楊麗萍，宋娜麗，陳 普，段小花＊＊

（1.云南中醫(yī)藥大學云南省傣醫(yī)藥與彝醫(yī)藥重點實驗室 昆明 650500；2.云南省中醫(yī)中藥研究院 昆明 650223）

腸道黏膜是機體防御的第一道防線，具有選擇通透性。完整的腸道屏障對維持上皮細胞通透性、機體內環(huán)境穩(wěn)態(tài)有關鍵作用。腸道屏障功能的破壞可引起腸上皮通透性升高，導致腸腔內細菌和內毒素等通過腸上皮進入機體造成炎癥反應，甚至可出現(xiàn)多器官功能衰竭[1]。腸屏障功能受多種細胞因子和細菌內毒素的調控，并且與多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關，如炎癥性腸道疾病、胰腺炎、肝病以及代謝紊亂性疾病等[2]。預防和治療腸黏膜屏障功能損傷已成為當前研究的重要課題之一[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，腸道屏障在炎癥性腸病的病理過程中起關鍵作用，腸黏膜屏障完整性的破壞是炎癥性腸病發(fā)生和發(fā)展的基本過程，由此引發(fā)的腸道對細菌、內毒素等的吸收增加從而導致機體異常免疫調節(jié)和炎癥反應，是病情進展的核心環(huán)節(jié)[5-6]。因此，保護腸屏障的完整性在一定程度上能夠抑制炎癥性腸病的病理進程，可作為改善炎癥性腸病臨床癥狀的潛在治療方法之一[7]。

地榆（Sanguisorbae Radix）為薔薇科植物地榆（Sanguisorba officinalis L.）或 長 葉 地 榆Sanguisorba officinalis L.var. longifolia (Bert). Yü et Li的干燥根，具有涼血止血、解毒斂瘡的功效，有“痔科圣藥”之稱，常用來治療直腸炎、潰瘍性結腸炎等腸道疾病。動物實驗發(fā)現(xiàn)，地榆對潰瘍性結腸炎大鼠模型作用顯著，其作用可能與抑制炎性細胞因子有關[8-9]，其單藥或復方在臨床中也常治療潰瘍性結腸炎等腸道相關疾病[10-13]。李麗等[14]研究發(fā)現(xiàn)，地榆可通過調節(jié)急性潰瘍性性結腸炎大鼠腸道菌群，修復腸道屏障而發(fā)揮治療作用。但更進一步的，地榆對腸道屏障的修復是否還與調節(jié)腸道緊密連結和細胞凋亡等有關，目前暫未發(fā)現(xiàn)相關報道。

基于此，本研究利用LPS建立體內外腸道屏障功能損傷模型，通過腸上皮細胞凋亡、緊密連結以及細胞炎癥因子等方面深入探討地榆對腸道屏障功能的作用，以期從腸道屏障的角度為地榆的臨床應用提供實驗基礎。

1 材料

1.1 動物和細胞株

昆明種小鼠SPF級72只，雌雄各半，體質量（20 ±2）g，購自四川省醫(yī)學科學院實驗動物研究所，生產(chǎn)許可證號：SCXK（川）2015-030；IEC-6細胞購自美國ATCC細胞庫。

1.2 主要試劑和儀器

DMEM高 糖 培 養(yǎng) 基（BI，貨 號 06-1055-57-1ACS）；胰蛋白酶（BI，貨號 03-050-1B）；胎牛血清（BI，貨號04-001-1A）；青霉素/鏈霉素（BI，貨號03-031-1B）；脂多糖 LPS（sigma，貨號 L2630-25MG）；occludin（proteintech，貨號 27260-1-AP）；Goat antirabbit secondary antibody（proteintech，貨號 SA00001-2）；IL-1β ELISA Kit（proteintech，貨 號 KE10003）；TNF-α ELISA Kit（proteintech，貨號 KE10002）；DLactate Assay Kit（abcam，貨號ab83429）；總RNA提取試劑盒（promega，貨號LS1040）；Eastep RT Master Mix(5X) 逆轉錄預混液（promega，貨號 LS2050）；Eastep qPCR Master Mix（2X）試劑盒（promega，貨號LS2062）；Annexin V/PI試劑盒（凱基生物，貨號KGA107）；二氧化碳培養(yǎng)箱（美國nuaire，NU-4750E）；酶標儀（美國Thermofisher，VariosKan Flash）；倒置顯微鏡（日本尼康）；流式細胞儀（德國CyFlow Cube6）；熒光定量PCR儀（美國ABI，7500）。

