據(jù)NCBI上已收錄的?？艭HE設(shè)計(jì)2對(duì)簡(jiǎn)并引物MCHS（1-393）、MCHS（36-393），其中MCHS（1-393）擴(kuò)增為查爾酮酶基因的全長(zhǎng)序列，MCHS（36-393）擴(kuò)增的為查爾酮酶的關(guān)鍵區(qū)域，RT-PCR 結(jié)果，見(jiàn)圖3。從桑葉RNA 中獲得的查爾酮合成酶基因全長(zhǎng)序列為1 200 bp 左右，關(guān)鍵區(qū)域序列為1 000 bp左右，序列大小與大多數(shù)物種CHS相似。

圖3 桑葉提取MCHS基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 MCHS by RT-PCR isolated from mulberry leaves

3 結(jié)論

山西桑屬資源豐富，研究報(bào)道表明，桑屬資源含有豐富的活性蛋白、維生素、氨基酸、胡蘿卜素、礦物質(zhì)等；同時(shí)桑果還具有補(bǔ)肝益腎、補(bǔ)血養(yǎng)顏等功效。以桑葉作為研究對(duì)象，對(duì)其細(xì)胞水平進(jìn)行深入研究，其結(jié)果對(duì)于山西省桑葚的種植、開(kāi)發(fā)與推廣具有重要實(shí)踐性意義。

在桑屬植物的類黃酮生物合成過(guò)程中，MCHS是第一關(guān)鍵酶，對(duì)其抑制或過(guò)表達(dá)將直接影響苯丙氨酸和丙二酰-CoA的結(jié)合，從而影響花色素合成、抗病性以及抗UV 性等。有研究表明，利用RNA 干擾技術(shù)使花素夏堇中的CHS 基因沉默，或矮牽牛CHS基因突變，均可獲得花色花粉不同的新品種[6]。

本研究以桑葚為試驗(yàn)材料，通過(guò)改進(jìn)和優(yōu)化的Trizol 法提取其RNA 并克隆桑葉MCHS基因，Trizol 法提取?？芌NA操作簡(jiǎn)單，結(jié)合氯仿、苯酚等提取試劑，提取時(shí)間為2～3 h。該方法具有可重復(fù)性強(qiáng)、提取RNA 完整性好等優(yōu)點(diǎn)，所提取RNA 可直接進(jìn)行后續(xù)的RT-PCR 反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)，不需要DNase消化，因此是植物RNA 的理想提取方法之一，該結(jié)果為分子水平上揭示花青素的形成機(jī)理奠定基礎(chǔ)。