1.3 地榆醇提物的制備

地榆購自云南鴻翔一心堂藥業(yè)股份有限公司，經(jīng)鑒定為質量合格的中藥飲片。稱取地榆藥材1 kg，用10倍70%乙醇提取3次，每次1 h，合并3次提取液，濃縮至合適的體積后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2 方法

2.1 體外實驗

2.1.1 細胞培養(yǎng)和處理

IEC-6細胞以含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，等細胞融合至70%-80%進行傳代。0.25%胰酶消化處于對數(shù)生長期的細胞并接種于96孔板中，分為空白組、LPS組、LPS+地榆不同劑量組（35，70，140，280，560 μg生藥·mL-1），每組設6個重復，培養(yǎng)24 h后每組分別加入不同濃度的藥物，1 h后加入100 μg·mL-1的LPS，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后檢測相關指標。

2.1.2 MTT檢測細胞活力

IEC-6 細胞以 1 × 105cells·mL-1接種于 96 孔 板24 h后，換入無血清培養(yǎng)基，24 h細胞周期同步化后，分組并加入相應藥物及含血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進行MTT法檢測細胞存活率，以吸光度（OD）表示細胞相對活力。

2.1.3 免疫熒光檢測occludin蛋白的表達和分布

IEC-6細胞按1 × 104接種至6孔板培養(yǎng)過夜后更換培養(yǎng)基并加入地榆提取物，1 h后加LPS（100 μg·mL-1）繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后棄去培養(yǎng)基并用多聚甲醛固定，用0.1% Triton X 100透化并用羊血清封閉30 min，加一抗4℃過夜，PBS清洗后二抗37℃孵育30 min，封片并在熒光顯微鏡下觀察和拍照。Image J軟件進行平均光密度（AOD）分析。

2.1.4 ELISA檢測IL-1β和TNF-α水平

IEC-6細胞按1 × 105cells·mL-1）接種于96孔板并過夜，分組并給予相應藥物處理24 h后收集細胞上清液，3000 r·min-1離心20 min，收集上清液后按相應的ELISA試劑盒說明書用酶標儀檢測IL-1β和TNF-α的水平。

2.1.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡

IEC-6細胞按 1 × 105cells·mL-1接種于 6 孔板，藥物處理24 h后收集細胞，按照Annexin V/PI試劑盒說明書的步驟處理細胞并上流式細胞儀檢測細胞凋亡水平。

2.2 體內實驗

2.2.1 動物給藥和分組

昆明小鼠分為正常對照組、LPS組和地榆高、低劑量組，參考文獻建立小鼠腸道屏障損傷模型[15]，正常組和LPS灌胃給予蒸餾水，剩下兩組灌胃給予不同劑量的地榆（2.25，6.75 g·kg-1），在第7天灌胃結束2 h后，對除正常組外的其余組別小鼠一次性腹腔注射5 mg·kg-1的LPS，2 h后摘眼球取血分離血清檢測相關指標，另取結腸部分于液氮中保存?zhèn)溆?，另一部分?0%福爾馬林中固定用于后續(xù)組織病理學檢測。

2.2.2 ELISA檢測小鼠血清D-乳酸水平

取小鼠血清，按ELISA試劑盒說明書，用酶標儀檢測小鼠血清中D-乳酸水平，用來檢測腸道通透性。

2.2.3 Western Blot檢測occludin蛋白的表達

小鼠結腸用裂解液裂解后，BSA測蛋白濃度并調整濃度后采用SDS-PAGE凝膠電泳分離、轉膜并封閉后一抗孵育過夜，后用二抗孵育2 h，曝光檢測，以β-actin作為內參采用Image-J軟件對條帶進行量化分析。

2.2.4 RT-PCR檢測小鼠結腸TNF-α mRNA和IL-1β mRNA的表達

將已取好的結腸在液氮下研磨后提取總RNA，紫外和電泳檢測RNA純度及完整度，按逆轉錄試劑盒說明書完成逆轉錄，以生成的cDNA為模板進行PCR擴增，擴增程序為：95℃ 5 min，（ 95℃，15 s）× 40，60℃ 30 s。采用2-△△CT相對定量法計算各組結腸TNF-α mRNA和IL-1β mRNA的相對表達水平。引物序列見表1。

2.3 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad prim 5軟件進行數(shù)據(jù)分析，實驗數(shù)據(jù)用均值 ± 標準差（）表示，多組比較采用單因素方差分析，P＜ 0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 地榆對IEC-6細胞活力的影響

圖1結果顯示，地榆在35-560 μg·mL-1范圍內對正常IEC-6細胞活力無顯著影響，各組間無統(tǒng)計學差異（P＞ 0.05），說明地榆在這個劑量范圍內無明顯毒性。加入100μg·mL-1的LPS處理24 h后，可顯著抑制IEC-6細胞活力，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.01），不同濃度地榆預孵育能減弱LPS對IEC-6細胞活力的抑制效應，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05），說明地榆對LPS誘導的IEC-6細胞損傷具有保護作用。

3.2 地榆對LPS導致的IEC-6細胞凋亡的影響（晚期Q2+早期Q3，%）

流式細胞術結果表明，和對照組相比，LPS刺激組細胞早凋和晚凋細胞數(shù)量明顯增加，細胞凋亡率明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.01），地榆預處理后可以明顯減少LPS導致的細胞凋亡增加（P＜ 0.05）（見圖2）。

3.3 地榆對IEC-6細胞緊密連接蛋白occludin表達的影響

圖3免疫熒光結果表明，正常IEC-6細胞occludin蛋白主要分布在細胞膜，呈蜂巢狀線性分布，在細胞周圍形成環(huán)狀結構。LPS處理后細胞膜上occludin的環(huán)狀結構出現(xiàn)斷裂，熒光信號較弱。地榆預處理后occludin在細胞膜上的熒光信號相對LPS組明顯增強，且未出現(xiàn)明顯斷裂。

表1 RT-PCR引物序列

圖1 地榆對IEC-6細胞活力的影響

圖2 地榆對LPS誘導的IEC-6細胞凋亡的影響

圖3 地榆對LPS誘導的IEC-6細胞occludin緊密連接蛋白表達的影響（400X）

圖4 地榆對小鼠血清D-乳酸水平的影響

3.4 地榆對LPS導致的小鼠腸道屏障通透性的影響

圖4顯示，腹腔注射LPS后，小鼠血中D-乳酸水平明顯升高，說明腸道黏膜損傷后引起腸道通透性增加（P＜ 0.01），地榆在6.75 g·kg-1劑量下能顯著減少小鼠血清中D-乳酸的水平（P＜ 0.05），表明地榆有利于LPS導致的小鼠腸道屏障完整性和通透性的改善。

3.5 地榆對小鼠結腸組織中緊密連接蛋白occludin表達的影響

與正常組比較，LPS組小鼠結腸occludin蛋白表達水平顯著降低（P＜ 0.01），與LPS組比較，地榆高劑量組結腸的occludin表達顯著升高（P＜ 0.01）。見圖5。

3.6 地榆對LPS導致的炎癥因子水平的影響

圖5 地榆對小鼠結腸組織occludin表達水平的影響

圖6 地榆對IL-1β和TNF-α的影響

從圖6可知，LPS組細胞上清液中IL-1β和TNF-α水平顯著增加（P＜ 0.01），地榆預處理后能夠明顯抑制LPS導致的IL-1β和TNF-α水平增高（P＜ 0.05），表明地榆能夠緩解LPS刺激導致的炎癥因子的釋放增加。RT-PCR檢測結果表明，地榆能顯著抑制LPS誘導后小鼠結腸中IL-1β和TNF-α的mRNA表達增加（P＜ 0.05），和體外實驗結果一致。

4 討論

腸道作為抵御各種病原體和抗原入侵的屏障，是由完整的腸上皮細胞和相鄰細胞間的緊密連接及粘液層構成，腸道內的細菌、炎性物質、內毒素以及上皮細胞凋亡都會影響腸屏障功能[16]。當遭受損傷時，腸道內細菌通過受損部位進入血液循環(huán)，引起一系列炎癥反應加重腸黏膜屏障損傷，導致腸道通透性升高，引起腸道細菌移位和促炎因子大量釋放，進一步破壞腸黏膜屏障的完整性，導致全身炎癥反應，從而加重原發(fā)疾病，甚至誘發(fā)多器官功能紊亂和衰竭[17]。LPS是革蘭氏陰性菌內毒素，研究表明，LPS可刺激巨噬細胞和中性粒細胞釋放炎癥介質，損傷腸上皮緊密連接，誘導細胞凋亡發(fā)生，增加腸道通透性，誘發(fā)炎癥反應導致腸道屏障功能障礙[18-19]。當屏障結構受到損傷時，引起腸道內細菌、內毒素等病原體穿過腸屏障入侵機體，引起機體的炎癥反應等，從而危害機體健康。腸黏膜屏障在防止細菌和內毒素易位方面起著至關重要的作用[20]。

小腸隱窩上皮細胞在腸道細胞中是一種重要的功能性細胞，腸道黏膜損傷后主要依靠隱窩上皮細胞的不斷增殖、分化來完成修復，以重建腸道的屏障功能，是對抗腸道細菌、毒素的第一道防線[21]。IEC-6細胞來源于大鼠小腸隱窩細胞，廣泛用于腸屏障修復相關的研究[22]。研究報道LPS可抑制IEC-6細胞增殖[23-24]，本文結果和文獻報道一致，LPS在100 mg·mL-1濃度下能夠明顯抑制IEC-6細胞的活力，而地榆能夠明顯抑制LPS導致的IEC-6細胞毒效應，且在該有效濃度內對無明顯毒性。研究表明，上皮細胞凋亡增加是腸道屏障功能障礙的原因之一[25]，腸炎患者腸上皮細胞的凋亡速率增加，細胞凋亡后所留下的空隙不能被及時有效的填充，導致腸上皮細胞屏障連續(xù)完整性破壞，腸道通透性增加，細菌和內毒素等物質可通過腸道入血，刺激炎性細胞因子的過度釋放[26]。本研究中細胞凋亡檢測結果顯示LPS可以誘導IEC-6腸上皮細胞的凋亡，地榆則可顯著降低LPS引起的細胞凋亡率，可能是保護炎癥環(huán)境下腸屏障功能的機制之一。

腸道緊密連接是一種腸黏膜上皮細胞間特殊的結構，由不同功能的蛋白質（occludin、ZO-1等）組成并包繞在細胞腔側端，在維持腸上皮細胞通透性中起著極其重要的作用，它能夠選擇性的允許離子和小分子物質通過，阻止腸腔內病原微生物進入體內，緊密連接蛋白受損會引起腸道通透性改變[27-28]。D-乳酸是細菌發(fā)酵的代謝產(chǎn)物，在腸道黏膜屏障完整時不會進入血液循環(huán)，一旦腸道屏障受損，通透性增加，腸道大量D-乳酸會進入血液中，檢測D-乳酸可以有效反映腸黏膜損害程度和腸道通透性的變化[29]。因此，D-乳酸被認為是腸黏膜損害和通透性增加的有效預警指標[30-31]。在LPS導致的小鼠腸道屏障損傷模型中，LPS組小鼠血清中D-乳酸顯著高于正常組，提示LPS引起腸道屏障受損，導致腸道通透性增加。地榆可顯著降低LPS導致的小鼠血清D-乳酸水平，結腸HE染色發(fā)現(xiàn)地榆對LPS導致的結腸病理損傷具有一定的改善作用。免疫熒光結果發(fā)現(xiàn)，LPS可引起IEC-6細胞緊密連接蛋白occludin表達和分布異常，而地榆預處理后可見occludin的表達明顯增強。結果提示，地榆可以維持和保護LPS導致的腸道屏障功能受損。

細胞炎癥因子在腸屏障功能損傷病變中具有非常重要的作用，參與了各類炎癥反應的發(fā)生過程[32]。腸屏障受損時，腸腔內抗原分子移位并激活免疫細胞，產(chǎn)生大量炎性細胞因子，如IL-1β和TNF-α等，這些因子通過炎性反應調節(jié)緊密連接蛋白的表達，增加腸上皮屏障通透性，加劇腸屏障的損傷，導致惡性循環(huán)[33]。TNF-α為早期單核或巨噬細胞合成并釋放的炎性因子，在炎癥反應中主導激活細胞因子級聯(lián)反應，啟動其他一系列細胞因子的產(chǎn)生和釋放，使炎癥介質大量過度釋放。研究表明，TNF-α是引起腸道屏障損傷的重要啟動因子，它不僅可以通過破壞緊密連接蛋白使腸道通透性增加，而且還會誘導IL-1β和IL-6等細胞因子分泌，推動炎癥級聯(lián)反應，進一步加劇緊密連接的損傷[34-36]。IL-1β為單核細胞和巨噬細胞產(chǎn)生的高效促炎細胞因子，研究認為與腸道炎癥的發(fā)展有關。在感染、粘膜損傷和壓力的作用下，巨噬細胞能夠釋放IL-1β，進而刺激T細胞增殖并觸發(fā)粘膜免疫反應，從而促進TNF-α表達的上調[37]。研究報道IL-1β還可通過激活腸上皮細胞NF-κB通路，增加腸道通透性，降低緊密連接蛋白的表達[38]。既往研究表明，地榆可以抑制潰瘍性結腸炎大鼠血清IL-1β和腸組織中NF-κB表達，升高IL-10水平[8]。本文研究結果顯示，LPS刺激后的IEC-6細胞以及小鼠均出現(xiàn)TNF-α和IL-1β表達顯著上升的現(xiàn)象，地榆可以顯著抑制LPS刺激導致的炎癥細胞因子釋放增加，提示地榆對腸道屏障功能的保護作用與減輕炎癥有關。

綜上所述，地榆可抑制炎癥細胞因子釋放和腸上皮細胞凋亡，促進緊密連接恢復，改善腸道通透性，從而維持和保護腸道屏障功能。通過研究結果，可推測地榆對腸道屏障的保護作用可能和其抗炎作用和抑制凋亡有關。

以往研究顯示地榆可以通過改善潰瘍性結腸炎模型大鼠的腸道菌群組成而修復腸黏膜屏障[14]，本實驗進一步深入探討了地榆對腸道物理屏障關鍵指標的影響，為地榆在臨床中治療腸道相關疾病提供了實驗證據(jù)。

近年研究結果顯示，腸道屏障功能損傷除了和腸道相關疾病有關外，更和糖尿病、肝病、精神疾病等息息相關[39]。在后續(xù)的研究中，我們將對對地榆保護腸道屏障的作用組分或成分做進一步的研究和探索，并對其中相關機制進行深入研究，為保護腸道屏障功能的藥物研發(fā)提供一定參考。